Name: serial block-face scanning electron microscopy (sbem) for the study of dendritic spines
Uploaded: 2021-10-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines at JoVE.com

SBEM 이미징, 가벼운 현미경 이미징 및 전자 현미경 샘플 제제는 Ncki 실험 생물학 연구소의 이미징 코어 시설로 작용하는 이미징 조직 및 기능 실험실의 장비를 사용하여 수행되었습니다.
도 1의 준비를 위해, 마우스(Souris_02)의 이미지와 https://smart.servier.com/ 바이알이 사용되었다.
이 작품은 국립 과학 센터 (폴란드) 그랜트 오푸스 (UMO-2018/31/B /NZ4/01603)에 의해 지원되었다 KR에 수여.

이 연구는 Nencki 연구소 지침 및 지역 윤리위원회의 허가에 따라 수행되었습니다. 이 연구는 1986년 11월 24일 유럽 공동체 협의회 지침(86/609/EEC), 폴란드 동물 보호법 및 바르샤바 최초의 지역 윤리 위원회의 승인을 받아 수행되었습니다. 사용된 동물의 수와 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.
주의: 아래에 설명된 모든 절차는 실험실 연기 후드에서 수행해야 합...

<ol>
	<li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+dendritic+spines.">Structural plasticity dendritic spines.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).</li><li>Borczyk, M., Radwanska, K., Giese, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+ultrastructural+analysis+of+memory.">The importance of ultrastructural analysis of memory.</a> Brain Research Bulletin. 173, 28-36 (2021).</li><li>Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+of+microtome-based+serial+block-face+scanning+electron+microscopy+in+neuroscience:+challenges+of+SBEM+in+neuroscience.">Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience: challenges of SBEM in neuroscience.</a> Journal of Microscopy. 259 (2), 137-142 (2015).</li><li>&#346;liwi&#324;ska, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Memory+Upscales+Volume+of+Postsynaptic+Densities+in+the+Process+that+Requires+Autophosphorylation+of+&#945;CaMKII.">Long-term Memory Upscales Volume of Postsynaptic Densities in the Process that Requires Autophosphorylation of &#945;CaMKII.</a> Cerebral Cortex. 30 (4), 2573-2585 (2020).</li><li>Borczyk, M., &#346;liwi&#324;ska, M. A., Caly, A., Bernas, T., Radwanska, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+affects+correlation+between+the+size+of+dendritic+spine+and+its+postsynaptic+density.">Neuronal plasticity affects correlation between the size of dendritic spine and its postsynaptic density.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1693 (2019).</li><li>Leighton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEM+images+of+block+faces,+cut+by+a+miniature+microtome+within+the+SEM+-+a+technical+note.">SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note.</a> Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+Block-Face+Scanning+Electron+Microscopy+to+Reconstruct+Three-Dimensional+Tissue+Nanostructure.">Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).</li><li>Smith, D., Starborg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block+face+scanning+electron+microscopy+in+cell+biology:+Applications+and+technology.">Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology.</a> Tissue and Cell. 57, 111-122 (2019).</li><li>Titze, B., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+scanning+electron+microscopy+for+imaging+biological+ultrastructure:+Volume+scanning+electron+microscopy.">Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure: Volume scanning electron microscopy.</a> Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).</li><li>Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , 6-8 (2010).</li><li>Willingham, M. C., Rutherford, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+osmium-thiocarbohydrazide-osmium+(OTO)+and+ferrocyanide-reduced+osmium+methods+to+enhance+membrane+contrast+and+preservation+in+cultured+cells.">The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP.">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2004).</li><li>Walton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lead+aspartate,+an+en+bloc+contrast+stain+particularly+useful+for+ultrastructural+enzymology.">Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).</li><li>Mercer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+scheme+for+section+staining+in+electron+microscopy.">a scheme for section staining in electron microscopy.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 81 (3-4), 179-186 (1963).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+Image+Browser:+A+Platform+for+Segmentation+and+Analysis+of+Multidimensional+Datasets.">Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets.</a> PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).</li><li>Fiala, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruct:+a+free+editor+for+serial+section+microscopy.">Reconstruct: a free editor for serial section microscopy.</a> Journal of Microscopy. 218 (1), 52-61 (2005).</li><li>Roels, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interactive+ImageJ+plugin+for+semi-automated+image+denoising+in+electron+microscopy.">An interactive ImageJ plugin for semi-automated image denoising in electron microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 771 (2020).