Name: isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription
Uploaded: 2021-08-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af et NIH MIRA-tilskud (R35GM124678 til J.S.).

1. Medieforberedelser
<ol><li>Forbered sterile lysogeny bouillon (LB) agarplader og flydende medier efter producentens anvisninger.</li>
	<li>Streak Escherichia coli (E. coli) stamme OP50 på en LB agar plade. Inkuberes bakteriestriben ved 37 °C natten over.</li>
	<li>Stimepladen E. coli OP50 opbevares ved 4 °C efter inkubation. E. coli OP50-pladen kan opbevares sikkert ved 4 °C i 2 uger, hvis den er pakket ind i parafilm for at forhindre fugttab.</li>
	<li>Forbered 2 L Nematode G...

<ol>
	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Blackwell, T. K., Walker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+mechanisms.">Transcription mechanisms.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-16 (2006).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-15 (2007).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+properties+of+the+Caenorhabditis+elegans+TATA-box-binding+protein.">Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+activation+of+transcription+by+UNC-86+and+MEC-3+in+Caenorhabditis+elegans+embryo+extracts.">Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts.</a> EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).</li><li>Shan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope-labeled+immunoassays+without+radiation+waste.">Isotope-labeled immunoassays without radiation waste.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).</li><li>Voss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+non-radioactive+eukaryotic+in+vitro+transcription+assay+for+sensitive+quantification+of+RNA+polymerase+II+activity.">A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity.</a> BMC Molecular Biology. 15, 7 (2014).</li><li>Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+Caenorhabditis+elegans+transcription+system.">A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87 (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Zbacnik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+buffers+in+protein+formulations.">Role of buffers in protein formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).</li></ol>

C. elegans er en tiltalende modelorganisme til at studere det eukaryote transskriptionssystem på grund af dets billige vedligeholdelse og den lette genetiske manipulation. Her beskrives en protokol for konsekvent isolering af funktionelt aktivt nukleart ekstrakt fra L4 C. elegans . Selvom denne protokol fokuserede på visualisering af transskriptionsaktivitet, kan cDNA produceret post-transcriptionally kvantificeres ved hjælp af RT-qPCR for at opnå en mere præcis måling af transsk...

