Name: isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription
Uploaded: 2021-08-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل بمنحة من المعهد الوطني للصحة (R35GM124678 إلى J. S.).

1. الاستعدادات الإعلامية
<ol><li>إعداد مرق الليوجيني العقيم (LB) لوحات أجار والوسائط السائلة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.</li>
	<li>سلالة Streak Escherichia coli (الإشريكية القولونية) OP50 على طبق أجار LB. احتضان سلسلة البكتيريا في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.</li>
	<li>تخزين لوحة E. coli OP50 المتتالية ع...

<ol>
	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Blackwell, T. K., Walker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+mechanisms.">Transcription mechanisms.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-16 (2006).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-15 (2007).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+properties+of+the+Caenorhabditis+elegans+TATA-box-binding+protein.">Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+activation+of+transcription+by+UNC-86+and+MEC-3+in+Caenorhabditis+elegans+embryo+extracts.">Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts.</a> EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).</li><li>Shan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope-labeled+immunoassays+without+radiation+waste.">Isotope-labeled immunoassays without radiation waste.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).</li><li>Voss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+non-radioactive+eukaryotic+in+vitro+transcription+assay+for+sensitive+quantification+of+RNA+polymerase+II+activity.">A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity.</a> BMC Molecular Biology. 15, 7 (2014).</li><li>Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+Caenorhabditis+elegans+transcription+system.">A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87 (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Zbacnik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+buffers+in+protein+formulations.">Role of buffers in protein formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).</li></ol>

C. elegans هو كائن حي نموذج جذاب لدراسة نظام النسخ eukaryotic بسبب صيانته منخفضة التكلفة وسهولة التلاعب الجيني. هنا يتم وصف بروتوكول لعزل ثابت لاستخراج النووية النشطة وظيفيا من L4 C. elegans . على الرغم من أن هذا البروتوكول ركز على تصور نشاط النسخ ، يمكن قياس CDNA المنتجة بعد النسخ باستخدام RT-qPCR لل...

