Name: isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription
Uploaded: 2021-08-11T14:00:00
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Diese Arbeit wurde durch einen NIH MIRA-Zuschuss (R35GM124678 an J. S.) unterstützt.

1. Medienvorbereitungen
<ol><li>Bereiten Sie sterile Lysogenbrühe (LB) Agarplatten und flüssige Medien nach den Anweisungen des Herstellers vor.</li>
	<li>Streifen Escherichia coli (E. coli) Stamm OP50 auf einer LB-Agarplatte. Den Bakterienstreifen über Nacht bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Lagern Sie die E. coli OP50 Streifenplatte nach der Inkubation bei 4 °C. Die E. coli OP50 Platte kann sicher bei 4 °C für 2 Wochen gelagert werden, wenn sie in Parafolie eingewickelt ist, u...

<ol>
	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Blackwell, T. K., Walker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+mechanisms.">Transcription mechanisms.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-16 (2006).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-15 (2007).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+properties+of+the+Caenorhabditis+elegans+TATA-box-binding+protein.">Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+activation+of+transcription+by+UNC-86+and+MEC-3+in+Caenorhabditis+elegans+embryo+extracts.">Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts.</a> EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).</li><li>Shan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope-labeled+immunoassays+without+radiation+waste.">Isotope-labeled immunoassays without radiation waste.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).</li><li>Voss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+non-radioactive+eukaryotic+in+vitro+transcription+assay+for+sensitive+quantification+of+RNA+polymerase+II+activity.">A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity.</a> BMC Molecular Biology. 15, 7 (2014).</li><li>Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+Caenorhabditis+elegans+transcription+system.">A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87 (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Zbacnik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+buffers+in+protein+formulations.">Role of buffers in protein formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).</li></ol>

C. elegans ist ein attraktiver Modellorganismus zur Untersuchung des eukaryotischen Transkriptionssystems wegen seiner kostengünstigen Wartung und der Einfachkeit der genetischen Manipulation. Hier wird ein Protokoll zur konsistenten Isolierung von funktionell aktivem Kernextrakt aus L4 C. elegans beschrieben. Obwohl sich dieses Protokoll auf die Visualisierung der Transkriptionsaktivität konzentrierte, kann die posttranskriptionell produzierte cDNA mit RT-qPCR quantifiziert werden, um eine genauere M...

