Name: isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription
Uploaded: 2021-08-11T14:00:00
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1. मीडिया की तैयारी
<ol><li>निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए बाँझ लाइसोजेनी शोरबा (एलबी) आगर प्लेटों और तरल मीडिया तैयार करें।</li>
	<li>लकीर Escherichia कोलाई (ई कोलाई) एक एलबी आगर प्लेट पर तनाव OP50. रात भर 37 डिग?...

<ol>
	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Blackwell, T. K., Walker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+mechanisms.">Transcription mechanisms.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-16 (2006).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-15 (2007).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+properties+of+the+Caenorhabditis+elegans+TATA-box-binding+protein.">Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+activation+of+transcription+by+UNC-86+and+MEC-3+in+Caenorhabditis+elegans+embryo+extracts.">Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts.</a> EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).</li><li>Shan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope-labeled+immunoassays+without+radiation+waste.">Isotope-labeled immunoassays without radiation waste.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).</li><li>Voss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+non-radioactive+eukaryotic+in+vitro+transcription+assay+for+sensitive+quantification+of+RNA+polymerase+II+activity.">A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity.</a> BMC Molecular Biology. 15, 7 (2014).</li><li>Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+Caenorhabditis+elegans+transcription+system.">A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87 (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Zbacnik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+buffers+in+protein+formulations.">Role of buffers in protein formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).</li></ol>

C. elegans यूकेरियोटिक प्रतिलेखन प्रणाली का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल जीव है क्योंकि इसकी कम लागत वाले रखरखाव और आनुवंशिक हेरफेर में आसानी है। यहाँ L4 C. elegans से कार्यात्मक रूप से सक्रिय परमाणु नि?...