</li><li>Radwanska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+for+long-term+memory+formation+when+synaptic+strengthening+is+impaired.">Mechanism for long-term memory formation when synaptic strengthening is impaired.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (45), 18471-18475 (2011).</li><li>Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block+face+scanning+electron+microscopy+and+the+reconstruction+of+plant+cell+membrane+systems:+SBFSEM+Methods+for+Plant+Cells.">Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems: SBFSEM Methods for Plant Cells.</a> Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).</li><li>Fendrych, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+Cell+Death+Controlled+by+ANAC033/SOMBRERO+Determines+Root+Cap+Organ+Size+in+Arabidopsis.">Programmed Cell Death Controlled by ANAC033/SOMBRERO Determines Root Cap Organ Size in Arabidopsis.</a> Current Biology. 24 (9), 931-940 (2014).</li><li>Russell, M. R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+correlative+light+and+electron+microscopy+of+cultured+cells+using+serial+blockface+scanning+electron+microscopy.">3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy.</a> Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).</li><li>P&#322;achno, B. J., &#346;wi&#261;tek, P., Jobson, R. W., Ma&#322;ota, K., Brutkowski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block+face+SEM+visualization+of+unusual+plant+nuclear+tubular+extensions+in+a+carnivorous+plant+(Utricularia,+Lentibulariaceae).">Serial block face SEM visualization of unusual plant nuclear tubular extensions in a carnivorous plant (Utricularia, Lentibulariaceae).</a> Annals of Botany. 120 (5), 673-680 (2017).</li><li>Genoud, C., Titze, B., Graff-Meyer, A., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Homogeneous+En+Bloc+Staining+of+Large+Tissue+Samples+for+Volume+Electron+Microscopy.">Fast Homogeneous En Bloc Staining of Large Tissue Samples for Volume Electron Microscopy.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, (2018).</li><li>Puhka, M., Joensuu, M., Vihinen, H., Belevich, I., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+sheet-to-tubule+transformation+is+a+general+mechanism+for+endoplasmic+reticulum+partitioning+in+dividing+mammalian+cells.">Progressive sheet-to-tubule transformation is a general mechanism for endoplasmic reticulum partitioning in dividing mammalian cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2424-2432 (2012).</li><li>Gluenz, E., Wheeler, R. J., Hughes, L., Vaughan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+and+three-dimensional+electron+microscopy+methods+for+the+study+of+Trypanosoma+brucei+and+Leishmania+mexicana+flagella.">Scanning and three-dimensional electron microscopy methods for the study of Trypanosoma brucei and Leishmania mexicana flagella.</a> Methods in Cell Biology. 127, 509-542 (2015).</li><li>Starborg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+transmission+electron+microscopy+and+3View+to+determine+collagen+fibril+size+and+three-dimensional+organization.">Using transmission electron microscopy and 3View to determine collagen fibril size and three-dimensional organization.</a> Nature Protocols. 8 (7), 1433-1448 (2013).</li><li>Hughes, L., Borrett, S., Towers, K., Starborg, T., Vaughan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+organelle+ontogeny+through+a+cell+cycle+revealed+by+whole-cell+reconstructions+using+3D+electron+microscopy.">Patterns of organelle ontogeny through a cell cycle revealed by whole-cell reconstructions using 3D electron microscopy.</a> Journal of Cell Science. 130 (3), 637-647 (2017).</li><li>Bojko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Autophagic+Flux+in+Escapers+from+Doxorubicin-Induced+Senescence/Polyploidy+of+Breast+Cancer+Cells.">Improved Autophagic Flux in Escapers from Doxorubicin-Induced Senescence/Polyploidy of Breast Cancer Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6084 (2020).</li><li>Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+preparing+GFP-labeled+neurons+previously+imaged+in+vivo+and+in+slice+preparations+for+light+and+electron+microscopic+analysis.">A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1145-1156 (2009).</li><li>Glauert, A. M., Lewis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological specimen preparation for transmission electron microscopy. , (2014).</li><li>Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Synapse+Formation+in+the+Adult+Somatosensory+Cortex+of+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Heterozygote+Mice.">Altered Synapse Formation in the Adult Somatosensory Cortex of Brain-Derived Neurotrophic Factor Heterozygote Mice.</a> Journal of Neuroscience. 24 (10), 2394-2400 (2004).</li></ol>

