Name: isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription
Uploaded: 2021-08-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door een NIH MIRA-subsidie (R35GM124678 aan J. S.).

1. Mediavoorbereidingen
<ol><li>Bereid steriele lysogeniebouillon (LB) agarplaten en vloeibare media volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Streak Escherichia coli (E. coli) stam OP50 op een LB agarplaat. Incubeer de bacteriestreak bij 37 °C 's nachts.</li>
	<li>Bewaar de E. coli OP50 streepplaat bij 4 °C na incubatie. De E. coli OP50 plaat kan veilig worden bewaard bij 4 °C gedurende 2 weken indien verpakt in parafilm om vochtverlies te voorkomen.</li>
	<li>Bereid 2 L...

<ol>
	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Blackwell, T. K., Walker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+mechanisms.">Transcription mechanisms.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-16 (2006).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-15 (2007).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+properties+of+the+Caenorhabditis+elegans+TATA-box-binding+protein.">Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+activation+of+transcription+by+UNC-86+and+MEC-3+in+Caenorhabditis+elegans+embryo+extracts.">Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts.</a> EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).</li><li>Shan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope-labeled+immunoassays+without+radiation+waste.">Isotope-labeled immunoassays without radiation waste.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).</li><li>Voss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+non-radioactive+eukaryotic+in+vitro+transcription+assay+for+sensitive+quantification+of+RNA+polymerase+II+activity.">A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity.</a> BMC Molecular Biology. 15, 7 (2014).</li><li>Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+Caenorhabditis+elegans+transcription+system.">A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87 (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Zbacnik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+buffers+in+protein+formulations.">Role of buffers in protein formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).</li></ol>

C. elegans is een aantrekkelijk modelorganisme om het eukaryote transcriptiesysteem te bestuderen vanwege het goedkope onderhoud en het gemak van genetische manipulatie. Hier wordt een protocol voor consistente isolatie van functioneel actief nucleair extract van L4 C. elegans beschreven. Hoewel dit protocol gericht was op het visualiseren van transcriptieactiviteit, kan het cDNA dat post-transcriptioneel wordt geproduceerd, worden gekwantificeerd met behulp van RT-qPCR om een nauwkeurigere meting van d...