Den lille, fritlevende nematode Caenorhabditis elegans er en enkel, men kraftfuld modelorganisme til at løse en lang række biologiske spørgsmål. Siden indførelsen i 1963 har nematoderne været uvurderlige for at besvare spørgsmål inden for neurobiologi, metabolisme, aldring, udvikling, immunitet og genetik1. Nogle af dyrets mange egenskaber, der gør det til en ideel modelorganisme, omfatter kort generationstid, effektiviteten af RNA-interferens, gennemsigtig krop og de færdige kort over både dets cellulære afstamning og nervesystem.
Mens nematodens bidrag til videnskaben er enorme, er de blevet underudnyttet til at belyse det eukaryote transskriptionssystem, hvor det meste af vores forståelse af disse mekanismer kommer fra undersøgelser ved hjælp af nukleart ekstrakt fra gær, frugtflue og pattedyrcellekultur2. Den største forhindring, der afskrækker forskere fra at udvinde funktionelle nukleare ekstrakt er nematoden hårde ydre kutikula. Dette exoskelet omfatter krydsbundne kollagen, cuticlins, glycoproteiner og lipider, hvilket gør C. elegans fra larvestadiet til voksenalderen resistente over for proteinudvinding via kemiske eller mekaniske kræfter3. Et in vitro transskriptionssystem ved hjælp af C. elegans nukleare ekstrakt blev engang udviklet, men ikke bredt vedtaget på grund af systemets begrænsede omfang, og brugen af Dounce homogenisator til fremstilling af ekstraktet kan føre til protein ustabilitet4,5.
I modsætning til den tidligere protokol for nuklear ekstrakt isolation, som udnyttede en Dounce homogenizer til at bryde C. elegans, denne protokol bruger en Balch homogenizer. Balch homogenisatoren består af to hovedkomponenter: en wolframcarbidkugle og en blok i rustfrit stål med en kanal, der keder sig igennem fra den ene ende til den anden. Balch homogenisatoren er fyldt med wolframcarbidkuglen og udjævnes på begge sider for at forsegle slibekammeret. Sprøjter kan lastes på de to lodrette porte, der fører ind i slibekammeret. Da materialet overføres fra den ene sprøjte til den anden gennem slibekammeret, tvinger trykket fra sprøjterne materialet gennem et smalt mellemrum mellem bolden og væggen i kammeret. Dette langsomme og konstante tryk bryder materialet, indtil det når en ensartet størrelse, der er i stand til at passere gennem det smalle hul let. Tvinger C. elegans gennem det smalle hul via et konstant, men blidt tryk bryder dyrene åbne og frigiver deres indhold i den omgivende buffer. Skift af kuglestørrelser strammer yderligere hullet, bryder de nyligt frigivne celler og frigør kernerne i bufferen. Flere tilfælde af centrifugering adskiller kernerne fra resten af celleaffaldet, hvilket giver mulighed for indsamling af et rent nukleart ekstrakt. Balch homogenisatoren foretrækkes frem for Dounce homogenisatoren af flere grunde: systemet kan håndtere et stort antal dyr, hvilket gør det muligt at udtrække en høj mængde aktive proteiner i et enkelt forsøg; den præcise bearbejdning af kuglerne og stålblokken giver mulighed for ensartet slibning mellem flere prøver; den tunge stålblok fungerer som en køleplade, der ensartet trækker varme væk fra slibekammeret, hvilket forhindrer denaturering.
Efter isolering skal det nukleare ekstrakts transskriptionsaktivitet verificeres, før den anvendes i biokemiske eksperimenter. Traditionelt blev transskription aktivitet målt ved hjælp af radiomærkede nukleotider til at spore og visualisere den nyligt syntetiserede RNA. Radioaktiv mærkning kan dog være byrdefuld, da det kræver forsigtighed under brug og bortskaffelse6. Teknologiske fremskridt gør det muligt for forskere i dag at bruge langt mindre skadelige eller besværlige metoder til at måle selv små RNA-mængder ved hjælp af teknikker som kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR)7. Her beskriver protokollen en metode til at isolere aktivt nukleart ekstrakt fra larvestadiet 4 (L4) C. elegans og visualisere transskription aktivitet i et in vitro-system.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Consumables and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL 8-Strip Tubes &#38; Flat Strip Caps, Clear</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL Individual PCR tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-153G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL sterile microtubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-282S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% absolute molecular grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP2818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol, Koptec</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>&#160;V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm petri plates</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>&#160;T3325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;28-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL plastic syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Norm-Ject syringes</td>
			<td>Henke-Sass Wolf GmbH</td>
			<td>4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL vacuum filter cup 0.22 &#181;m PES, Stericup Millipore Express Plus</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Criterion</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;C7432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>&#160;CA3510-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol proof marker</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;90000-264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans</td>
			<td>CGC</td>
			<td>N2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;15508-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel stain, SYBR safe</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder mix, O&#8217;gene ruler</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Loading Dye, 6x TriTrack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;FERR1161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase, Baseline-ZERO</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;DB0715K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50 strain</td>
			<td>CGC</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe</td>
			<td>Promega</td>
			<td>&#160;E3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes Solution, 1 M Gibco</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 37%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypochlorite bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium weigh dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;02-202-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides, Vista vision</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>16004-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade water, Hypure</td>
			<td>Hyclone Laboratories</td>
			<td>&#160;SH30538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;N1638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR system, FailSafe with premix A</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;FS99100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P39111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein assay kit, Qubit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;Q33211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse transcription kit, Sensiscript</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction kit RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>&#160;N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;BDH9286-12KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;1-09137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filter with 0.2 &#181;m Polyethersulfone membrane</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>28145-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;200-334-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Forward 5&#8217;- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Reverse 5&#8217;- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C freezer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer</td>
			<td>Isobiotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, Eppendorf 5418 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5401000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, VWR Clinical 50</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82013-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope, Leica M80</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer, Qubit 2.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging system, iBright FL1500</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;A44241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>12621-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges, Eppendorf 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETBOY acu 2</td>
			<td>Integra</td>
			<td>155017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking platform</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription

Caenorhabditis elegans har været et vigtigt modelsystem for biologisk forskning, siden det blev indført i 1963. C. elegans er imidlertid ikke blevet udnyttet fuldt ud i den biokemiske undersøgelse af biologiske reaktioner ved hjælp af sine nukleare ekstrakter som in vitro transskription og DNA-replikation. En betydelig forhindring for brug af C. elegans i biokemiske undersøgelser forstyrrer nematodens tykke ydre neglebånd uden at ofre aktiviteten af det nukleare ekstrakt. Mens flere metoder bruges til at bryde neglebånd, såsom Dounce homogenisering eller sonikering, de ofte fører til protein ustabilitet. Der findes ingen fastlagte protokoller for isolering af aktive nukleare proteiner fra larve eller voksne C. eleganer til in vitro-reaktioner . Her beskriver protokollen i detaljer homogeniseringen af larvestadiet 4 C. eleganer ved hjælp af en Balch homogenizer. Balch homogenisatoren bruger tryk til langsomt at tvinge dyrene gennem et smalt hul, der bryder neglebånd i processen. Balch homogenisatorens ensartede design og præcise bearbejdning giver mulighed for ensartet slibning af dyr mellem forsøg. Fraktionering af homogenatet fra Balch homogenisatoren giver funktionelt aktivt nukleart ekstrakt, der kan anvendes i en in vitro-metode til analyse af transskription af C. elegans.

Efter de skitserede trin skal give funktionelt nukleart ekstrakt (figur 1), kan afvigelse i slibe- eller vasketrinene føre til dårlig aktivitet eller lavt udbytte. Hvis der opnås funktionelT C. elegans nukleart ekstrakt, vil det transskribere regionen nedstrøms cmv-promotoren på DNA-skabelonen, når den føjes til den tidligere beskrevne in vitro-analyse . Den resulterende RNA udskrift kan renses fra de nukleare proteiner og DNA skabel...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription at JoVE.com

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Her beskriver vi en detaljeret protokol til isolering af aktivt nukleart ekstrakt fra larvestadiet 4 C. elegans og visualisering af transskriptionsaktivitet i et in vitro-system .

Isolering af aktiv caenorhabditis elegans nukleare ekstrakt og rekonstitution for In Vitro Transskription