2010 년10에서Deerinck에 의해 설명 된 기본 NCMIR 방법의 많은 변형이 있습니다. 기본 원칙은 동일하게 유지되지만 연구된 자료유형에 따라 약간의 변화가 구현됩니다. 이전에는 상이한 수지가 SBEM용 시편을 포함시키는 데 사용될 수 있으며, 예를 들어 식물의 경우, Spurr's는세포벽(22,23)을통해 더 나은 침투를 허용하는 낮은 점도로 인해 선?...

중추 신경계의 흥분 시냅스의 대부분은 수지상 척추에 위치합니다 - 신경 막의 작은 돌출. 이러한 돌출은 세포내 신호 변환을 제어하는 제한된 생화학 적 구획을 형성합니다. 수지상 척추 및 시냅스의 구조적 가소성은 학습 및 메모리1,2와 같은 중요한 과정의 기초가 되는 시냅스 효능의 기능적 변화와 밀접한 관련이있다. 전자 현미경 검사법(EM)은 수지상 척추에 사전 시냅스 입력이 있는지 확인할 수 있는 유일한 기술입니다. EM 해상도는 또한 시냅스의 포스트냅스 부분 또는 수지상 척추의 치수를 나타내는 포스트 냅스 밀도(PSD)의 모양과 같은 초구조적 세부 사항뿐만 아니라 축삭 부톤의 크기와 모양을 연구하는 데 필요합니다. 또한 EM을 사용하면 시냅스와 주변 환경을 시각화할 수 있습니다.
이미징 및 컴퓨팅 기술의 발전 덕분에 전체 신경 회로를 재구성할 수 있습니다. 직렬 단면 투과 전자 현미경 검사법(ssTEM), 직렬 블록-페이스 스캐닝 전자 현미경검사(SBEM), 및 집중이온 빔 스캐닝 전자 현미경검사법(FIB-SEM)과 같은 부피 전자 현미경 기술은 일반적으로 뉴런 회로 재구성3에사용된다.
우리의 연구에서, SBEM 방법은 마우스 해마와 조직 뇌 슬라이스 4,5의샘플에서 수지상 척추와 PSDs의 구조적 가소성을 조사하기 위해 성공적으로 채택된다. SBEM은 스캐닝 전자 현미경 챔버6,7,8,9내부에 소형 초미세토메를 설치하는 것을 기반으로 한다. 샘플 블록의 상단은 이미지화되고, 샘플은 초미세토메에 의해 지정된 깊이로 절단되어 새로운 블록 면을 드러내며, 이는 다시이미지화된 다음 프로세스가 8반복된다. 그 결과, 절단된 슬라이스가 파편으로 손실되는 동안 블록 페이스의 이미지만 남게 됩니다. 그렇기 때문에 SBEM은 파괴적인 기술이라고 불리며, 이는 동일한 장소를 다시 이미지화할 수 없다는 것을 의미합니다. 그러나, 파괴적인 온블록 방법의 장점은 데이터 품질 및 데이터 분석3에크게 영향을 미칠 수 있는 뒤틀기 문제 및 절제손실로 인해 손해를 입지 않는다는 것이다. 또한, SBEM은 고해상도3에서상대적으로 넓은 시야(> 0.5mm × 0.5mm)를 이미지화할 수 있는 가능성을 제공한다.
SBEM을 사용하려면 이미지를 획득하는 데 사용되는 백산전자 검출기로 인해 전담적이고 대조적인 프로토콜에 따라 샘플을 준비해야 합니다. 1980년대8,11에서개발된 소슘-티오카르보히드라지데-오스뮴(rOTO) 얼룩을 사용하여 Deerinck10(국립 현미경 및 이미징 연구 센터(NCMIR) 방법에 의해 개발된 절차에 따라 시료 준비를 수행하는 방법을 여기에서 보여 준다. 또한 가벼운 현미경 검사법과 SBEM을 사용하여 면역 형광 연구에 동일한 뇌를 사용할 수있는 가벼운 고정 관류와 함께 2 단계 고정 접근 법을 소개합니다.
프로토콜에서 마우스 뇌는 주로 가벼운 고정제로 고정된 다음 반구로 절단한 다음, 한 반구는 면역 형광(IF)을 위해 포스트 고정 및 준비되고, 다른 하나는 EM 연구를 위한반면(그림 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62712/62712fig01.jpg"> 그림 1. SBEM을 통해 분석을 위한 수지상 척추 준비에 대한 워크플로우의 회로도 표현. 마우스는 희생되고 온화한 1 차 고정으로 perfused되었습니다. 뇌는 반으로 절단되었고, 한 반구는 면역 형광 (IF)전용 고정, 냉동 보호, 극저온을 사용하여 슬라이스하고 IF 연구를 위해 처리되었으며, 다른 반구는 EM 고정으로 후징되고 진동체로 슬라이스되어 EM 연구를 준비했습니다. SBEM 연구를 위한 뇌 슬라이스는 대조되고, 수지에 평평한 내장, 해마의 CA1 부위가 핀에 장착되고, SBEM(도1)으로이미지되었다. 노란색 상자에 강조 표시된 프로토콜의 일부가 비디오에 등장했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62712/62712fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthetic:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine/xylazine mixture (Ketamina/Sedazin)</td>
			<td>Biowet Pulawy, Pulawy, Poland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital (Morbital)</td>
			<td>Biowet Pulawy, Pulawy, Poland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixatives:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (GA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>G5882</td>
			<td>Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>POCH, Gliwice, Poland</td>
			<td>575283115</td>
			<td>pure p.a.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>441244</td>
			<td>prilled, 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td>tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>S5881</td>
			<td>reagent grade, <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png" />98%, pellets (anhydrous)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>14519-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-spatula (double 2&#34; flat ends, one rounded, one tapered to 1/8&#34;)</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle tip, 15 GA, blunt (perfusion needle)</td>
			<td>KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, Germany</td>
			<td>KD-FINE 900413</td>
			<td>1.80 x 40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pair of fine (Graefe) tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>11050-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Lead Fluid</td>
			<td>BQ80S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic vials</td>
			<td>Profilab, Warsaw, Poland</td>
			<td>534.02</td>
			<td>plastic vials with blue cap for tissue storage, 20 ml, 31 x 48 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight iris scissors (~9 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain slices preparation for EM:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>NEST, Rahway, NJ, USA</td>
			<td>712001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylic glue</td>