الصغيرة، والعيش الحر النيماتودا Caenorhabditis elegans هو كائن نموذجي بسيط ولكن قوية لمعالجة مجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية. منذ إدخالها في عام 1963 ، كانت الديدان الخيطية لا تقدر بثمن للإجابة على الأسئلة في علم الأعصاب والتمثيل الغذائي والشيخوخة والتنمية والمناعة وعلم الوراثة1. بعض من العديد من الخصائص الحيوانية التي تجعل من كائن نموذجي مثالي تشمل وقت الجيل القصير، وفعالية تدخل الحمض النووي الريبي، والجسم الشفاف، والخرائط المكتملة لكل من النسب الخلوي والجهاز العصبي.
في حين أن مساهمات النيماتودا في العلوم واسعة ، إلا أنها لم تستخدم بشكل كاف لتوضيح نظام النسخ النواخي ، مع معظم فهمنا حول هذه الآليات القادمة من الدراسات باستخدام الاستخراج النووي من الخميرة وذبابة الفاكهة وثقافة خلايا الثدييات2. أكبر عقبة تثني الباحثين عن استخراج استخراج نووي وظيفي هو لطيف النيماتود الخارجي الصعب. يتكون هذا الهيكل الخارجي من الكولاجينات المتقاطعة و البشرة و البروتينات الجليكوبروتينية والدهون ، مما يجعل C. elegans من مرحلة اليرقات إلى مرحلة البلوغ مقاوما لاستخراج البروتين عن طريق القوى الكيميائية أو الميكانيكية3. وقد تم تطوير نظام نسخ في المختبر باستخدام مستخلص C. elegans النووي مرة واحدة ولكن لم يتم اعتماده على نطاق واسع بسبب النطاق المحدود للنظام ، واستخدام Dounce homogenizer لإعداد المستخلص يمكن أن يؤدي إلى عدم استقرار البروتين4،5.
على عكس البروتوكول السابق لعزل الاستخراج النووي الذي استخدم متجانس Dounce لكسر C. elegans ، يستخدم هذا البروتوكول متجانس Balch. يتكون المتجانس بالش من مكونين رئيسيين: كرة كربيد التنغستن وكتلة من الفولاذ المقاوم للصدأ مع قناة بالملل من نهاية إلى أخرى. يتم تحميل المتجانس بالش مع الكرة كربيد التنغستن وتوج على جانبي لختم غرفة طحن. يمكن تحميل المحاقن على المنفذين العموديين المؤديين إلى غرفة الطحن. كما يتم تمرير المواد من حقنة واحدة إلى أخرى من خلال غرفة طحن، والضغط من المحاقن يجبر المواد من خلال فجوة ضيقة بين الكرة وجدار الغرفة. هذا الضغط البطيء والمستمر يكسر المادة حتى تصل إلى حجم ثابت قادر على المرور عبر الفجوة الضيقة بسهولة. إجبار C. elegans من خلال الفجوة الضيقة عبر ضغط ثابت بعد لطيف يكسر الحيوانات مفتوحة، والإفراج عن محتواها في المخزن المؤقت المحيطة بها. تبديل أحجام الكرة يزيد من تضييق الفجوة، وكسر الخلايا الصادرة حديثا ويحرر النوى في المخزن المؤقت. وتفصل حالات متعددة من الطرد المركزي النوى عن بقية حطام الخلية، مما يسمح بجمع مستخلص نووي نظيف. ويفضل المتجانس بالش على التجانس Dounce لعدة أسباب: يمكن للنظام التعامل مع عدد كبير من الحيوانات، مما يجعل من الممكن لاستخراج كمية عالية من البروتينات النشطة في محاولة واحدة. الآلات الدقيقة للكرات وكتلة الصلب يسمح لطحن متسقة بين عينات متعددة؛ كتلة الصلب الثقيلة بمثابة بالوعة الحرارة، ورسم الحرارة بشكل موحد بعيدا عن غرفة طحن، ومنع التدهور.
بعد العزل، يجب التحقق من نشاط النسخ المستخلص النووي قبل استخدامه في أي تجارب بيوكيميائية. تقليديا، تم قياس نشاط النسخ باستخدام النيوكليوتيدات التي تم تصنيفها إشعاعيا لتتبع وتصور الحمض النووي الريبي المركب حديثا. ومع ذلك، يمكن أن يكون وضع العلامات المشعة مرهقا لأنه يتطلب الحذر أثناء الاستخدام والتخلص6. تسمح التطورات التكنولوجية للباحثين اليوم باستخدام أساليب أقل ضررا أو إزعاجا لقياس حتى كميات الحمض النووي الريبي الصغيرة باستخدام تقنيات مثل PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR)7. هنا، يصف البروتوكول طريقة لعزل الاستخراج النووي النشط من المرحلة اليرقات 4 (L4) C. elegans وتصور نشاط النسخ في نظام المختبر.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Consumables and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL 8-Strip Tubes &#38; Flat Strip Caps, Clear</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL Individual PCR tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-153G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL sterile microtubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-282S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% absolute molecular grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP2818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol, Koptec</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>&#160;V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm petri plates</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>&#160;T3325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;28-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL plastic syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Norm-Ject syringes</td>
			<td>Henke-Sass Wolf GmbH</td>
			<td>4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL vacuum filter cup 0.22 &#181;m PES, Stericup Millipore Express Plus</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Criterion</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;C7432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>&#160;CA3510-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol proof marker</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;90000-264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans</td>
			<td>CGC</td>
			<td>N2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;15508-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel stain, SYBR safe</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder mix, O&#8217;gene ruler</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Loading Dye, 6x TriTrack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;FERR1161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase, Baseline-ZERO</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;DB0715K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50 strain</td>
			<td>CGC</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe</td>
			<td>Promega</td>
			<td>&#160;E3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes Solution, 1 M Gibco</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 37%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypochlorite bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium weigh dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;02-202-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides, Vista vision</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>16004-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade water, Hypure</td>
			<td>Hyclone Laboratories</td>
			<td>&#160;SH30538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;N1638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR system, FailSafe with premix A</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;FS99100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P39111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein assay kit, Qubit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;Q33211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse transcription kit, Sensiscript</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction kit RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>&#160;N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;BDH9286-12KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;1-09137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filter with 0.2 &#181;m Polyethersulfone membrane</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>28145-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;200-334-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Forward 5&#8217;- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Reverse 5&#8217;- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C freezer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer</td>
			<td>Isobiotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, Eppendorf 5418 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5401000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, VWR Clinical 50</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82013-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope, Leica M80</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer, Qubit 2.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging system, iBright FL1500</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;A44241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>12621-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges, Eppendorf 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETBOY acu 2</td>
			<td>Integra</td>
			<td>155017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking platform</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription

كان Caenorhabditis elegans نظاما نموذجيا مهما للأبحاث البيولوجية منذ عرضه في عام 1963. ومع ذلك، لم يتم استخدام C. elegans بشكل كامل في الدراسة الكيميائية الحيوية للتفاعلات البيولوجية باستخدام مستخلصاتها النووية مثل النسخ المختبري وتكرار الحمض النووي. هناك عقبة كبيرة أمام استخدام سي إليغانس في الدراسات الكيميائية الحيوية هي تعطيل الجلد الخارجي السميك للنيماتودا دون التضحية بنشاط المستخلص النووي. في حين يتم استخدام العديد من الطرق لكسر كتيكل، مثل تجانس دونس أو سونيكيشن، فإنها غالبا ما تؤدي إلى عدم استقرار البروتين. لا توجد بروتوكولات راسخة لعزل البروتينات النووية النشطة عن اليرقات أو البالغين C. elegans لتفاعلات المختبر. هنا ، يصف البروتوكول بالتفصيل تجانس المرحلة 4 C. elegans اليرقات باستخدام متجانس بالش. يستخدم المتجانس بالش الضغط لإجبار الحيوانات ببطء من خلال فجوة ضيقة تكسر السفاح في هذه العملية. يسمح التصميم الموحد والآلات الدقيقة للمتجانس بالش بطحن الحيوانات بشكل متسق بين التجارب. تجزئة المتجانسة التي تم الحصول عليها من المتجانس بالش تسفر عن استخراج النووية النشطة وظيفيا التي يمكن استخدامها في طريقة في المختبر لاقتناص نشاط النسخ من elegans C.

وينبغي أن يؤدي اتباع الخطوات المحددة إلى استخراج نووي وظيفي (الشكل 1)، ويمكن أن يؤدي الانحراف في خطوات الطحن أو الغسل إلى ضعف النشاط أو انخفاض الغلة. إذا تم الحصول على استخراج C . elegans النووية وظيفية ، فإنه سيتم نسخ المنطقة المصب من المروج CMV على قالب ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription at JoVE.com

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

هنا، نقوم بوصف بروتوكول مفصل لعزل المستخلص النووي النشط من المرحلة الرابعة من اليرقات وتصور نشاط النسخ في نظام المختبر .

