Name: isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription
Uploaded: 2021-08-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH MIRA (R35GM124678 ל- J. S. ).

1. הכנות לתקשורת
<ol><li>הכן צלחות אגר ציר ליסוגניים סטריליות (LB) ומדיה נוזלית בהתאם להוראות היצרן.</li>
	<li>פס Escherichia coli (E. coli) זן OP50 על צלחת אגר LB. לדגור את פס החיידקים ב 37 °C (50 °F) לילה.</li>
	<li>אחסן את צלחת פס E. coli OP50 ב 4 °C (7 °F) לאחר הדגירה. צלחת E. coli OP50 ניתן לאחסן בבטחה ב 4 °C (70 °F) במשך 2...

<ol>
	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Blackwell, T. K., Walker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+mechanisms.">Transcription mechanisms.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-16 (2006).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-15 (2007).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+properties+of+the+Caenorhabditis+elegans+TATA-box-binding+protein.">Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+activation+of+transcription+by+UNC-86+and+MEC-3+in+Caenorhabditis+elegans+embryo+extracts.">Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts.</a> EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).</li><li>Shan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope-labeled+immunoassays+without+radiation+waste.">Isotope-labeled immunoassays without radiation waste.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).</li><li>Voss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+non-radioactive+eukaryotic+in+vitro+transcription+assay+for+sensitive+quantification+of+RNA+polymerase+II+activity.">A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity.</a> BMC Molecular Biology. 15, 7 (2014).</li><li>Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+Caenorhabditis+elegans+transcription+system.">A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87 (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Zbacnik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+buffers+in+protein+formulations.">Role of buffers in protein formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).</li></ol>

C. elegans הוא אורגניזם מודל מושך ללמוד את מערכת התמלול האוקריוטית בגלל התחזוקה הזולה שלה ואת הקלות של מניפולציה גנטית. כאן פרוטוקול לבידוד עקבי של תמצית גרעינית פעילה מבחינה תפקודית מ L4 C. elegans מתואר. למרות שפרוטוקול זה התמקד בהדמיית פעילות התמלול, ניתן לכמת את ה- cDNA שהופק לאחר שעתוק ב...