			<td>Fenedur, Montevideo, Uruguay</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>72632</td>
			<td>20 ml Scintillation Vial, a pack of 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>612-4545</td>
			<td>LDPE, disposable, 7.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Wilkinson Sword, London, UK</td>
			<td></td>
			<td>Classic double edge safety razor blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td>
			<td>No. 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>Leica VT1000 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain slices preparation for IF:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>NEST, Rahway, NJ, USA</td>
			<td>701101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criostat</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>Leica CM 1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>Bioshop, Burlington, Canada</td>
			<td>ETH001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-profile disposable blade 819</td>
			<td>Leica Biosystems Inc., USA</td>
			<td>14035838925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td>
			<td>No. 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide (NaN3)</td>
			<td>POCH, Gliwice, Poland</td>
			<td>792770426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>POCH, Gliwice, Poland</td>
			<td>772090110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue freezing medium for cryosectioning, OCT-Compound</td>
			<td>Leica Biosystems, Switzerland</td>
			<td>14020108926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>NEST, Rahway, NJ, USA</td>
			<td>702001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Post Synaptic Density Protein 95 Antibody</td>
			<td>Merck-Millipore, Burlington, MA, USA</td>
			<td>MAB1598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Zeiss Spinning Disc microscope (63 &#215; oil objective, NA 1.4, pixel size 0.13 &#181;m &#215; 0.13 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slide</td>
			<td>Menzel Glaser, Braunschweig, Germany</td>
			<td>B-1231</td>
			<td>24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>A31570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>AGAA00008</td>
			<td>SuperFrost</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>JWElectronic, Warsaw, Poland</td>
			<td>KL-942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonT X-100 Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop, Burlington, Canada</td>
			<td>TRX506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron microsocpy sample preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td>
			<td>POCH, Gliwice, Poland</td>
			<td>746980113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar 33C Film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>50425</td>
			<td>Fluoropolymer Film embedding sheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30, 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>T58203</td>
			<td>Epoxy embedding medium accelerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM single component A, M</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>44611</td>
			<td>Durcupan ACM single component A, M epoxy resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM single component B</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>44612</td>
			<td>Durcupan ACM single component B, hardener 964</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM single component D</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>44614</td>
			<td>Durcupan ACM single component D , plasticizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol absolute</td>
			<td>POCH, Gliwice, Poland</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td>Ethyl alcohol absolute 99.8 % pure P.A.-BASIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genlab laboratory oven</td>
			<td>Wolflabs, York, UK</td>
			<td>Mino/18/SS</td>
			<td>Oven Genlab MINO/18/SS 18l volume, no fan circulation, no digital display, standard temperature gradient, standard recovery rate, no timer, 250&#176;C maximum temperature, 240V electrical supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>A-9256</td>