Der kleine, freilebende Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist ein einfacher, aber leistungsfähiger Modellorganismus zur Beantwortung einer Vielzahl biologischer Fragestellungen. Seit ihrer Einführung im Jahr 1963 sind die Nematoden von unschätzbarem Wert für die Beantwortung von Fragen der Neurobiologie, des Stoffwechsels, des Alterns, der Entwicklung, der Immunität und der Genetik1. Zu den vielen Eigenschaften des Tieres, die es zu einem idealen Modellorganismus machen, gehören die kurze Generationszeit, die Wirksamkeit der RNA-Interferenz, der transparente Körper und die vollständigen Karten seiner zellulären Abstammung und seines Nervensystems.
Während die Beiträge des Nematoden zur Wissenschaft enorm sind, wurden sie nicht ausreichend genutzt, um das eukaryotische Transkriptionssystem aufzuklären, wobei der größte Teil unseres Verständnisses über diese Mechanismen aus Studien stammt, die Kernextrakt aus Hefe, Fruchtfliege und Säugetierzellkultur verwenden2. Die größte Hürde, die Forscher davon abhält, funktionellen Kernextrakt zu extrahieren, ist die zähe äußere Kutikula des Nematoden. Dieses Exoskelett besteht aus vernetzten Kollagenen, Cuticlinen, Glykoproteinen und Lipiden, wodurch C. elegans vom Larvenstadium bis zum Erwachsenenalter resistent gegen die Proteinextraktion durch chemische oder mechanische Kräfte ist3. Ein In-vitro-Transkriptionssystem unter Verwendung von C. elegans-Kernextrakt wurde einst entwickelt, aber aufgrund des begrenzten Anwendungsbereichs des Systems nicht weit verbreitet, und die Verwendung eines Dounce-Homogenisators zur Herstellung des Extrakts könnte zu Proteininstabilität führen4,5.
Im Gegensatz zum vorherigen Protokoll zur Isolierung von Kernextrakten, bei dem ein Dounce-Homogenisator zum Brechen von C. elegans verwendet wurde, verwendet dieses Protokoll einen Balch-Homogenisator. Der Balch Homogenisator besteht aus zwei Hauptkomponenten: einer Hartmetallkugel und einem Edelstahlblock mit einem Kanal, der von einem Ende zum anderen durchbohrt ist. Der Balch Homogenisator wird mit der Hartmetallkugel beladen und auf beiden Seiten verschlossen, um die Mahlkammer abzudichten. Spritzen können auf die beiden vertikalen Ports geladen werden, die in die Mahlkammer führen. Wenn das Material durch die Mahlkammer von einer Spritze zur anderen geleitet wird, drückt der Druck der Spritzen das Material durch einen engen Spalt zwischen der Kugel und der Wand der Kammer. Dieser langsame und konstante Druck bricht das Material, bis es eine konstante Größe erreicht, die in der Lage ist, den engen Spalt leicht zu passieren. C . elegans durch einen konstanten, aber sanften Druck durch den engen Spalt zu zwingen, bricht die Tiere auf und gibt ihren Inhalt in den umgebenden Puffer ab. Das Umschalten der Kugelgrößen verschärft den Spalt weiter, bricht die neu freigesetzten Zellen auf und befreit die Kerne in den Puffer. Mehrere Fälle von Zentrifugation trennen die Kerne vom Rest der Zelltrümmer, was die Sammlung eines sauberen Kernextrakts ermöglicht. Der Balch-Homogenisator wird aus mehreren Gründen gegenüber dem Dounce-Homogenisator bevorzugt: Das System kann eine große Anzahl von Tieren verarbeiten, so dass es möglich ist, eine hohe Menge an aktiven Proteinen in einem einzigen Versuch zu extrahieren; die präzise Bearbeitung der Kugeln und des Stahlblocks ermöglicht ein gleichmäßiges Schleifen zwischen mehreren Proben; Der schwere Stahlblock wirkt wie ein Kühlkörper, der die Wärme gleichmäßig von der Mahlkammer ableitet und eine Denaturierung verhindert.
Nach der Isolierung muss die Transkriptionsaktivität des Kernextrakts überprüft werden, bevor sie in biochemischen Experimenten verwendet wird. Traditionell wurde die Transkriptionsaktivität mit radioaktiv markierten Nukleotiden gemessen, um die neu synthetisierte RNA zu verfolgen und zu visualisieren. Die radioaktive Markierung kann jedoch aufwändig sein, da sie während des Gebrauchs und der Entsorgung Vorsichtsmaßnahmen erfordert6. Technologische Fortschritte ermöglichen es Forschern heute, viel weniger schädliche oder lästige Methoden zu verwenden, um selbst kleine RNA-Größen mit Techniken wie der quantitativen Real-Time-PCR (qRT-PCR)7 zu messen. Hier beschreibt das Protokoll eine Methode zur Isolierung von aktivem Kernextrakt aus Larvenstadium 4 (L4) C. elegans und visualisierung der Transkriptionsaktivität in einem In-vitro-System.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Consumables and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL 8-Strip Tubes &#38; Flat Strip Caps, Clear</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL Individual PCR tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-153G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL sterile microtubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-282S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% absolute molecular grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP2818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol, Koptec</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>&#160;V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm petri plates</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>&#160;T3325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;28-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL plastic syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Norm-Ject syringes</td>
			<td>Henke-Sass Wolf GmbH</td>
			<td>4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL vacuum filter cup 0.22 &#181;m PES, Stericup Millipore Express Plus</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Criterion</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;C7432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>&#160;CA3510-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol proof marker</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;90000-264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans</td>
			<td>CGC</td>
			<td>N2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;15508-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel stain, SYBR safe</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder mix, O&#8217;gene ruler</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Loading Dye, 6x TriTrack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;FERR1161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase, Baseline-ZERO</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;DB0715K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50 strain</td>
			<td>CGC</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe</td>
			<td>Promega</td>
			<td>&#160;E3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes Solution, 1 M Gibco</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 37%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypochlorite bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium weigh dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;02-202-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides, Vista vision</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>16004-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade water, Hypure</td>
			<td>Hyclone Laboratories</td>
			<td>&#160;SH30538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;N1638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR system, FailSafe with premix A</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;FS99100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P39111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein assay kit, Qubit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;Q33211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse transcription kit, Sensiscript</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction kit RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>&#160;N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;BDH9286-12KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;1-09137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filter with 0.2 &#181;m Polyethersulfone membrane</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>28145-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;200-334-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Forward 5&#8217;- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Reverse 5&#8217;- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C freezer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer</td>
			<td>Isobiotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, Eppendorf 5418 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5401000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, VWR Clinical 50</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82013-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope, Leica M80</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer, Qubit 2.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging system, iBright FL1500</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;A44241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>12621-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges, Eppendorf 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETBOY acu 2</td>
			<td>Integra</td>
			<td>155017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking platform</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription

Caenorhabditis elegans ist seit seiner Einführung im Jahr 1963 ein wichtiges Modellsystem für die biologische Forschung. C. elegans wurde jedoch nicht vollständig in der biochemischen Untersuchung biologischer Reaktionen unter Verwendung seiner Kernextrakte wie In-vitro-Transkription und DNA-Replikation eingesetzt. Eine wesentliche Hürde für die Verwendung von C. elegans in biochemischen Studien ist die Störung der dicken äußeren Kutikula des Fadenwurms, ohne die Aktivität des Kernextrakts zu beeinträchtigen. Während mehrere Methoden verwendet werden, um die Kutikula zu brechen, wie z.B. Dounce-Homogenisierung oder Beschallung, führen sie oft zu Proteininstabilität. Es gibt keine etablierten Protokolle für die Isolierung aktiver Kernproteine aus Larven oder erwachsenen C. elegans für In-vitro-Reaktionen . Hier beschreibt das Protokoll detailliert die Homogenisierung von Larvenstadium 4 C. elegans unter Verwendung eines Balch-Homogenisators. Der Balch-Homogenisator verwendet Druck, um die Tiere langsam durch eine enge Lücke zu zwingen, die dabei die Nagelhaut bricht. Das einheitliche Design und die präzise Bearbeitung des Balch Homogenisators ermöglichen ein gleichmäßiges Schleifen der Tiere zwischen den Versuchen. Die Fraktionierung des aus dem Balch-Homogenisator erhaltenen Homogenats ergibt einen funktionell aktiven Kernextrakt, der in einer In-vitro-Methode zur Bestimmung der Transkriptionsaktivität von C. elegans verwendet werden kann.

Die Einhaltung der skizzierten Schritte sollte funktionellen Kernextrakt ergeben (Abbildung 1), Abweichungen in den Mahl- oder Waschschritten können zu schlechter Aktivität oder geringen Ausbeuten führen. Wenn funktioneller C. elegans-Kernextrakt erhalten wird, transkribiert er die Region stromabwärts des CMV-Promotors auf der DNA-Vorlage, wenn er dem zuvor beschriebenen In-vitro-Assay hinzugefügt wird. Das resultierende RNA-Transkript...

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Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von aktivem Kernextrakt aus Larvenstadium 4 C. elegans und visualisierung der Transkriptionsaktivität in einem in vitro System.

Isolierung von aktivem Caenorhabditis elegans Kernextrakt und Rekonstitution für in vitro Transkription

