Name: isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription
Uploaded: 2021-08-11T14:00:00
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Ce travail a été soutenu par une subvention NIH MIRA (R35GM124678 à J. S.).

1. Préparations médiatiques
<ol><li>Préparez des plaques de gélose stériles en lysogénie (LB) et des milieux liquides en suivant les instructions du fabricant.</li>
	<li>Streak Escherichia coli (E. coli) souche OP50 sur une plaque de gélose LB. Incuber les bactéries à 37 °C pendant la nuit.</li>
	<li>Conserver la plaque de stries e. coli OP50 à 4 °C après l’incubation. La plaque E. coli OP50 peut être conservée en toute sécurité à 4 °C pendant 2 semaines si elle ...

<ol>
	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Blackwell, T. K., Walker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+mechanisms.">Transcription mechanisms.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-16 (2006).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-15 (2007).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+properties+of+the+Caenorhabditis+elegans+TATA-box-binding+protein.">Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+activation+of+transcription+by+UNC-86+and+MEC-3+in+Caenorhabditis+elegans+embryo+extracts.">Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts.</a> EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).</li><li>Shan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope-labeled+immunoassays+without+radiation+waste.">Isotope-labeled immunoassays without radiation waste.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).</li><li>Voss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+non-radioactive+eukaryotic+in+vitro+transcription+assay+for+sensitive+quantification+of+RNA+polymerase+II+activity.">A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity.</a> BMC Molecular Biology. 15, 7 (2014).</li><li>Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+Caenorhabditis+elegans+transcription+system.">A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87 (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Zbacnik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+buffers+in+protein+formulations.">Role of buffers in protein formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).</li></ol>

C. elegans est un organisme modèle attrayant pour étudier le système de transcription eucaryote en raison de son faible coût d’entretien et de la facilité de manipulation génétique. Ici, un protocole pour l’isolement cohérent de l’extrait nucléaire fonctionnellement actif de L4 C. elegans est décrit. Bien que ce protocole se soit concentré sur la visualisation de l’activité de transcription, l’ADNc produit post-transcriptionnellement peut être quantifié à l’aide de la RT-qPCR ...