			<td>reagent grade, <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png" />98% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead (II) nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>467790</td>
			<td><img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png" />99.95% trace metals basis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>75632</td>
			<td>for electron microscopy, 4% in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Elmetron, Zabrze, Poland</td>
			<td>CP-5-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>BioSan, J&#243;zef&#243;w, Poland</td>
			<td>Multi Bio RS-24</td>
			<td>rotator Multi Bio RS-24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>S5881</td>
			<td>reagent grade, <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png" />98%, pellets (anhydrous)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunflower mini shaker</td>
			<td>Grant bio, Shepreth,UK</td>
			<td>PD-3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Millipore, Burlington, MA, USA</td>
			<td>SLGP033NB</td>
			<td>0,22 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>88535</td>
			<td>purum p.a., for electron microscopy, <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png" />99.0% (N)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Serva, Heidelberg, Germany</td>
			<td>77870</td>
			<td>Uranyl acetate&#183;2H2O, research grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>WSL, Swietochlowice, Poland</td>
			<td>LWT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen mounting for SBEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>734-2782</td>
			<td>96-well plates, round bottom, non treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AM Gatan 3View stub handling tweezers</td>
			<td>Micro to Nano, Haarlem, Netherlands 
			Netherlands</td>
			<td>50-001521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular</td>
			<td>OPTA-TECH, Warsaw, Poland</td>
			<td>X2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive glue</td>
			<td>Chemtronics, Georgia, USA</td>
			<td>CW2400</td>
			<td>conductive eopxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatan 3View sample pin stubs</td>
			<td>Micro to Nano, Haarlem, Netherlands 
			Netherlands</td>
			<td>10-006003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td>
			<td>P7793</td>
			<td>roll size 20&#160;in. &#215; 50&#160;ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco conductive silver paint</td>
			<td>Ted Pella, Redding, CA, USA</td>
			<td>16062-15</td>
			<td>PELCO&#174;&#160;Conductive Silver Paint, 15g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades double edge</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>72000</td>
			<td>Stainless Steel &#34;PTFE&#34; coated. PERSONNA brand .004&#34; thick, wrapped individually, 250 blades in a box.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Sigma VP with Gatan 3View2 chamber, acceleration voltage 2.5 kV, variable pressure 5 Pa, aperture 20 &#181;m, dwell time 6 &#181;s, slice thickness 60 nm, magnification 15 000 x, image resolution 2048 x 2048 pixels, pixel size 7.3 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trim 90&#176; diamond knife</td>
			<td>Diatome Ltd., Nidau, Switzerland</td>
			<td>DTB90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>Leica ultracutR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>webpage</td>
			<td></td>
			<td>tutorials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FijiJ</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Image Browser</td>
			<td>http://mib.helsinki.fi/</td>
			<td></td>
			<td>http://mib.helsinki.fi/tutorials.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reconstruct</td>
			<td>https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0</td>
			<td></td>
			<td>https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Adult 3-month old and&#160;20&#177;1&#160;month old&#160;female&#160;Thy1-GFP(M) mice (Thy1-GFP +/-) (Feng et al.,2000) which express GFP in a sparsely distributed population of glutamatergic neurons. Animals were bred as heterozygotes with the C57BL/6J background in the Animal House of the Nencki Institute of Experimental Biology.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