הנמטודה הקטנה, החיה החופשית Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל פשוט אך רב עוצמה לטיפול במגוון רחב של שאלות ביולוגיות. מאז הצגתו בשנת 1963, הנמטודות היו יקרות ערך לענות על שאלות נוירוביולוגיה, חילוף החומרים, הזדקנות, התפתחות, חסינות, וגנטיקה1. חלק מהמאפיינים הרבים של החיה שהופכים אותו לאורגניזם מודל אידיאלי כוללים זמן דור קצר, האפקטיביות של הפרעות RNA, גוף שקוף, ואת המפות הושלמו של שושלת התאים שלה ומערכת העצבים.
בעוד שתרומת הנמטודה למדע היא עצומה, הם נוצלו פחות כדי להדגיש את מערכת התמלול האוקריוטית, כאשר רוב הבנתנו לגבי מנגנונים אלה מגיעה ממחקרים המשתמשים בתמצית גרעינית של שמרים, זבובי פירות ותרבות תאי יונקים2. המשוכה הגדולה ביותר שמניאת את החוקרים מחילוצת תמצית גרעינית תפקודית היא הגוון החיצוני הקשוח של הנמטודה. שלד חיצוני זה כולל קולגנים מקושרים, חותך, גליקופרוטאין ושומנים, מה שהופך את C. elegans משלב הזחל לבגרות עמידים להפקת חלבונים באמצעות כוחות כימיים או מכניים3. מערכת תמלול במבחנה באמצעות תמצית גרעינית C. elegans פותחה בעבר אך לא אומצה באופן נרחב בשל ההיקף המוגבל של המערכת, והשימוש בהומוגניזר Dounce להכנת התמצית עלול להוביל לחוסר יציבות בחלבון4,5.
שלא כמו הפרוטוקול הקודם לבידוד תמצית גרעינית אשר השתמש homogenizer Dounce לשבור C. elegans, פרוטוקול זה משתמש homogenizer Balch. ההומוגניזר Balch מורכב משני מרכיבים עיקריים: כדור קרביד טונגסטן ובלוק נירוסטה עם ערוץ משועמם דרך מקצה לקצה. ההומוג'ייזר Balch טעון עם כדור קרביד טונגסטן וכתרים משני הצדדים כדי לאטום את תא הטחינה. מזרקים ניתן לטעון על שתי היציאות האנכיות המובילות לתא הטחינה. כאשר החומר מועבר ממזרק אחד לשני דרך תא הטחינה, הלחץ מהמזרקים מאלץ את החומר דרך רווח צר בין הכדור לקיר התא. לחץ איטי וקבוע זה שובר את החומר עד שהוא מגיע לגודל עקבי המסוגל לעבור דרך הפער הצר בקלות. אילוץ C. elegans דרך הפער הצר באמצעות לחץ מתמיד אך עדין שובר את בעלי החיים פתוח, שחרור התוכן שלהם לתוך חוצץ שמסביב. החלפת גדלי הכדור מהדקת עוד יותר את הפער, שוברת את התאים החדשים ששוחררו ומשחררת את הגרעינים לתוך המאגר. מקרים מרובים של צנטריפוגה מפרידים את הגרעינים משאר פסולת התא, ומאפשרים איסוף של תמצית גרעינית נקייה. הומוגניזר Balch מועדף על פני homogenizer Dounce מכמה סיבות: המערכת יכולה להתמודד עם מספר רב של בעלי חיים, מה שמאפשר לחלץ כמות גבוהה של חלבונים פעילים בניסיון אחד; עיבוד מדויק של הכדורים ואת בלוק הפלדה מאפשר שחיקה עקבית בין דגימות מרובות; בלוק הפלדה הכבדה משמש ככיור חום, מושך חום באופן אחיד מתא הטחינה, ומונע דנטורינג.
לאחר הבידוד, יש לאמת את פעילות התמלול של התמלול של התמליל של התמצית הגרעינית לפני השימוש בניסויים ביוכימיים כלשהם. באופן מסורתי, פעילות שעתוק נמדדה באמצעות נוקלאוטידים עם תווית רדיו כדי לעקוב ולדמיין את הרנ"א המסונתז החדש. עם זאת, תיוג רדיואקטיבי יכול להיות מעיק כפי שהוא דורש זהירות במהלך השימוש וסילוק6. ההתקדמות הטכנולוגית מאפשרת לחוקרים כיום להשתמש בשיטות הרבה פחות מזיקות או בעייתיות כדי למדוד אפילו כמויות RNA קטנות באמצעות טכניקות כגון PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR)7. כאן, הפרוטוקול מתאר שיטה לבודד תמצית גרעינית פעילה משלב זחל 4 (L4) C. elegans ולדמיין פעילות שעתוק במערכת במבחנה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Consumables and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL 8-Strip Tubes &#38; Flat Strip Caps, Clear</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL Individual PCR tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-153G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL sterile microtubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-282S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% absolute molecular grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP2818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol, Koptec</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>&#160;V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm petri plates</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>&#160;T3325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;28-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL plastic syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Norm-Ject syringes</td>
			<td>Henke-Sass Wolf GmbH</td>
			<td>4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL vacuum filter cup 0.22 &#181;m PES, Stericup Millipore Express Plus</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Criterion</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;C7432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>&#160;CA3510-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol proof marker</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;90000-264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans</td>
			<td>CGC</td>
			<td>N2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;15508-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel stain, SYBR safe</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder mix, O&#8217;gene ruler</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Loading Dye, 6x TriTrack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;FERR1161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase, Baseline-ZERO</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;DB0715K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50 strain</td>
			<td>CGC</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe</td>
			<td>Promega</td>
			<td>&#160;E3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes Solution, 1 M Gibco</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 37%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypochlorite bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium weigh dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;02-202-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides, Vista vision</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>16004-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade water, Hypure</td>
			<td>Hyclone Laboratories</td>
			<td>&#160;SH30538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;N1638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR system, FailSafe with premix A</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;FS99100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P39111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein assay kit, Qubit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;Q33211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse transcription kit, Sensiscript</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction kit RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>&#160;N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;BDH9286-12KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;1-09137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filter with 0.2 &#181;m Polyethersulfone membrane</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>28145-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;200-334-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Forward 5&#8217;- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Reverse 5&#8217;- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C freezer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer</td>
			<td>Isobiotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, Eppendorf 5418 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5401000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, VWR Clinical 50</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82013-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope, Leica M80</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer, Qubit 2.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging system, iBright FL1500</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;A44241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>12621-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges, Eppendorf 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETBOY acu 2</td>
			<td>Integra</td>
			<td>155017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking platform</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription

Caenorhabditis elegans היה מערכת מודל חשוב למחקר ביולוגי מאז הוצג בשנת 1963. עם זאת, C. elegans לא נוצל באופן מלא במחקר הביוכימי של תגובות ביולוגיות באמצעות תמציות גרעיניות שלה כגון תמלול במבחנה ושכפול DNA. משוכה משמעותית לשימוש C. elegans במחקרים ביוכימיים היא לשבש את החתך החיצוני העבה של הנמטודה מבלי להקריב את הפעילות של התמצית הגרעינית. בעוד מספר שיטות משמשות כדי לשבור את הקיטור, כגון הומוגניזציה Dounce או sonication, הם לעתים קרובות להוביל חוסר יציבות חלבון. אין פרוטוקולים מבוססים לבידוד חלבונים גרעיניים פעילים מזחלים או C. elegans למבוגרים לתגובות במבחנה . כאן, הפרוטוקול מתאר בפירוט את ההומוגניזציה של שלב זחל 4 C. elegans באמצעות הומוגניזר Balch. ההומוגניזר הבלץ' משתמש בלחץ כדי לאלץ את בעלי החיים באיטיות לעבור פער צר ששובר את הקיטור בתהליך. העיצוב האחיד והעיצוב המדויק של ההומוגניזר בלך מאפשרים שחיקה עקבית של בעלי חיים בין ניסויים. פירוק ההומוגנית המתקבלת מההומוגניזר Balch מניבה תמצית גרעינית פעילה מבחינה תפקודית שניתן להשתמש בה בשיטת מבחנה לבדיקת פעילות שעתוק של C. elegans.

בעקבות הצעדים המתוארים אמור להניב תמצית גרעינית תפקודית (איור 1),סטייה בשלבי השחיקה או הכביסה עלולה להוביל לפעילות לקויה או לתפוקות נמוכות. אם תתקבל תמצית גרעינית פונקציונלית C. elegans , זה יהיה לתמלל את האזור במורד הזרם של מקדם CMV על תבנית ה- DNA כאשר נוסף ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription at JoVE.com

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לבידוד תמצית גרעינית פעילה משלב זחל 4 C. elegans והדמיה של פעילות שעתוק במערכת במבחנה .

בידוד של תמצית גרעינית פעילה של Caenorhabditis elegans ו reconstitution עבור תמלול במבחנה