Le petit nématode libre Caenorhabditis elegans est un organisme modèle simple mais puissant pour répondre à un large éventail de questions biologiques. Depuis son introduction en 1963, les nématodes ont été inestimables pour répondre aux questions de neurobiologie, de métabolisme, de vieillissement, de développement, d’immunité et de génétique1. Certaines des nombreuses caractéristiques de l’animal qui en font un organisme modèle idéal comprennent le temps de génération court, l’efficacité de l’interférence ARN, le corps transparent et les cartes complètes de sa lignée cellulaire et de son système nerveux.
Bien que les contributions du nématode à la science soient vastes, elles ont été sous-utilisées pour élucider le système de transcription eucaryote, la plupart de notre compréhension de ces mécanismes provenant d’études utilisant l’extrait nucléaire de levure, de mouche des fruits et de culture cellulaire de mammifères2. Le plus grand obstacle qui dissuade les chercheurs d’extraire de l’extrait nucléaire fonctionnel est la cuticule externe dure du nématode. Cet exosquelette comprend des collagènes réticulés, des cuticlines, des glycoprotéines et des lipides, ce qui rend C. elegans du stade larvaire à l’âge adulte résistant à l’extraction des protéines par des forces chimiques ou mécaniques3. Un système de transcription in vitro utilisant l’extrait nucléaire de C. elegans a déjà été développé mais n’a pas été largement adopté en raison de la portée limitée du système, et l’utilisation de l’homogénéisateur Dounce pour la préparation de l’extrait pourrait entraîner une instabilité des protéines4,5.
Contrairement au protocole précédent pour l’isolation des extraits nucléaires qui utilisait un homogénéisateur Dounce pour casser C. elegans, ce protocole utilise un homogénéisateur Balch. L’homogénéisateur Balch se compose de deux composants principaux: une bille en carbure de tungstène et un bloc en acier inoxydable avec un canal percé d’une extrémité à l’autre. L’homogénéisateur Balch est chargé avec la bille de carbure de tungstène et bouché de chaque côté pour sceller la chambre de broyage. Les seringues peuvent être chargées sur les deux orifices verticaux menant à la chambre de broyage. Lorsque le matériau est passé d’une seringue à l’autre à travers la chambre de broyage, la pression des seringues force le matériau à travers un espace étroit entre la bille et la paroi de la chambre. Cette pression lente et constante brise le matériau jusqu’à ce qu’il atteigne une taille constante capable de traverser facilement l’espace étroit. Forcer C. elegans à traverser l’étroit espace via une pression constante mais douce brise les animaux, libérant leur contenu dans le tampon environnant. Changer la taille des billes resserre encore l’écart, brisant les cellules nouvellement libérées et libérant les noyaux dans le tampon. De multiples cas de centrifugation séparent les noyaux du reste des débris cellulaires, ce qui permet la collecte d’un extrait nucléaire propre. L’homogénéisateur Balch est préféré à l’homogénéisateur Dounce pour plusieurs raisons : le système peut traiter un grand nombre d’animaux, ce qui permet d’extraire une grande quantité de protéines actives en une seule tentative ; l’usinage précis des billes et du bloc d’acier permet un meulage cohérent entre plusieurs échantillons; le bloc d’acier lourd agit comme un dissipateur de chaleur, éloignant uniformément la chaleur de la chambre de broyage, empêchant ainsi la dénaturation.
Après isolement, l’activité transcriptionnelle de l’extrait nucléaire doit être vérifiée avant d’être utilisée dans des expériences biochimiques. Traditionnellement, l’activité de transcription était mesurée à l’aide de nucléotides radiomarqués pour suivre et visualiser l’ARN nouvellement synthétisé. Cependant, l’étiquetage radioactif peut être fastidieux car il nécessite des précautions lors de l’utilisation et de l’élimination6. Les progrès technologiques permettent aux chercheurs d’aujourd’hui d’utiliser des méthodes beaucoup moins nocives ou gênantes pour mesurer même de petites quantités d’ARN à l’aide de techniques telles que la PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR)7. Ici, le protocole décrit une méthode pour isoler l’extrait nucléaire actif du stade larvaire 4 (L4) C. elegans et visualiser l’activité de transcription dans un système in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Consumables and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL 8-Strip Tubes &#38; Flat Strip Caps, Clear</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL Individual PCR tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-153G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL sterile microtubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-282S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% absolute molecular grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP2818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol, Koptec</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>&#160;V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm petri plates</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>&#160;T3325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;28-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL plastic syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Norm-Ject syringes</td>
			<td>Henke-Sass Wolf GmbH</td>
			<td>4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL vacuum filter cup 0.22 &#181;m PES, Stericup Millipore Express Plus</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Criterion</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;C7432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>&#160;CA3510-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol proof marker</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;90000-264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans</td>
			<td>CGC</td>
			<td>N2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;15508-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel stain, SYBR safe</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder mix, O&#8217;gene ruler</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Loading Dye, 6x TriTrack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;FERR1161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase, Baseline-ZERO</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;DB0715K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50 strain</td>
			<td>CGC</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe</td>
			<td>Promega</td>
			<td>&#160;E3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes Solution, 1 M Gibco</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 37%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypochlorite bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium weigh dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;02-202-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides, Vista vision</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>16004-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade water, Hypure</td>
			<td>Hyclone Laboratories</td>
			<td>&#160;SH30538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;N1638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR system, FailSafe with premix A</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;FS99100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P39111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein assay kit, Qubit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;Q33211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse transcription kit, Sensiscript</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction kit RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>&#160;N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;BDH9286-12KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;1-09137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filter with 0.2 &#181;m Polyethersulfone membrane</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>28145-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;200-334-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Forward 5&#8217;- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Reverse 5&#8217;- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C freezer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer</td>
			<td>Isobiotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, Eppendorf 5418 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5401000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, VWR Clinical 50</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82013-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope, Leica M80</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer, Qubit 2.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging system, iBright FL1500</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;A44241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>12621-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges, Eppendorf 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETBOY acu 2</td>
			<td>Integra</td>
			<td>155017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking platform</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription

Caenorhabditis elegans est un système modèle important pour la recherche biologique depuis son introduction en 1963. Cependant, C. elegans n’a pas été pleinement utilisé dans l’étude biochimique des réactions biologiques utilisant ses extraits nucléaires tels que la transcription in vitro et la réplication de l’ADN. Un obstacle important à l’utilisation de C. elegans dans les études biochimiques est de perturber l’épaisse cuticule externe du nématode sans sacrifier l’activité de l’extrait nucléaire. Bien que plusieurs méthodes soient utilisées pour casser la cuticule, telles que l’homogénéisation ou la sonication de Dounce, elles conduisent souvent à une instabilité des protéines. Il n’existe pas de protocole établi pour isoler les protéines nucléaires actives de la larve ou de C. elegans adulte pour les réactions in vitro . Ici, le protocole décrit en détail l’homogénéisation de C. elegans larvaire de stade 4 à l’aide d’un homogénéisateur Balch. L’homogénéisateur Balch utilise la pression pour forcer lentement les animaux à traverser un espace étroit brisant la cuticule dans le processus. La conception uniforme et l’usinage précis de l’homogénéisateur Balch permettent un meulage cohérent des animaux entre les expériences. Le fractionnement de l’homogénat obtenu à partir de l’homogénéisateur Balch donne un extrait nucléaire fonctionnellement actif qui peut être utilisé dans une méthode in vitro pour tester l’activité de transcription de C. elegans.

En suivant les étapes décrites devrait donner un extrait nucléaire fonctionnel (Figure 1), un écart dans les étapes de broyage ou de lavage peut entraîner une mauvaise activité ou de faibles rendements. Si l’extrait nucléaire fonctionnel de C. elegans est obtenu, il transcrira la région en aval du promoteur du CMV sur le gabarit d’ADN lorsqu’il sera ajouté au test in vitro décrit précédemment. Le transcrit d’ARN résult...

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Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour isoler l’extrait nucléaire actif de C. elegans au stade larvaire 4 et visualiser l’activité de transcription dans un système in vitro .

Isolement de l’extrait nucléaire actif de Caenorhabditis elegans et reconstitution pour la transcription in vitro