serial block-face scanning electron microscopy (sbem) for the study of dendritic spines

3차원 전자 현미경 검사법(3D EM)은 나노 스케일 분해능을 사용하여 수지상 척추의 형태학적 파라미터를 분석할 수 있는 가능성을 제공합니다. 또한, 척추 및 시냅스 후 밀도(PSD)의 부피(시냅스 후 부분, 시냅스 후 부분), 프리시냅틱 단말의 존재, 부드러운 내시경 망상 또는 비정형 형태의 PSD(예를 들어, 다중 내압 스핀)와 같은 수지상 척추의 일부 특징은 EM3D로만 관찰될 수 있다. 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBEM)를 채용함으로써 기존의 직렬 단면을 수행할 때보다 3D EM 데이터를 보다 쉽고 재현 가능한 방식으로 얻을 수 있다. 여기서 우리는 SBEM 분석을 위한 마우스 해마 견본을 준비하는 방법 및 이 프로토콜이 수지상 척추의 면역 형광 연구 결과와 어떻게 결합될 수 있는지 보여줍니다. 온화한 고정 관류는 우리가 두뇌의 반에 가벼운 현미경 검사법을 가진 면역 형광 연구를 능력을 발휘할 수 있게 하고, 나머지 반은 SBEM을 위해 준비되었습니다. 이 접근은 연구 결과에 사용될 동물의 수를 감소시킵니다.

상기 높은 대비를 기재한 방법을 이용하여 마우스 뇌 조직의 좋은 해상도 이미지를 얻을 수 있다. SBEM 기술이 제공하는 넓은 시야는 관심 영역을 정확하게 선택할 수 있도록 합니다. 해마의 CA1 영역의 큰 이미지는 층 라디툼(SR)(도 2A)의 길이를 측정하고, 중앙(도2B)에서정밀하게 이미징을 설정하도록 촬영하였다. 다음으로, 이미지의 스택을 획득?...

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Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBEM)는 뮤린 해마의 수지상 척추를 이미지 및 분석하기 위해 적용된다.

수지상 척추 연구를 위한 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBEM)

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...