De kleine, vrijlevende nematode Caenorhabditis elegans is een eenvoudig maar krachtig modelorganisme voor het aanpakken van een breed scala aan biologische vragen. Sinds de introductie in 1963 zijn de nematoden van onschatbare waarde geweest voor het beantwoorden van vragen in neurobiologie, metabolisme, veroudering, ontwikkeling, immuniteit en genetica1. Enkele van de vele kenmerken van het dier die het een ideaal modelorganisme maken, zijn korte generatietijd, de effectiviteit van RNA-interferentie, transparant lichaam en de voltooide kaarten van zowel de cellulaire afstamming als het zenuwstelsel.
Hoewel de bijdragen van de nematode aan de wetenschap enorm zijn, zijn ze onderbenut om het eukaryote transcriptiesysteem op te helderen, waarbij het grootste deel van ons begrip over deze mechanismen afkomstig is van studies met nucleair extract uit gist, fruitvlieg en zoogdiercelcultuur2. De grootste hindernis die onderzoekers ervan weerhoudt om functioneel nucleair extract te extraheren, is de taaie buitenste cuticula van de nematode. Dit exoskelet bestaat uit verknoopte collageen, cuticlinen, glycoproteïnen en lipiden, waardoor C. elegans van larvaal stadium tot volwassenheid resistent zijn tegen eiwitextractie via chemische of mechanische krachten3. Een in vitro transcriptiesysteem met C. elegans nucleair extract werd ooit ontwikkeld, maar niet op grote schaal toegepast vanwege de beperkte reikwijdte van het systeem, en het gebruik van Dounce-homogenisator voor het bereiden van het extract zou kunnen leiden tot eiwitinstabiliteit4,5.
In tegenstelling tot het vorige protocol voor nucleaire extractisolatie, waarbij een Dounce-homogenisator werd gebruikt om C. elegans te breken, gebruikt dit protocol een Balch-homogenisator. De Balch homogenisator bestaat uit twee hoofdcomponenten: een wolfraamcarbide kogel en een roestvrijstalen blok met een kanaal dat van het ene uiteinde naar het andere wordt geboord. De Balch-homogenisator wordt geladen met de wolfraamcarbidekogel en aan weerszijden afgedekt om de maalkamer af te dichten. Spuiten kunnen worden geladen op de twee verticale poorten die naar de slijpkamer leiden. Terwijl het materiaal door de slijpkamer van de ene spuit naar de andere wordt geleid, dwingt de druk van de spuiten het materiaal door een smalle opening tussen de bal en de wand van de kamer. Deze langzame en constante druk breekt het materiaal totdat het een consistente grootte bereikt die gemakkelijk door de smalle opening kan gaan. Door C. elegans via een constante maar zachte druk door de smalle opening te dwingen, breken de dieren open, waardoor hun inhoud in de omringende buffer vrijkomt. Het wisselen van kogelgroottes maakt de opening verder strakker, waardoor de nieuw vrijgegeven cellen worden gebroken en de kernen in de buffer worden bevrijd. Meerdere gevallen van centrifugatie scheiden de kernen van de rest van het celpuin, waardoor een schoon nucleair extract kan worden verzameld. De Balch-homogenisator heeft om verschillende redenen de voorkeur boven de Dounce-homogenisator: het systeem kan een groot aantal dieren aan, waardoor het mogelijk is om in één keer een grote hoeveelheid actieve eiwitten te extraheren; de nauwkeurige bewerking van de kogels en het stalen blok maakt consistent slijpen tussen meerdere monsters mogelijk; het zware stalen blok fungeert als een koellichaam en trekt gelijkmatig warmte weg van de slijpkamer, waardoor denaturering wordt voorkomen.
Na isolatie moet de transcriptionele activiteit van het nucleaire extract worden geverifieerd voordat het in biochemische experimenten wordt gebruikt. Traditioneel werd transcriptieactiviteit gemeten met behulp van radioactief gelabelde nucleotiden om het nieuw gesynthetiseerde RNA te volgen en te visualiseren. Radioactieve etikettering kan echter belastend zijn omdat het voorzorgsmaatregelen vereist tijdens gebruik en verwijdering6. Technologische vooruitgang stelt onderzoekers tegenwoordig in staat om veel minder schadelijke of lastige methoden te gebruiken om zelfs kleine RNA-hoeveelheden te meten met behulp van technieken zoals kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR)7. Hier beschrijft het protocol een methode om actief nucleair extract te isoleren uit larvale stadium 4 (L4) C. elegans en transcriptieactiviteit in een in vitro systeem te visualiseren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Consumables and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL 8-Strip Tubes &#38; Flat Strip Caps, Clear</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL Individual PCR tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-153G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL sterile microtubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-282S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% absolute molecular grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP2818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol, Koptec</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>&#160;V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm petri plates</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>&#160;T3325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;28-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL plastic syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Norm-Ject syringes</td>
			<td>Henke-Sass Wolf GmbH</td>
			<td>4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL vacuum filter cup 0.22 &#181;m PES, Stericup Millipore Express Plus</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Criterion</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;C7432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>&#160;CA3510-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol proof marker</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;90000-264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans</td>
			<td>CGC</td>
			<td>N2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;15508-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel stain, SYBR safe</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder mix, O&#8217;gene ruler</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Loading Dye, 6x TriTrack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;FERR1161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase, Baseline-ZERO</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;DB0715K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50 strain</td>
			<td>CGC</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe</td>
			<td>Promega</td>
			<td>&#160;E3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes Solution, 1 M Gibco</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 37%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypochlorite bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium weigh dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;02-202-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides, Vista vision</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>16004-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade water, Hypure</td>
			<td>Hyclone Laboratories</td>
			<td>&#160;SH30538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;N1638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR system, FailSafe with premix A</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;FS99100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P39111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein assay kit, Qubit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;Q33211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse transcription kit, Sensiscript</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction kit RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>&#160;N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;BDH9286-12KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;1-09137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filter with 0.2 &#181;m Polyethersulfone membrane</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>28145-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;200-334-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Forward 5&#8217;- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Reverse 5&#8217;- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C freezer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer</td>
			<td>Isobiotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, Eppendorf 5418 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5401000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, VWR Clinical 50</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82013-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope, Leica M80</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer, Qubit 2.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging system, iBright FL1500</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;A44241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>12621-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges, Eppendorf 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETBOY acu 2</td>
			<td>Integra</td>
			<td>155017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking platform</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription

Caenorhabditis elegans is sinds de introductie in 1963 een belangrijk modelsysteem voor biologisch onderzoek. C. elegans is echter niet volledig gebruikt in de biochemische studie van biologische reacties met behulp van zijn nucleaire extracten zoals in vitro transcriptie en DNA-replicatie. Een belangrijke hindernis voor het gebruik van C. elegans in biochemische studies is het verstoren van de dikke buitenste cuticula van de nematode zonder de activiteit van het nucleaire extract op te offeren. Hoewel verschillende methoden worden gebruikt om de nagelriem te breken, zoals Dounce-homogenisatie of ultrasoonapparaat, leiden ze vaak tot eiwitinstabiliteit. Er zijn geen vastgestelde protocollen voor het isoleren van actieve nucleaire eiwitten uit larven of volwassen C. elegans voor in vitro reacties. Hier beschrijft het protocol in detail de homogenisatie van larvale stadium 4 C. elegans met behulp van een Balch-homogenisator. De Balch-homogenisator gebruikt druk om de dieren langzaam door een smalle opening te dwingen die de cuticula breekt tijdens het proces. Het uniforme ontwerp en de nauwkeurige bewerking van de Balch-homogenisator maken een consistente slijping van dieren tussen experimenten mogelijk. Fractionering van het homogenaat verkregen uit de Balch-homogenisator levert functioneel actief nucleair extract op dat kan worden gebruikt in een in vitro methode voor het testen van de transcriptieactiviteit van C. elegans.

Het volgen van de geschetste stappen zou functioneel nucleair extract moeten opleveren (figuur 1), afwijking in de maal- of wasstappen kan leiden tot slechte activiteit of lage opbrengsten. Als functioneel C. elegans nucleair extract wordt verkregen, zal het het gebied stroomafwaarts van de CMV-promotor op het DNA-sjabloon transcriberen wanneer het wordt toegevoegd aan de eerder beschreven in vitro test. Het resulterende RNA-transcript kan ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription at JoVE.com

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het isoleren van actief nucleair extract uit larvale stadium 4 C. elegans en het visualiseren van transcriptieactiviteit in een in vitro systeem.

Isolatie van actief caenorhabditis elegans nucleair extract en reconstitutie voor in vitro transcriptie