छोटे, मुक्त रहने वाले नेमाटोड Caenorhabditis elegans जैविक प्रश्नों की एक विस्तृत श्रृंखला को संबोधित करने के लिए एक सरल अभी तक शक्तिशाली मॉडल जीव है। 1963 में इसकी शुरुआत के बाद से, नेमाटोड न्यूरोबायोलॉजी, चयापचय, उम्र बढ़ने, विकास, प्रतिरक्षा और आनुवंशिकी में सवालों के जवाब देने के लिए अमूल्य रहे हैं। जानवर की कई विशेषताओं में से कुछ जो इसे एक आदर्श मॉडल जीव बनाते हैं, उनमें छोटी पीढ़ी का समय, आरएनए हस्तक्षेप की प्रभावशीलता, पारदर्शी शरीर और इसके सेलुलर वंश और तंत्रिका तंत्र दोनों के पूर्ण नक्शे शामिल हैं।
जबकि विज्ञान में सूत्रकृमि का योगदान विशाल है, उन्हें यूकेरियोटिक प्रतिलेखन प्रणाली को स्पष्ट करने के लिए कम उपयोग किया गया है, इन तंत्रों के बारे में हमारी अधिकांश समझ खमीर, फल मक्खी और स्तनधारी सेल कल्चर 2 से परमाणु अर्क का उपयोग करके अध्ययन से आ रही है। सबसे बड़ी बाधा जो शोधकर्ताओं को कार्यात्मक परमाणु अर्क निकालने से रोकती है, वह नेमाटोड की कठिन बाहरी छल्ली है। इस एक्सोस्केलेटन में क्रॉस-लिंक्ड कोलेजन, क्यूटिकलिन, ग्लाइकोप्रोटीन और लिपिड शामिल हैं, जिससे लार्वा चरण से वयस्कता तक सी एलिगेंस रासायनिक या यांत्रिक बलों के माध्यम से प्रोटीन निष्कर्षण के लिए प्रतिरोधी हो जाते हैं3। C. elegans परमाणु निकालने का उपयोग करके एक इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन सिस्टम एक बार विकसित किया गया था, लेकिन सिस्टम के सीमित दायरे के कारण व्यापक रूप से अपनाया नहीं गया था, और अर्क तैयार करने के लिए Dounce homogenizer का उपयोग प्रोटीन अस्थिरता 4,5 को जन्म दे सकता है।
परमाणु निकालने अलगाव के लिए पिछले प्रोटोकॉल के विपरीत, जिसने C. elegans को तोड़ने के लिए एक Dounce homogenizer का उपयोग किया, यह प्रोटोकॉल एक Balch homogenizer का उपयोग करता है। Balch homogenizer में दो मुख्य घटक होते हैं: एक टंगस्टन कार्बाइड बॉल और एक स्टेनलेस-स्टील ब्लॉक जिसमें एक चैनल एक छोर से दूसरे छोर तक ऊब जाता है। Balch homogenizer टंगस्टन कार्बाइड गेंद के साथ भरी हुई है और पीसने कक्ष सील करने के लिए दोनों तरफ से छाया हुआ है। सिरिंज को पीसने वाले कक्ष में अग्रणी दो ऊर्ध्वाधर बंदरगाहों पर लोड किया जा सकता है। जैसा कि सामग्री को पीसने वाले कक्ष के माध्यम से एक सिरिंज से दूसरे में पारित किया जाता है, सिरिंज से दबाव गेंद और कक्ष की दीवार के बीच एक संकीर्ण अंतर के माध्यम से सामग्री को मजबूर करता है। यह धीमा और निरंतर दबाव सामग्री को तब तक तोड़ता है जब तक कि यह एक सुसंगत आकार तक नहीं पहुंच जाता है जो आसानी से संकीर्ण अंतराल से गुजरने में सक्षम होता है। एक निरंतर अभी तक कोमल दबाव के माध्यम से संकीर्ण अंतर के माध्यम से सी elegans मजबूर जानवरों को खुला तोड़ता है, आसपास के बफर में अपनी सामग्री जारी करता है। गेंद के आकार को स्विच करना अंतर को और कड़ा करता है, नई जारी कोशिकाओं को तोड़ता है और नाभिक को बफर में मुक्त करता है। सेंट्रीफ्यूजेशन के कई उदाहरण नाभिक को सेल मलबे के बाकी हिस्सों से अलग करते हैं, जिससे एक स्वच्छ परमाणु अर्क के संग्रह की अनुमति मिलती है। बाल्च होमोजेनाइज़र को कई कारणों से डौंस होमोजेनाइज़र पर पसंद किया जाता है: सिस्टम बड़ी संख्या में जानवरों को संभाल सकता है, जिससे एक ही प्रयास में सक्रिय प्रोटीन की उच्च मात्रा को निकालना संभव हो जाता है; गेंदों और स्टील ब्लॉक की सटीक मशीनिंग कई नमूनों के बीच लगातार पीसने के लिए अनुमति देता है; भारी स्टील ब्लॉक एक गर्मी सिंक के रूप में कार्य करता है, समान रूप से पीसने वाले कक्ष से दूर गर्मी खींचता है, विकृतीकरण को रोकता है।
अलगाव के बाद, परमाणु निकालने ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को किसी भी जैव रासायनिक प्रयोगों में उपयोग किए जाने से पहले सत्यापित किया जाना चाहिए। परंपरागत रूप से, प्रतिलेखन गतिविधि को नए संश्लेषित आरएनए को ट्रैक करने और कल्पना करने के लिए रेडियोलेबल न्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग करके मापा गया था। हालांकि, रेडियोधर्मी लेबलिंग बोझिल हो सकती है क्योंकि इसके लिए उपयोग और निपटान के दौरान सावधानी की आवश्यकता होती है6। तकनीकी प्रगति आज शोधकर्ताओं को मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) जैसी तकनीकों का उपयोग करके छोटी आरएनए मात्रा को मापने के लिए बहुत कम हानिकारक या परेशानी वाले तरीकों का उपयोग करने की अनुमति देती है। यहां, प्रोटोकॉल लार्वा चरण 4 (एल 4) सी एलिगेंस से सक्रिय परमाणु अर्क को अलग करने और इन विट्रो सिस्टम में प्रतिलेखन गतिविधि की कल्पना करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Consumables and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL 8-Strip Tubes &#38; Flat Strip Caps, Clear</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL Individual PCR tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-153G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL sterile microtubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-282S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% absolute molecular grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP2818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol, Koptec</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>&#160;V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm petri plates</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>&#160;T3325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;28-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL plastic syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Norm-Ject syringes</td>
			<td>Henke-Sass Wolf GmbH</td>
			<td>4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL vacuum filter cup 0.22 &#181;m PES, Stericup Millipore Express Plus</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Criterion</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;C7432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>&#160;CA3510-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol proof marker</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;90000-264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans</td>
			<td>CGC</td>
			<td>N2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;15508-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel stain, SYBR safe</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder mix, O&#8217;gene ruler</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Loading Dye, 6x TriTrack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;FERR1161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase, Baseline-ZERO</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;DB0715K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50 strain</td>
			<td>CGC</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe</td>
			<td>Promega</td>
			<td>&#160;E3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes Solution, 1 M Gibco</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 37%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypochlorite bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium weigh dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;02-202-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides, Vista vision</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>16004-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade water, Hypure</td>
			<td>Hyclone Laboratories</td>
			<td>&#160;SH30538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;N1638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR system, FailSafe with premix A</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;FS99100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P39111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein assay kit, Qubit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;Q33211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse transcription kit, Sensiscript</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction kit RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>&#160;N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;BDH9286-12KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;1-09137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filter with 0.2 &#181;m Polyethersulfone membrane</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>28145-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;200-334-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Forward 5&#8217;- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Reverse 5&#8217;- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C freezer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer</td>
			<td>Isobiotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, Eppendorf 5418 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5401000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, VWR Clinical 50</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82013-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope, Leica M80</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer, Qubit 2.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging system, iBright FL1500</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;A44241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>12621-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges, Eppendorf 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETBOY acu 2</td>
			<td>Integra</td>
			<td>155017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking platform</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription

Caenorhabditis elegans जैविक अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली रही है क्योंकि इसे 1963 में पेश किया गया था। हालांकि, सी एलिगन्स को अपने परमाणु अर्क जैसे इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन और डीएनए प्रतिकृति का उपयोग करके जैविक प्रतिक्रियाओं के जैव रासायनिक अध्ययन में पूरी तरह से उपयोग नहीं किया गया है। जैव रासायनिक अध्ययन में सी एलिगन्स का उपयोग करने के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा परमाणु अर्क की गतिविधि का त्याग किए बिना नेमाटोड के मोटे बाहरी छल्ली को बाधित कर रही है। जबकि छल्ली को तोड़ने के लिए कई तरीकों का उपयोग किया जाता है, जैसे कि डॉन्स होमोजेनाइजेशन या sonication, वे अक्सर प्रोटीन अस्थिरता का कारण बनते हैं। इन विट्रो प्रतिक्रियाओं के लिए लार्वा या वयस्क सी एलिगन्स से सक्रिय परमाणु प्रोटीन को अलग करने के लिए कोई स्थापित प्रोटोकॉल नहीं हैं। यहां, प्रोटोकॉल विस्तार से लार्वा चरण 4 सी elegans के homogenization एक Balch homogenizer का उपयोग कर वर्णन करता है. Balch homogenizer इस प्रक्रिया में छल्ली को तोड़ने वाले एक संकीर्ण अंतराल के माध्यम से जानवरों को धीरे-धीरे मजबूर करने के लिए दबाव का उपयोग करता है। बाल्च homogenizer के वर्दी डिजाइन और सटीक मशीनिंग प्रयोगों के बीच जानवरों के लगातार पीसने के लिए अनुमति देते हैं। Balch homogenizer से प्राप्त homogenate fractionating कार्यात्मक रूप से सक्रिय परमाणु निकालने है कि C. elegans के प्रतिलेखन गतिविधि assaying के लिए एक इन विट्रो विधि में इस्तेमाल किया जा सकता है पैदावार.

उल्लिखित चरणों के बाद कार्यात्मक परमाणु अर्क (चित्रा 1) उपज चाहिए, पीसने या धोने के चरणों में विचलन खराब गतिविधि या कम पैदावार का कारण बन सकता है। यदि कार्यात्मक C. elegans परमाणु न?...

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Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

यहां, हम लार्वा चरण 4 सी एलिगन्स से सक्रिय परमाणु अर्क को अलग करने और इन विट्रो सिस्टम में प्रतिलेखन गतिविधि की कल्पना करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

सक्रिय Caenorhabditis elegans परमाणु निकालें और इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए पुनर्गठन के अलगाव