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

Ce protocole comble une lacune technique pour l’étude biochimique des C.elegans et élargit leur utilité en tant qu’organisme modèle. Cette technique est à la fois simple et robuste, permettant une isolation cohérente de l’extrait nucléaire de C.elegans fonctionnellement actif. Commencez par placer les animaux L1 synchronisés sur 10 plaques contenant des milieux de croissance de nématodes de 150 millimètres ensemencées avec Escherichia coli OP50, et laissez les animaux grandir pendant 48 heures à 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade L4.Une fois les tampons hypotoniques et hypertoniques préparés, nettoyez l’homogénéisateur Balch en inondant la chambre de broyage avec de l’éthanol à 70%. Rincez ensuite la chambre avec de l’eau désionisée pour éliminer l’excès d’éthanol. Insérez la bille de carbure de tungstène dans la chambre de broyage.Boucher les extrémités du canon de l’homogénéisateur Balch et fixer les bouchons avec les vis à molette fournies. Ensuite, préparez cinq millilitres des tampons hypotoniques et hypertoniques complets par échantillon, comme décrit dans le manuscrit du texte. Ensuite, remplissez une seringue stérile de deux millilitres avec un millilitre de tampon hypotonique complet et rincez doucement la chambre de broyage de l’homogénéisateur Balch, en laissant environ 500 microlitres de tampon hypotonique complet dans la chambre.Conservez l’homogénéisateur rincé sur de la glace et laissez-le refroidir pendant 30 minutes. Recueillir les animaux L4 bien nourris avec un tampon M9 dans un tube conique de 15 millilitres et centrifuger les animaux à 1 000 fois g pendant trois minutes. Retirez le surnageant et continuez à laver la pastille animale jusqu’à ce que le surnageant soit clair.Ensuite, lavez les animaux avec trois millilitres de tampon hypotonique froid et centrifugez à nouveau comme démontré. Après avoir retiré le tampon hypotonique surnageant, ajoutez un millilitre de tampon hypotonique complet à la pastille animale et transférez la suspension animale dans une nouvelle seringue stérile de deux millilitres. Pour homogénéiser les animaux gardés sur la glace, poussez doucement les animaux à travers la chambre de broyage de l’homogénéisateur Balch chargé de la boule de tungstène.Ensuite, récupérez les animaux dans la seringue et répétez cette procédure 30 fois. Après 30 cycles d’homogénéisation, prélever un maximum de suspension animale de l’homogénéisateur Balch et stocker la seringue avec la pointe positionnée vers le bas à l’intérieur d’un microtube de 1,7 millilitre. Retirez la bille de tungstène et nettoyez la chambre de broyage avec de l’eau désionisée.Sécher et retourner la balle dans le tube étiqueté respectif. Insérez ensuite la bille de tungstène de 7,9880 millimètres de diamètre et de 12 micromètres de dégagement dans la chambre de broyage et refermez l’homogénéisateur. Rincez à nouveau la chambre de broyage avec un millilitre de tampon hypotonique complet glacé.Broyer la suspension 25 fois comme démontré. Transférez la suspension animale dans un microtube propre de 1,7 millilitre et conservez la suspension sur de la glace. Abattez les corps et les débris des animaux par centrifugation.Pipette 40 microlitres du surnageant à un tube étiqueté comme fraction d’entrée, et stocker la fraction sur de la glace. Transférer le surnageant restant dans un nouveau tube de 1,7 millilitre sans perturber la pastille, et centrifuger pour granuler les noyaux. Transférez ensuite le surnageant sans perturber les noyaux en granulés dans un nouveau tube de 1,7 millilitre marqué comme fraction cytosolique.Pour laver la pastille de noyau, ajoutez 500 microlitres de tampon hypotonique complet à la pastille, suspendez la pastille et centrifugez à 4 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. À la fin de la centrifugation, remettre en suspension la pastille nucléaire dans 500 microlitres de tampon hypotonique complet frais, puis centrifuger à nouveau l’échantillon comme démontré. Dissoudre ensuite la pastille dans 40 microlitres de tampon hypertonique complet.Transférez la suspension nucléaire dans un nouveau tube de 1,7 millilitre étiqueté fraction nucléaire et stockez-la sur de la glace. Déterminez la concentration en protéines de trois fractions à l’aide d’un kit de quantification fluorescente. Aliquoter les fractions nucléaires dans des tubes à usage unique contenant six microgrammes de protéine nucléaire, et lyophiliser dans la glace sèche et le bain d’éthanol.Conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient utilisés ultérieurement. L’image de gel représentative montre les produits de transcription de l’extrait nucléaire des larves de Caenorhabditis elegans L4 à l’aide du modèle d’ADN promoteur du CMV. L’isolement réussi des protéines nucléaires actives a abouti à une bande de 132 paires de bases après une transcription in vitro, et un isolement infructueux a entraîné une bande faible ou l’absence d’une bande.N’oubliez pas d’étiqueter clairement les tampons complets. Des tampons inappropriés peuvent nuire à la fonctionnalité des protéines nucléaires. De plus, gardez l’homogénéisateur glacé au froid pour éviter la dénaturation des protéines.Le développement de cette technique a permis aux chercheurs de mesurer le taux de transcription de l’ARN de C.elegans dans des conditions stressantes, montrant que le taux de transcription de l’animal peut changer en fonction des conditions environnementales.

Research

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