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

Dit protocol vult een technische leemte op voor de biochemische studie van C.elegans en breidt hun nut als modelorganisme uit. Deze techniek is zowel eenvoudig als robuust, waardoor een consistente isolatie van functioneel actief C.elegans nucleair extract mogelijk is. Begin met het plaatsen van de gesynchroniseerde L1-dieren op 10 150 millimeter nematodengroeimedia-bevattende platen gezaaid met Escherichia coli OP50, en laat de dieren 48 uur groeien bij 20 graden Celsius totdat ze het L4-stadium bereiken.Zodra de hypotone en hypertone buffers zijn voorbereid, reinigt u de Balch-homogenisator door de maalkamer te overspoelen met 70% ethanol. Spoel vervolgens de kamer af met gedeïoniseerd water om de overtollige ethanol te verwijderen. Steek de wolfraamcarbidekogel in de maalkamer.Dek de uiteinden van het vat van de Balch-homogenisator af en zet de doppen vast met de meegeleverde duimschroeven. Bereid vervolgens vijf milliliter van de volledige hypotone en hypertone buffers per monster zoals beschreven in het tekstmanuscript. Vul vervolgens een steriele spuit van twee milliliter met één milliliter volledige hypotone buffer en spoel voorzichtig de maalkamer van de Balch-homogenisator, waardoor ongeveer 500 microliter volledige hypotone buffer in de kamer overblijft.Bewaar de gespoelde homogenisator op ijs en laat 30 minuten afkoelen. Verzamel de goed gevoede L4-dieren met M9-buffer in een conische buis van 15 milliliter en centrifugeer de dieren gedurende drie minuten op 1.000 keer g. Verwijder het supernatant en ga door met het wassen van de dierlijke pellet totdat het supernatant helder is.Was de dieren vervolgens met drie milliliter koude hypotone buffer en centrifugeer opnieuw zoals aangetoond. Voeg na het verwijderen van de supernatant hypotone buffer één milliliter volledige hypotone buffer toe aan de dierlijke pellet en breng de dierlijke suspensie over naar een nieuwe steriele spuit van twee milliliter. Voor het homogeniseren van de dieren die op ijs worden gehouden, duwt u de dieren voorzichtig door de maalkamer van de Balch-homogenisator geladen met de wolfraambal.Verzamel vervolgens de dieren terug in de spuit en herhaal deze procedure 30 keer. Na 30 cycli van homogenisatie verzamelt u de maximale dierlijke suspensie van de Balch-homogenisator en bewaart u de spuit met de punt naar beneden geplaatst in een microbuis van 1,7 milliliter. Verwijder de wolfraambal en maak de maalkamer schoon met gedeïoniseerd water.Droog en breng de bal terug naar de betreffende gelabelde buis. Steek vervolgens de wolfraamkogel met een diameter van 7,9880 millimeter en een opening van 12 micrometer in de slijpkamer en sluit de homogenisator opnieuw. Spoel de maalkamer opnieuw met één milliliter ijskoude complete hypotone buffer.Maal de ophanging 25 keer zoals aangetoond. Breng de dierlijke suspensie over in een schone microbuis van 1,7 milliliter en bewaar de suspensie op ijs. Pellet de dierenlichamen en het puin door centrifugeren.Pipetteer 40 microliter van het supernatant naar een buis die is gelabeld als ingangsfractie en bewaar de fractie op ijs. Breng het resterende supernatant over naar een nieuwe buis van 1,7 milliliter zonder de pellet te verstoren en centrifugeer om de kernen te pelleteren. Breng vervolgens het supernatant zonder de gepelleteerde kernen te verstoren over naar een nieuwe buis van 1,7 milliliter die is gelabeld als cytosolische fractie.Om de kernpellet te wassen, voegt u 500 microliter volledige hypotone buffer toe aan de pellet, suspensie van de pellet en centrifugeert u gedurende vijf minuten bij 4.000 maal g bij vier graden Celsius. Aan het einde van de centrifugatie resuspendeert u de nucleaire pellet in 500 microliter verse volledige hypotone buffer en centrifugeert u het monster opnieuw zoals aangetoond. Los vervolgens de pellet op in 40 microliter volledige hypertone buffer.Breng de nucleaire suspensie over naar een nieuwe buis van 1,7 milliliter met het label nucleaire fractie en sla deze op ijs op. Bepaal de eiwitconcentratie van drie fracties met behulp van een fluorescerende kwantificeringskit. Aliquot de nucleaire fracties in buizen voor eenmalig gebruik die zes microgram van het nucleaire eiwit bevatten, en snap freeze in droogijs en ethanolbad.Bewaar de monsters bij min 80 graden Celsius tot verder gebruik. De representatieve gelafbeelding toont de transcriptieproducten van Caenorhabditis elegans L4 larven nucleair extract met behulp van de CMV promotor DNA-sjabloon. De succesvolle isolatie van actieve nucleaire eiwitten resulteerde in een 132 basenpaarband na een in vitro transcriptie, en mislukte isolatie resulteerde in een zwakke band of de afwezigheid van een band.Vergeet niet om de volledige buffers duidelijk te labelen. Ongepaste buffers kunnen de functionaliteit van de nucleaire eiwitten schaden. Houd de homogenisator ook ijskoud om denaturering van de eiwitten te voorkomen.Door deze techniek te ontwikkelen, konden onderzoekers de snelheid van RNA-transcriptie van C.elegans tijdens stressvolle omstandigheden meten, waaruit bleek dat de transcriptiesnelheid van het dier kan veranderen afhankelijk van de omgevingsomstandigheden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolatie en respiratoire metingen van Mitochondria van Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Een eenvoudige methode voor High Throughput chemische Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Zuivering en reconstructie van TRPV1 spectroscopische p.a.

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Kleinschalige colorimetrische testen van intracellulaire lactaat en pyruvaat in de Nematode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plaat gebaseerde grootschalige teelt van Caenorhabditis elegans: bereiding van de monsters voor de studie van de metabole veranderingen bij Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstructie van het zelf-organiserende eiwit patronen op ondersteunde lipide Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolatie van fysiologisch actief thylakoiden en hun gebruik in energie-afhankelijke proteÃ¯ne vervoer Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Toepassing van Biolayer interferometrie (BLI) voor het bestuderen van eiwit-eiwit interacties in transcriptie

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Synthese van een Deuterated norm voor de kwantificering van 2-arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting voor de studie van eiwitinteracties in Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...