두뇌에 있는 각 신경은 대략 7, 000 시냅스에 의해 그밖 신경 세포와 연결됩니다. 포유류 뇌의 시냅스는 주로 수지상 척추라고 불리는 막의 작은 돌출에 위치한다는 것을 제외하십시오. 시냅스와 수지상 척추 등의 가소성, 학습 및 기억 과정과 같은 중요한 뇌 기능.전자 현미경 검사법만 수지상 척추에 포스트냅틱 입력이 있는지 여부에 대한 완전한 통찰력을 제공한다는 점에 유의해야 합니다. 수지상 척추 이미징에 대한 다양한 기술을 사용할 수 있습니다. 그러나, 직렬 블록 얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사는 고해상도로 많은 양의 조직을 이미지할 수 있는 독특한 가능성을 제공합니다.직렬 블록 기반 스캐닝 전자 현미경 기술은 중금속과 강한 대조를 포함하는 샘플 준비의 특별한 프로토콜을 필요로한다. 관류 동안 내 기본 고정은 우리가 번개 전자 현미경 검사에 동일한 뇌를 사용할 수 있었습니다. 마우스는 희생되고 온화한 1 차 고정으로 perfused되었습니다.뇌는 반으로 절단되었고 한 반구는 면역 형광 전용 고정, 냉동 보호제로 고정되었고, 극저온을 사용하여 슬라이스하고 면역 형광 연구를 위해 처리되었습니다. 다른 반구가 전자 현미경 고정제로 고정되어 진동으로 슬라이스하고 전자 현미경 연구를 위해 준비된 곳. 직렬 블록 기반 스캐닝 전자 현미경 연구를 위한 뇌 슬라이스는 수지에 평평한 대조를 이루고, 해마의 CA1 영역을 핀에 장착하고 직렬 블록 기반 스캐닝 전자 현미경으로 이미지화되었다.노란색 상자에 강조 표시된 프로토콜의 일부가 비디오에 등장했습니다. 100개의 미생물 조각으로 고정되어 절단된 조직을 3분 동안 차가운 인산염 버퍼로 5회 세척하십시오. 4%의 오스뮴 테트산화물과 3%의 칼륨 페로시야니드의 일대일 혼합물을 준비합니다.최종 제품은 갈색으로 바뀝니다. 이 혼합물에 샘플을 담그다. 그런 다음 샘플을 얼음 위에 놓습니다.그리고 이 단계에서부터 는 빛으로부터 보호하는 것이 중요합니다. 1 시간 동안 부드러운 흔들림으로 그들을 인큐베이션하십시오. 한편, TCH 솔루션을 준비합니다.이중 증류수 10밀리리터와 0.1그램의 TCH를 섞으세요. 1시간 동안 60°C로 설정된 오븐에 넣습니다. 수시로 솔루션을 스위서하는 것이 중요합니다.준비가 되면 실온으로 식힙니다. 이제 샘플을 두 번 증류수로 각각 3분 동안 5회 세척한 다음 여과된 TCH 용액에 담급됩니다. 슬라이스가 검은색으로 바뀝니다.실온에서 20분 동안 배양하십시오. 샘플을 2회 증류수로 각각 3분 동안 5회 세척하고 실온에서 30분 동안 2%의 오스뮴 테트리옥사이드로 배양합니다. 다시 말하지만, 샘플을 3 분 동안 5 번 두 번 증류물로 씻고 여과 된 1 % 또는 아밀 아세테이트에 넣습니다.하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 배양하십시오. 다음 날, D-아스파트 준비로 시작합니다. 납 질산과 60°C까지 미리 따뜻하게 된 아파르산 용액을 섞습니다.혼합물을 섭씨 60도로 설정된 수조에 넣고 수산화 나트륨 1개를 사용하여 pH를 5.5로 조정합니다. 유리병을 납으로 닫고 섭씨 60도에서 30분 간 그대로 둡니다. 해결책은 분명해야 합니다.흐린 경우 폐기해야 하며 새로운 것을 준비해야 합니다. 그 동안, 가스 이중 증류수로 샘플을 3분 동안 5회 세척하고 30분 동안 60°C의 오븐에 보관하십시오. 새로 준비된 납 아스파트에 이액에 샘플을 담그고 20분 동안 섭씨 60도로 설정된 오븐에 배양합니다.에폭시 수지 준비. 재료의 무게를 측정하고 가속기 DMP 30을 추가하기 전에 적어도 30 분 동안 수지를 잘 섞습니다. 에탄올의 등급 희석으로 바이러스를 준비합니다.그런 다음 샘플을 오븐에서 꺼내 두 번 증류수로 3 분 동안 다시 씻습니다. 한편, 수지와 100%에탄올을 1대1 비율로 섞어 50%의 수지를 얻습니다. 잘 섞으세요.이에 따라 에탄올의 각 희석시 샘플을 5분 동안 탈수합니다. 샘플이 완전히 건조해서는 안된다는 것을 기억하십시오. 샘플을 30분 동안 50%의 수지로 먼저 침투한 다음 1시간 동안 100%의 수지로 샘플을 먼저 침투한 다음 하룻밤 사이에 신선한 100% 수지로 다시 침투합니다.다음 날, 샘플을 1시간 동안 신선한 100% 수지에 넣은 다음 불소 중합체 포함 시트 사이에 포함시됩니다. 