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

यह प्रोटोकॉल C.elegans के जैव रासायनिक अध्ययन के लिए एक तकनीकी अंतर को भरता है और एक मॉडल जीव के रूप में उनकी उपयोगिता का विस्तार करता है। यह तकनीक दोनों सरल और मजबूत है, कार्यात्मक रूप से सक्रिय C.elegans परमाणु निकालने के लगातार अलगाव के लिए अनुमति देता है। सिंक्रनाइज़ किए गए L1 जानवरों को 10 150-मिलीमीटर सूत्रकृमि विकास मीडिया युक्त प्लेटों पर रखकर शुरू करें, जो Escherichia coli OP50 के साथ बीजित हैं, और जानवरों को L4 चरण तक पहुंचने तक 20 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे तक बढ़ने की अनुमति देते हैं।एक बार हाइपोटोनिक और हाइपरटोनिक बफर तैयार होने के बाद, 70% इथेनॉल के साथ पीसने वाले कक्ष में बाढ़ करके बाल्च होमोजेनाइज़र को साफ करें। फिर अतिरिक्त इथेनॉल को हटाने के लिए विआयनीकृत पानी के साथ कक्ष को कुल्ला करें। टंगस्टन कार्बाइड गेंद को पीसने वाले कक्ष में डालें।Balch homogenizer के बैरल के सिरों को कैप करें, और प्रदान किए गए थंबस्क्रू के साथ कैप को सुरक्षित करें। फिर पाठ पांडुलिपि में वर्णित के रूप में प्रति नमूना पूर्ण hypotonic और hypertonic buffers के पांच milliters तैयार करें। इसके बाद पूर्ण हाइपोटोनिक बफर के एक मिलीलीटर के साथ एक बाँझ, दो-मिलीलीटर सिरिंज भरें, और धीरे-धीरे बाल्च होमोजेनाइज़र के पीसने वाले कक्ष को फ्लश करें, जिससे कक्ष में पूर्ण हाइपोटोनिक बफर के लगभग 500 माइक्रोलीटर छोड़ दिए जाएं।फ्लश किए गए homogenizer को बर्फ पर स्टोर करें, और इसे 30 मिनट के लिए ठंडा होने दें। एक 15-मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में M9 बफर के साथ अच्छी तरह से खिलाए गए L4 जानवरों को इकट्ठा करें, और तीन मिनट के लिए 1, 000 बार जी पर जानवरों को सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant निकालें, और supernatant स्पष्ट है जब तक कि जानवर गोली धोना जारी रखें।इसके बाद जानवरों को ठंडे हाइपोटोनिक बफर के तीन मिलीलीटर के साथ धोएं, और फिर से सेंट्रीफ्यूज के रूप में प्रदर्शित किया गया। supernatant hypotonic बफर को हटाने के बाद, पशु गोली के लिए पूर्ण hypotonic बफर के एक मिलीलीटर जोड़ें, और एक नए बाँझ, दो मिलीलीटर सिरिंज के लिए पशु निलंबन हस्तांतरण। बर्फ पर रखे गए जानवरों को homogenizing के लिए, धीरे से टंगस्टन गेंद के साथ लोड Balch homogenizer के पीसने कक्ष के माध्यम से जानवरों को धक्का.फिर जानवरों को सिरिंज में वापस इकट्ठा करें, और इस प्रक्रिया को 30 बार दोहराएं। homogenization के 30 चक्रों के बाद, Balch homogenizer से अधिकतम पशु निलंबन इकट्ठा, और एक 1.7-milliliter माइक्रोट्यूब के अंदर नीचे की ओर स्थित टिप के साथ सिरिंज स्टोर। टंगस्टन गेंद को हटा दें, और विआयनीकृत पानी के साथ पीसने वाले कक्ष को साफ करें।सूखी और संबंधित लेबल ट्यूब के लिए गेंद वापस. फिर 7.9880-मिलीमीटर व्यास और 12-माइक्रोमीटर गैप क्लीयरेंस के साथ टंगस्टन बॉल को पीसने वाले कक्ष में डालें, और होमोजेनाइज़र को फिर से सील करें। बर्फ-ठंडा पूरा hypotonic बफर के एक मिलीलीटर के साथ पीसने कक्ष फिर से फ्लश.25 बार के रूप में प्रदर्शन के निलंबन पीस. पशु निलंबन को एक साफ, 1.7-मिलीलीटर माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करें, और निलंबन को बर्फ पर स्टोर करें। सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पशु निकायों और मलबे को नीचे गोली मार दी।पिपेट इनपुट अंश के रूप में लेबल की गई एक ट्यूब के लिए supernatant के 40 माइक्रोलीटर, और बर्फ पर अंश को स्टोर करते हैं। गोली को परेशान किए बिना एक नए 1.7-मिलीलीटर ट्यूब के लिए शेष supernatant हस्तांतरण, और नाभिक गोली करने के लिए सेंट्रीफ्यूज। फिर साइटोसोलिक अंश के रूप में लेबल किए गए एक नए 1.7-मिलीलीटर ट्यूब में पैलेटेड नाभिक को परेशान किए बिना supernatant को स्थानांतरित करें।नाभिक गोली को धोने के लिए, गोली के लिए पूर्ण हाइपोटोनिक बफर के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें, गोली को निलंबित करें, और पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 4, 000 बार जी पर सेंट्रीफ्यूज करें। centrifugation के अंत में, ताजा पूर्ण hypotonic बफर के 500 microliters में परमाणु गोली resuspend, और फिर से प्रदर्शन के रूप में नमूने centrifuge. फिर पूर्ण हाइपरटोनिक बफर के 40 माइक्रोलीटर में गोली को भंग करें।परमाणु निलंबन को परमाणु अंश लेबल वाले एक नए 1.7-मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें, और इसे बर्फ पर संग्रहीत करें। एक फ्लोरोसेंट परिमाणीकरण किट का उपयोग करके तीन अंशों की प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें। परमाणु अंशों को एकल-उपयोग ट्यूबों में एलीकोट करें जिसमें परमाणु प्रोटीन के छह माइक्रोग्राम होते हैं, और सूखी बर्फ और इथेनॉल स्नान में स्नैप फ्रीज होते हैं।नमूनों को आगे के उपयोग तक माइनस 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। प्रतिनिधि जेल छवि Caenorhabditis elegans L4 लार्वा परमाणु निकालने के प्रतिलेखन उत्पादों को सीएमवी प्रमोटर डीएनए टेम्पलेट का उपयोग कर से पता चलता है. सक्रिय परमाणु प्रोटीन के सफल अलगाव के परिणामस्वरूप इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के बाद 132 बेस पेयर बैंड हुआ, और असफल अलगाव के परिणामस्वरूप एक कमजोर बैंड या बैंड की अनुपस्थिति हुई।पूर्ण बफ़र्स को स्पष्ट रूप से लेबल करना याद रखें। अनुपयुक्त बफर परमाणु प्रोटीन की कार्यक्षमता को नुकसान पहुंचा सकते हैं। इसके अलावा, homogenizer बर्फ ठंडा रखने के लिए प्रोटीन के विकृतीकरण को रोकने के लिए.इस तकनीक को विकसित करने से शोधकर्ताओं को तनावपूर्ण परिस्थितियों के दौरान C.elegans के आरएनए प्रतिलेखन की दर को मापने की अनुमति मिली, यह दिखाते हुए कि पर्यावरणीय परिस्थितियों के आधार पर जानवरों की प्रतिलेखन दर बदल सकती है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