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

Denne protokol udfylder et teknisk hul for den biokemiske undersøgelse af C.elegans og udvider deres anvendelighed som en model organisme. Denne teknik er både enkel og robust, giver mulighed for konsekvent isolering af funktionelt aktive C.elegans nukleare ekstrakt. Begynd med at placere de synkroniserede L1 dyr på 10 150-millimeter nematode vækst medieholdige plader sået med Escherichia coli OP50, og lad dyrene vokse i 48 timer ved 20 grader Celsius, indtil de når L4-stadiet.Når de hypotoniske og hypertoniske buffere er forberedt, rengør Balch homogenisatoren ved at oversvømme slibekammeret med 70% ethanol. Skyl derefter kammeret med deioniseret vand for at fjerne den overskydende ethanol. Sæt wolframcarbidkuglen ind i slibekammeret.Cap enderne af Balch homogenisator tønde, og fastgør hætterne med de medfølgende thumbscrews. Forbered derefter fem milliliter af de komplette hypotoniske og hypertoniske buffere pr. prøve som beskrevet i tekstmanuskriptet. Fyld derefter en steril, to milliliter sprøjte med en milliliter komplet hypotonisk buffer, og skyl forsigtigt balch homogenisatorens slibekammer, hvilket efterlader ca. 500 mikrolitere af komplet hypotonisk buffer i kammeret.Opbevar den skyllede homogenisator på is, og lad den køle af i 30 minutter. Saml de velfodrede L4 dyr med M9 buffer i et 15-milliliter konisk rør, og centrifuge dyrene på 1.000 gange g i tre minutter. Fjern supernatanten, og fortsæt med at vaske dyrepillen, indtil supernatanten er klar.Vask derefter dyrene med tre milliliter kold hypotonisk buffer og centrifuge igen som demonstreret. Efter fjernelse af den supernatante hypotoniske buffer skal du tilføje en milliliter komplet hypotonisk buffer til dyrepillen og overføre dyreophænget til en ny steril, to milliliter sprøjte. For at homogenisere dyrene holdes på is, forsigtigt skubbe dyrene gennem slibning kammer Balch homogenisator lastet med wolfram bolden.Saml derefter dyrene tilbage i sprøjten, og gentag denne procedure 30 gange. Efter 30 cyklusser af homogenisering, indsamle maksimal animalsk suspension fra Balch homogenisator, og opbevare sprøjten med spidsen placeret nedad inde i en 1,7-milliliter mikrotube. Fjern wolframkuglen, og rengør slibekammeret med deioniseret vand.Tør og vend bolden tilbage til det respektive mærkede rør. Derefter indsættes wolframkuglen med 7,9880 millimeter diameter og 12-mikrometer mellemrumsafstand i slibekammeret, og reseal homogenisatoren. Skyl slibekammeret igen med en milliliter iskold komplet hypotonisk buffer.Slib affjedringen 25 gange som demonstreret. Overfør dyreops suspensionen til en ren, 1,7 milliliter mikrorør, og opbevar suspensionen på is. Pellet ned dyrets organer og vragrester ved centrifugering.Pipette 40 mikroliter af supernatant til et rør mærket som input fraktion, og gemme fraktionen på is. Overfør den resterende supernatant til et nyt 1,7 milliliterrør uden at forstyrre pelleten, og centrifuge for at pelletkerne. Overfør derefter supernatanten uden at forstyrre de pelleterede kerner til et nyt 1,7 milliliterrør mærket som cytosolic brøk.For at vaske kernepillen skal du tilføje 500 mikroliter af komplet hypotonisk buffer til pelleten, suspendere pelleten og centrifuge ved 4.000 gange g ved fire grader Celsius i fem minutter. Ved afslutningen af centrifugeringen skal atompillen genbruges i 500 mikroliter af frisk komplet hypotonbuffer og igen centrifugere prøven som påvist. Derefter opløses pellet i 40 mikroliter af komplet hypertonisk buffer.Overfør atomaffjedringen til et nyt 1,7 milliliterrør mærket atomfraktion, og opbevar det på is. Bestem proteinkoncentrationen af tre fraktioner ved hjælp af et fluorescerende kvantificeringssæt. Aliquot de nukleare fraktioner i engangsrør, der indeholder seks mikrogram af det nukleare protein, og snap fryse i tøris og ethanol bad.Opbevar prøverne ved minus 80 grader Celsius indtil videre brug. Det repræsentative gelbillede viser transskriptionsprodukterne fra Caenorhabditis elegans L4 larver atomekstrakt ved hjælp af CMV promotor DNA-skabelonen. Den vellykkede isolering af aktive nukleare proteiner resulterede i et 132 baseparbånd efter en in vitro-transskription, og mislykket isolation resulterede i et svagt bånd eller fraværet af et band.Husk tydeligt at mærke de komplette buffere. Uhensigtsmæssige buffere kan skade funktionaliteten af de nukleare proteiner. Hold også homogenisatoren iskold for at forhindre denaturering af proteinerne.Udvikling af denne teknik gjorde det muligt for forskere at måle hastigheden af RNA transskription af C.elegans under stressende forhold, hvilket viser, at dyrets transskriptionshastighed kan ændre sig afhængigt af miljøforholdene.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation og respiratoriske målinger af mitokondrier fra Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En simpel metode til High Throughput kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensning og rekonstituering af TRPV1 for spektroskopisk analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Små kolorimetriske Assays af intracellulære laktat og pyruvat i at ødelægge Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plade-baserede storstilet dyrkning af Caenorhabditis elegans: forberedelse af prøver til undersøgelse af stofskifteforandringer i Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Rekonstituering af selvstændige organisering Protein mønstre på understøttede Lipid dobbeltlag

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolering af fysiologisk aktive tylakoiderne og deres anvendelse i energiafhængige Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Anvendelse af Biolayer interferometri (BLI) til undersøgelse af protein-protein interaktioner i transkriptionen

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Syntese af en deutereret standard for kvantificering af 2-Arachidonoylglycerol i Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

I Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for studiet af proteininteraktioner i Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...