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

פרוטוקול זה ממלא פער טכני למחקר הביוכימי של C.elegans ומרחיב את התועלת שלהם כאורגניזם מודל. טכניקה זו היא פשוטה וחזקה, ומאפשרת בידוד עקבי של תמצית גרעינית C.elegans פעילה מבחינה תפקודית. התחל על ידי הצבת בעלי החיים L1 מסונכרנים על 10 150 מ"מ נמטודה צמיחה צלחות המכילות מדיה זרעים עם Escherichia coli OP50, ולאפשר לבעלי החיים לגדול במשך 48 שעות ב 20 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים לשלב L4.ברגע המאגרים ההיפוטוניים וההיפרטוניים מוכנים, לנקות את homogenizer Balch על ידי הצפת תא הטחינה עם 70%אתנול. לאחר מכן לשטוף את החדר עם מים deionized כדי להסיר את האתנול עודף. מכניסים את כדור הקרביד טונגסטן לתא הטחינה.כיסו את קצות החבית של הבלך הומוגניזר, ואבטחו את הפקקים עם הנוגדיים שסופקו. לאחר מכן הכינו חמישה מיליליטרים של המאגרים ההיפוטוניים וההיפרטוניים המלאים לדגימה כמתואר בכתב היד של הטקסט. לאחר מכן מלא מזרק סטרילי, שני מיליליטר עם מיליליטר אחד של חוצץ היפוטוני מלא, בעדינות לשטוף את חדר הטחינה של homogenizer Balch, משאיר כ 500 microliters של חיץ היפוטוני מלא בתא.לאחסן את homogenizer הסמוקים על קרח, ולתת לו להתקרר במשך 30 דקות. לאסוף את בעלי החיים L4 המוזנים היטב עם חוצץ M9 בצינור חרוט 15 מיליליטר, וצנטריפוגה החיות ב 1, 000 פעמים g במשך שלוש דקות. הסר את supernatant, ולהמשיך לשטוף את גלולה בעלי חיים עד supernatant הוא ברור.לאחר מכן לשטוף את החיות עם שלושה מיליליטר של חוצץ היפוטוני קר, וצנטריפוגה שוב כפי שהוכח. לאחר הסרת המאגר ההיפוטוני העל-טבעי, הוסיפו מיליליטר אחד של חיץ היפוטוני מלא לכדור החי, והעבירו את ההשעיה של בעלי החיים למזרק סטרילי חדש, שני מיליליטר. להומוגניזציה בעלי החיים המשיכו על הקרח, דחפו בעדינות את החיות דרך תא הטחינה של ההומוגניזר הבלך טעון בכדור טונגסטן.ואז לאסוף את החיות בחזרה במזרק, ולחזור על הליך זה 30 פעמים. לאחר 30 מחזורים של הומוגניזציה, לאסוף השעיה בעלי חיים מקסימלית מן homogenizer Balch, ולאחסן את המזרק עם הקצה ממוקם כלפי מטה בתוך microtube 1.7 מיליליטר. מוציאים את כדור הטונגסטן, ומנקים את תא הטחינה במים מתובלים.יבש ולהחזיר את הכדור לצינור המסומן בהתאמה. לאחר מכן הכנס את כדור הטונגסטן בקוטר 7.9880 מילימטר ופינוי פער של 12 מיקרומטר לתא הטחינה, ונחתום מחדש את ההומוגניזר. לשטוף את תא הטחינה שוב עם מיליליטר אחד של חיץ היפוטוני שלם קר כקרח.טוחנים את המתלים 25 פעמים כפי שהודגם. מעבירים את ההשעיה של החיה למיקרו-צינור נקי של 1.7 מיליליטר, ומאחסנים את המתלים על הקרח. גלולה את גופות בעלי החיים ופסולת על ידי צנטריפוגה.פיפט 40 מיקרוליטרים של הסופר-נט לצינור המסומן כשבר קלט, ומאחסנים את השבר על הקרח. מעבירים את הסופר-נט הנותר לצינור חדש של 1.7 מיליליטר מבלי להפריע לכדור, וצנטריפוגה כדי לגלגל את הגרעינים. לאחר מכן העבר את supernatant מבלי להפריע גרעינים גלולה לצינור חדש 1.7 מיליליטר מסומן כמו שבר ציטוסולי.כדי לשטוף את גלולה גרעינים, להוסיף 500 microliters של חוצץ היפוטוני מלא לכדור, להשעות את הכדור, וצנטריפוגה ב 4, 000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. בסוף הצנטריפוגה, resuspend הכדור הגרעיני ב 500 microliters של חיץ היפוטוני מלא טרי, ושוב צנטריפוגה המדגם כפי שהוכח. ואז להמיס את הכדור ב 40 microliters של חיץ היפרטוני מלא.העבר את ההשעיה הגרעינית לצינור חדש 1.7 מיליליטר שכותרתו שבר גרעיני, ולאחסן אותו על קרח. קבעו את ריכוז החלבון של שלושה שברים באמצעות ערכת כימות פלואורסצנטית. Aliquot שברים גרעיניים לתוך צינורות חד פעמיים המכילים שישה מיקרוגרם של החלבון הגרעיני, ולהישבר קפוא בקרח יבש ואמבט אתנול.לאחסן את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. תמונת הג'ל הייצוגית מציגה את מוצרי התמלול של תמצית גרעינית זחלי L4 של Caenorhabditis elegans L4 באמצעות תבנית ה- DNA של מקדם CMV. הבידוד המוצלח של חלבונים גרעיניים פעילים הביא ללהקת זוגות בסיסים של 132 לאחר תמלול במבחנה, ובידוד לא מוצלח הביא ללהקה חלשה או להיעדר להקה.זכור לתייג בבירור את המאגרים המלאים. מאגרים לא הולמים עלולים לפגוע בפונקציונליות של החלבונים הגרעיניים. כמו כן, לשמור על קר קרח הומוגניזר כדי למנוע denaturing של החלבונים.פיתוח טכניקה זו אפשר לחוקרים למדוד את קצב שעתוק הרנ"א של C.elegans בתנאים מלחיצים, והראה כי קצב התמלול של החיה יכול להשתנות בהתאם לתנאי הסביבה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

בידוד, מדידות הנשימה של המיטוכונדריה מ תודרנית לבנה

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

טיהור, בנייתו מחדש של TRPV1 לניתוח Spectroscopic

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

ערכי צבע מוחלטים מבחני של תאיים לקטט בקנה מידה קטן ו פירובט ב נמטודות Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

מבוסס על צלחת Large-scale טיפוח Caenorhabditis elegans: הכנת הדוגמא על המחקר של שינויים מטבוליים בחולי סוכרת

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

במבחנה בנייתו מחדש של דפוסי חלבון ב- Bilayers הנתמכים השומנים ארגון-עצמי

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

בידוד של פעיל מבחינה פיזיולוגית Thylakoids, השימוש בהם במסגרת מבחני תחבורה אנרגיה תלוית חלבון

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

יישום של ביואולייר אינטרפרומטריה (בלי) ללימוד אינטראקציות חלבונים-חלבונים בתמלול

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

סינתזה של תקן שניוני לקוונפיקציה של 2-ארכידליגליליצרול באוקנאבאבדיטיס

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

ב Vivo הידרוקסיל חלבון רדיקלי מדפיס הדפסה לחקר אינטראקציות חלבונים באלבוראבאבדיטיס האלאים

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...