에탄올로 기름을 바른 임베딩 시트 조각을 준비하고 지지로 사용될 유리 슬라이드를 제쳐 놓습니다. 유리 슬라이드에 포함 시트 조각을 놓고 수지를 한 방울 만넣은 다음 나무 막대기를 사용하여 샘플을 조심스럽게 옮습니다.두 번째 조각으로 덮습니다. 기포를 피하십시오. 조직이 매우 깨지기 때문에 부드럽게하십시오.다른 유리 슬라이드를 포함 시트 조각 위에 조심스럽게 놓고 적어도 48 시간 동안 70섭씨에서 오븐에 샘플을 치료하십시오. 레이어를 분리하고 임베디드 샘플 조각을 면도날로 잘라냅니다. 파라핀으로 옮겨.이렇게 하면 정전기로 인해 시료를 잃을 위험이 최소화됩니다. 에탄올로 기름을 바른 알루미늄 핀을 가져 가라. 전도성 에폭시를 잘 섞고 약간의 양을 사용하여 샘플을 핀에 장착하십시오.전도성 에폭시를 섭씨 70도에서 10분간 치료하십시오. 샘플 블록의 각 면을 다이아몬드 나이프로 잘라낸 다음 조직이 노출될 때까지 블록의 얼굴을 연마합니다. 전도성 페인트를 사용하여 샘플을 핀에 접지하고 치료합니다.충전을 최소화하기 위해 샘플은 얇은 금 또는 금 팔라듐층으로 코팅된 것을 발견해야 합니다. 시료가 있는 핀을 일련 블록 기반 스캐닝 전자 현미경의 챔버에 놓습니다. 샘플을 칼에 정렬한 다음 챔버를 닫고 매개 변수를 설정합니다.이미지 스택을 수집합니다. 설명된 방법을 사용하여, 마우스 뇌 조직의 이미지가 얻어졌다. 해마 의 큰 이미지는 한 영역을 촬영하고 이미징은 층 방사의 중심에 설정되었다.이미지 더미를 획득하고 수지상 척추 및 시냅스와 같은 관심 있는 개체가 분할되었습니다. 양질의 조직 형태는 명확하게 보이는 막과 시냅스 소포 및 잘 보존된 미토콘드리아로 얻어졌다. PSD 95 항체의 면역 형광 연구는 4 %의 PFA와 온화한 1 차 고정 및 전통적인 고정이 비교 결과를 준다는 것을 확인했습니다.제시된 프로토콜은 직렬 블록 기반 스캐닝 전자 현미경 검사법, 고품질 조직 형태 및 12개의 눈에 보이는 멤브레인을 사용하여 뇌 조직 이미지를 획득하여 10개의 올바른 세분화 및 재구성을 용이하게 합니다. 내 1 차 고정은 PSD 95 면역 형광 및 전자 현미경 이미징 수지상 척추의 분석을 위해 동일한 뇌를 사용할 수 있게했습니다. 여기서 우리는 PSE 9, 500 신진을 사용합니다.그러나 다른 쪽도 사용할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

교양 Hippocampal 뉴런의 돌기 쪽이에서 형광 단백질의 태그 Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

연구

신경과학

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

초점을 맞춘 이온 빔은 밀링 및 뇌 조직의 전자 현미경을 스캐닝

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Axons, 수석 및 뇌 슬라이스의 개별 뉴런의 수지상 쪽의 전압에 민감한 염료 기록

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입 : 시냅틱 통합을 조사하는 유용한 도구

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 신경 세포의 형태와 마이그레이션을 연구하는

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

구조적 조명 현미경을 사용하여 쥐 차 해마 신경 세포의 돌기 쪽 이미징

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

모델로 후각 시스템은 축삭 성장 패턴 및 형태를 연구하는<em&gt; 생체</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with &#946;-Amyloid Plaques

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-Amyloid Plaques

상호 빛과 전자 현미경은 β - 아밀로이드 플라크와 소교의 상호 작용을 연구하는

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

직렬 블록 얼​​굴 스캐닝 전자 현미경을 사용하여 뇌 미토콘드리아 분석

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...