عزل نشط Caenorhabditis elegans استخراج النووية وإعادة تشكيل للنسخ في المختبر

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

هذا البروتوكول يسد فجوة تقنية للدراسة الكيميائية الحيوية للC.elegans ويوسع فائدتها ككائن حي نموذجي. هذه التقنية بسيطة وقوية على حد سواء، مما يسمح لعزل ثابت لاستخراج C.elegans النووية النشطة وظيفيا. ابدأ بوضع L1 المتزامنة على لوحات تحتوي على النيماتودا نمو 10 150 ملليمترا المبذورة مع الإشريكية القولونية OP50 ، والسماح للحيوانات بالنمو لمدة 48 ساعة عند 20 درجة مئوية حتى تصل إلى مرحلة L4.بمجرد إعداد المخازن المؤقتة هيكتونيك وhypertonic، تنظيف المتجانس بالش عن طريق إغراق غرفة طحن مع الإيثانول 70٪. ثم شطف الغرفة بالماء deionized لإزالة الإيثانول الزائد. أدخل كرة كربيد التنغستن في غرفة الطحن.قم بسقف نهايات برميل المتجانس بالش، وتأمين القبعات باستخدام أطقم الإبهام المقدمة. ثم قم بإعداد خمسة ملليلترات من المخازن المؤقتة الهكتونية والهايبرتونية الكاملة لكل عينة كما هو موضح في مخطوطة النص. ملء المقبل معقمة، حقنة ملليلتر اثنين مع ملليلتر واحد من العازلة هيبوتونيك كاملة، وتدفق بلطف غرفة طحن المتجانس بالش، وترك ما يقرب من 500 ميكرولتر من العازلة هيبوتونيك كاملة في الغرفة.تخزين التجانس مسح على الجليد، والسماح لها تبرد لمدة 30 دقيقة. جمع الحيوانات L4 تغذية جيدة مع العازلة M9 في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر، والطرد المركزي الحيوانات في 1000 مرة ز لمدة ثلاث دقائق. إزالة supernatant، ومواصلة غسل بيليه الحيوان حتى الناسل هو واضح.غسل المقبل الحيوانات مع ثلاثة ملليلتر من العازلة هيبوتونيك الباردة، والطرد المركزي مرة أخرى كما هو موضح. بعد إزالة العازلة هيبوتونيك العملاقة، إضافة ملليلتر واحد من العازلة هيبوتونيك كاملة إلى بيليه الحيوان، ونقل تعليق الحيوان إلى حقنة جديدة معقمة، واثنين من ملليلتر. لتجانس الحيوانات المحفوظة على الجليد، ودفع بلطف الحيوانات من خلال غرفة طحن من المتجانس بالش محملة الكرة التنغستن.ثم جمع الحيوانات مرة أخرى في الحقنة، وتكرار هذا الإجراء 30 مرة. بعد 30 دورة من التجانس، وجمع أقصى تعليق الحيوان من المتجانس بالش، وتخزين الحقنة مع طرف وضعه إلى أسفل داخل الأنابيب الدقيقة 1.7 ملليلتر. إزالة الكرة التنغستن، وتنظيف غرفة طحن مع الماء deionized.الجافة والعودة الكرة إلى أنبوب المسمى كل منها. ثم أدخل الكرة التنغستن مع 7.9880 ملليمتر قطرها و12 ميكرومتر إزالة الفجوة في غرفة طحن، وإعادة ختم المتجانس. طرد غرفة طحن مرة أخرى مع ملليلتر واحد من الجليد الباردة العازلة ناقصة الطنين كاملة.طحن تعليق 25 مرات كما هو موضح. نقل تعليق الحيوان إلى نظيفة، 1.7 ملليلتر يوتيوب، وتخزين التعليق على الجليد. بيليه أسفل الجثث الحيوانية والحطام عن طريق الطرد المركزي.ماصة 40 ميكرولتر من supernatant إلى أنبوب وصفت بأنها جزء الإدخال، وتخزين الكسر على الجليد. نقل supernatant المتبقية إلى أنبوب جديد 1.7 ملليلتر دون إزعاج بيليه، والطرد المركزي لبيليه النوى. ثم نقل supernatant دون إزعاج النوى بيليه إلى أنبوب جديد 1.7 ملليلتر وصفت بأنها كسر السيتوسوليك.لغسل بيليه النوى، أضف 500 ميكرولتر من العازلة هيبوتونيك كاملة إلى بيليه، وتعليق بيليه، والطرد المركزي في 4،000 مرة ز في أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. في نهاية الطرد المركزي، وإعادة إنفاق بيليه النووية في 500 ميكرولتر من العازلة تحت الحجرية كاملة جديدة، ومرة أخرى الطرد المركزي العينة كما هو موضح. ثم حل بيليه في 40 ميكرولتر من العازلة فرطتونية كاملة.نقل التعليق النووي إلى أنبوب جديد 1.7 ملليلتر المسمى كسر النووية، وتخزينها على الجليد. تحديد تركيز البروتين من ثلاثة كسور باستخدام عدة الفلورسنت القياس الكمي. Aliquot الكسور النووية في أنابيب ذات استخدام واحد تحتوي على ستة ميكروغرام من البروتين النووي، وتجميد المفاجئة في الجليد الجاف وحمام الإيثانول.تخزين العينات في ناقص 80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام. تظهر الصورة الهلامية التمثيلية منتجات النسخ من استخراج يرقات Caenorhabditis elegans L4 النووي باستخدام قالب الحمض النووي المروج ل CMV. أدت العزلة الناجحة للبروتينات النووية النشطة إلى وجود نطاق ثنائي أساسي 132 بعد نسخ في المختبر ، وأسفرت العزلة غير الناجحة عن فرقة ضعيفة أو عدم وجود فرقة.تذكر تسمية المخازن المؤقتة الكاملة بوضوح. يمكن أن تضر المخازن المؤقتة غير المناسبة بوظائف البروتينات النووية. أيضا، والحفاظ على الجليد المجانس الباردة لمنع تحلل البروتينات.وقد سمح تطوير هذه التقنية للباحثين بقياس معدل نسخ الحمض النووي الريبي من ال C.elegans خلال الظروف العصيبة، مما يدل على أن معدل النسخ الحيواني يمكن أن يتغير اعتمادا على الظروف البيئية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

والعزلة وقياسات الجهاز التنفسي من الميتوكوندريا من التمويل نبات

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

طريقة بسيطة لفحص المواد الكيميائية عالية الإنتاجية في ايليجانس كاينورهابديتيس

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

تنقية وإعادة تشكيل TRPV1 لتحليل سبيكتروسكوبيك

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

قياس الألوان فحوصات من داخل الخلايا لاكتات الصغيرة وبيروفات في السلكية ايليجانس كاينورهابديتيس

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

زراعة الواسعة النطاق على أساس لوحة ايليجانس كاينورهابديتيس: "إعداد نموذج" "دراسة التعديلات الأيضي" في مرض السكري

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

في المختبر إعادة تشكيل التنظيم الذاتي أنماط البروتين في بليرس الدهن المعتمدة

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

عزل ثيلاكويدس النشطة فسيولوجيا واستخدامها في فحوصات البروتين الطاقة تعتمد على النقل

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

تطبيق قياس التداخل الحيوي (BLI) لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين في النسخ

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

توليف معيار مبتور للكم من 2-Arashidonoylglycerol في Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

في فيفو هيدروكسيل الجذر البروتين البصمة لدراسة التفاعلات البروتين في Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...