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अलगाव और Arabidopsis थालियाना से Mitochondria की श्वसन माप

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

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Caenorhabditis एलिगेंस में उच्च प्रवाह रासायनिक स्क्रीनिंग के लिए एक सरल तरीका

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए TRPV1 का शुद्धिकरण और पुनर्गठन

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

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छोटे पैमाने पर वर्णमिति की परख Intracellular स्तनपान और पाइरूवेट में निमेटोड Caenorhabditis एलिगेंस

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

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थाली आधारित Caenorhabditis एलिगेंसकी बड़े पैमाने पर खेती: मधुमेह में चयापचय परिवर्तन के अध्ययन के लिए नमूना तैयारी

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

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इन विट्रो में स्व का पुनर्गठन-समर्थित लिपिड Bilayers पर प्रोटीन पैटर्न का आयोजन

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

शारीरिक रूप से सक्रिय Thylakoids के अलगाव और ऊर्जा पर निर्भर प्रोटीन परिवहन परख में उनके उपयोग

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

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ट्रांसक्रिप्शन में प्रोटीन-प्रोटिन इंटरेक्शन के अध्ययन के लिए बायोलेयर इंटरफेरोमेट्री (बीआईएलआई) का अनुप्रयोग

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans में 2-Arachidonoylglycerol के क्वांटाइज के लिए एक ड्यूरेटेड मानक का संश्लेषण

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

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कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस में प्रोटीन इंटरैक्शन के अध्ययन के लिए वीवो हाइड्रोक्सिल रेडिकल रेडिकल प्रोटीन फुटप्रिंटिंग में

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...