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

Dieses Protokoll füllt eine technische Lücke für die biochemische Untersuchung von C.elegans und erweitert ihre Nützlichkeit als Modellorganismus. Diese Technik ist sowohl einfach als auch robust und ermöglicht eine konsistente Isolierung von funktionell aktivem C.elegans-Kernextrakt. Legen Sie zunächst die synchronisierten L1-Tiere auf 10 150-Millimeter-Nematoden-Wachstumsmedienplatten, die mit Escherichia coli OP50 ausgesät sind, und lassen Sie die Tiere 48 Stunden bei 20 Grad Celsius wachsen, bis sie das L4-Stadium erreichen.Sobald die hypotonen und hypertonen Puffer vorbereitet sind, reinigen Sie den Balch-Homogenisator, indem Sie die Mahlkammer mit 70% Ethanol überfluten. Dann spülen Sie die Kammer mit entionisiertem Wasser ab, um das überschüssige Ethanol zu entfernen. Setzen Sie die Hartmetallkugel in die Mahlkammer ein.Schließen Sie die Enden des Fasses des Balch Homogenisators ab und sichern Sie die Kappen mit den mitgelieferten Rändelschrauben. Bereiten Sie dann fünf Milliliter der vollständigen hypotonen und hypertonen Puffer pro Probe vor, wie im Textmanuskript beschrieben. Als nächstes füllen Sie eine sterile Zwei-Milliliter-Spritze mit einem Milliliter vollständigem hypotonischen Puffer und spülen Sie vorsichtig die Mahlkammer des Balch-Homogenisators, wobei etwa 500 Mikroliter des vollständigen hypotonischen Puffers in der Kammer verbleiben.Bewahren Sie den gespülten Homogenisator auf Eis auf und lassen Sie ihn 30 Minuten abkühlen. Sammeln Sie die gut gefütterten L4-Tiere mit M9-Puffer in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Tiere drei Minuten lang bei 1.000 g. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Tierpellet weiter, bis der Überstand klar ist.Als nächstes waschen Sie die Tiere mit drei Millilitern kaltem hypotonen Puffer und zentrifugieren Sie erneut wie gezeigt. Nachdem Sie den überstehenden hypotonischen Puffer entfernt haben, fügen Sie dem Tierpellet einen Milliliter vollständigen hypotonischen Puffer hinzu und übertragen Sie die Tierische Suspension auf eine neue sterile Zwei-Milliliter-Spritze. Um die auf Eis gehaltenen Tiere zu homogenisieren, schieben Sie die Tiere vorsichtig durch die Mahlkammer des mit der Wolframkugel beladenen Balch-Homogenisators.Sammeln Sie dann die Tiere wieder in der Spritze und wiederholen Sie diesen Vorgang 30 Mal. Sammeln Sie nach 30 Homogenisierungszyklen die maximale Tiersuspension aus dem Balch-Homogenisator und lagern Sie die Spritze mit der Spitze nach unten in einem 1,7-Milliliter-Mikroröhrchen. Entfernen Sie die Wolframkugel und reinigen Sie die Mahlkammer mit entionisiertem Wasser.Trocknen Sie die Kugel und geben Sie sie in das jeweils beschriftete Rohr zurück. Setzen Sie dann die Wolframkugel mit einem Durchmesser von 7,9880 Millimetern und einem Spaltabstand von 12 Mikrometern in die Mahlkammer ein und verschließen Sie den Homogenisator erneut. Spülen Sie die Mahlkammer erneut mit einem Milliliter eiskaltem hypotonischem Puffer.Schleifen Sie die Suspension 25 Mal wie gezeigt. Geben Sie die Tierische Suspension in ein sauberes 1,7-Milliliter-Mikroröhrchen und lagern Sie die Suspension auf Eis. Pellet entlang der Tierkörper und Trümmer durch Zentrifugation.40 Mikroliter des Überstandes in ein als Eingangsfraktion bezeichnetes Röhrchen pipettieren und die Fraktion auf Eis speichern. Den verbleibenden Überstand in ein neues 1,7-Milliliter-Röhrchen überführen, ohne das Pellet zu stören, und die Kerne zentrifugieren. Dann übertragen Sie den Überstand, ohne die pelletierten Kerne zu stören, in ein neues 1,7-Milliliter-Röhrchen, das als zytosolische Fraktion gekennzeichnet ist.Um das Kernpellet zu waschen, fügen Sie dem Pellet 500 Mikroliter vollständigen hypotonischen Puffer hinzu, suspendieren Sie das Pellet und zentrifugieren Sie bei 4.000 mal g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Am Ende der Zentrifugation resuspendieren Sie das Kernpellet in 500 Mikrolitern frischem, vollständigem hypotonischen Puffer und zentrifugieren Sie die Probe erneut wie demonstriert. Dann lösen Sie das Pellet in 40 Mikrolitern vollständigem hypertonen Puffer auf.Übertragen Sie die Kernsuspension in ein neues 1,7-Milliliter-Rohr mit der Bezeichnung Kernfraktion und lagern Sie es auf Eis. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration von drei Fraktionen mit einem fluoreszierenden Quantifizierungskit. Aliquotieren Sie die Kernfraktionen in Einwegröhrchen, die sechs Mikrogramm des Kernproteins enthalten, und schockieren Sie im Trockeneis- und Ethanolbad.Lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung. Das repräsentative Gelbild zeigt die Transkriptionsprodukte von Caenorhabditis elegans L4 Larven Kernextrakt unter Verwendung der CMV Promotor DNA Template. Die erfolgreiche Isolierung aktiver Kernproteine führte nach einer In-vitro-Transkription zu einer 132-Basenpaar-Bande, und eine erfolglose Isolierung führte zu einer schwachen Bande oder dem Fehlen einer Bande.Denken Sie daran, die vollständigen Puffer deutlich zu beschriften. Ungeeignete Puffer können die Funktionalität der Kernproteine beeinträchtigen. Halten Sie den Homogenisator auch eiskalt, um eine Denaturierung der Proteine zu verhindern.Die Entwicklung dieser Technik ermöglichte es den Forschern, die Rate der RNA-Transkription von C. elegans unter stressigen Bedingungen zu messen, was zeigt, dass sich die Transkriptionsrate des Tieres je nach Umweltbedingungen ändern kann.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation und Atemwege Messungen der Mitochondrien von Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Forschung

Biochemie

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Kleinräumige farbmetrischen Assays der intrazellulären Laktat und Pyruvat in den Fadenwurm Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Platte-basierte Large-Scale Anbau von Caenorhabditis Elegans: Probenvorbereitung für die Studie von Stoffwechselveränderungen bei Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In-vitro- Rekonstitution der selbstorganisierenden Proteinmuster auf unterstützten Lipid Bilayer

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolierung des physiologisch aktiven Thylakoids und deren Einsatz in Energie-abhängige Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Anwendung der Biolayer-Interferometrie (BLI) zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen bei der Transkription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Synthese eines deuterated Standards zur Quantifizierung von 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting zur Untersuchung von Protein-Wechselwirkungen bei Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...