Name: isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription
Uploaded: 2021-08-11T14:00:00
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Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione NIH MIRA (R35GM124678 a J. S.).

1. Preparazioni dei media
<ol><li>Preparare piastre di agar sterili in brodo di lisogenesi (LB) e fluidi liquidi seguendo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Striscia Escherichia coli (E. coli) ceppo OP50 su una piastra di agar LB. Incubare la striscia batterica a 37 °C durante la notte.</li>
	<li>Conservare la piastra striata di E. coli OP50 a 4 °C dopo l'incubazione. La piastra E. coli OP50 può essere conservata in modo sicuro a 4 °C per 2 settimane se avvolta in parafilm p...

<ol>
	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Blackwell, T. K., Walker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+mechanisms.">Transcription mechanisms.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-16 (2006).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-15 (2007).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+properties+of+the+Caenorhabditis+elegans+TATA-box-binding+protein.">Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+activation+of+transcription+by+UNC-86+and+MEC-3+in+Caenorhabditis+elegans+embryo+extracts.">Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts.</a> EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).</li><li>Shan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope-labeled+immunoassays+without+radiation+waste.">Isotope-labeled immunoassays without radiation waste.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).</li><li>Voss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+non-radioactive+eukaryotic+in+vitro+transcription+assay+for+sensitive+quantification+of+RNA+polymerase+II+activity.">A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity.</a> BMC Molecular Biology. 15, 7 (2014).</li><li>Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+Caenorhabditis+elegans+transcription+system.">A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87 (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Zbacnik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+buffers+in+protein+formulations.">Role of buffers in protein formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).</li></ol>

C. elegans è un organismo modello attraente per studiare il sistema di trascrizione eucariotica a causa del suo basso costo di manutenzione e della facilità di manipolazione genetica. Qui viene descritto un protocollo per l'isolamento coerente dell'estratto nucleare funzionalmente attivo da L4 C. elegans . Sebbene questo protocollo si concentrasse sulla visualizzazione dell'attività di trascrizione, il cDNA prodotto post-trascrizionalmente può essere quantificato utilizzando RT-qPCR per ottenere una...

Il piccolo nematode caenorhabditis elegans è un organismo modello semplice ma potente per affrontare una vasta gamma di questioni biologiche. Fin dalla sua introduzione nel 1963, i nematodi sono stati preziosi per rispondere a domande di neurobiologia, metabolismo, invecchiamento, sviluppo, immunità e genetica1. Alcune delle molte caratteristiche dell'animale che lo rendono un organismo modello ideale includono il breve tempo di generazione, l'efficacia dell'interferenza dell'RNA, il corpo trasparente e le mappe completate sia del suo lignaggio cellulare che del sistema nervoso.
Mentre i contributi del nematode alla scienza sono vasti, sono stati sottoutilizzati per chiarire il sistema di trascrizione eucariotica, con la maggior parte della nostra comprensione di questi meccanismi proveniente da studi che utilizzano estratto nucleare da lievito, moscerino della frutta e coltura cellulare di mammiferi2. Il più grande ostacolo che dissuade i ricercatori dall'estrarre l'estratto nucleare funzionale è la cuticola esterna dura del nematode. Questo esoscheletro comprende collageni reticolati, cuticlini, glicoproteine e lipidi, rendendo C. elegans dallo stadio larvale all'età adulta resistente all'estrazione di proteine attraverso forze chimiche o meccaniche3. Un sistema di trascrizione in vitro che utilizza l'estratto nucleare di C. elegans è stato sviluppato una volta, ma non ampiamente adottato a causa della portata limitata del sistema, e l'uso dell'omogeneizzatore Dounce per preparare l'estratto potrebbe portare all'instabilità proteica4,5.
A differenza del precedente protocollo per l'isolamento dell'estratto nucleare che utilizzava un omogeneizzatore Dounce per rompere C. elegans, questo protocollo utilizza un omogeneizzatore Balch. L'omogeneizzatore Balch è costituito da due componenti principali: una sfera in carburo di tungsteno e un blocco in acciaio inossidabile con un canale forato da un'estremità all'altra. L'omogeneizzatore Balch viene caricato con la sfera in carburo di tungsteno e tappato su entrambi i lati per sigillare la camera di macinazione. Le siringhe possono essere caricate sulle due porte verticali che conducono nella camera di rettifica. Quando il materiale viene fatto passare da una siringa all'altra attraverso la camera di macinazione, la pressione delle siringhe forza il materiale attraverso uno stretto spazio tra la sfera e la parete della camera. Questa pressione lenta e costante rompe il materiale fino a raggiungere una dimensione costante che è in grado di passare facilmente attraverso lo stretto spazio. Forzare C. elegans attraverso lo stretto spazio attraverso una pressione costante ma delicata rompe gli animali aperti, rilasciando il loro contenuto nel buffer circostante. La commutazione delle dimensioni della sfera stringe ulteriormente lo spazio, rompendo le cellule appena rilasciate e liberando i nuclei nel buffer. Più istanze di centrifugazione separano i nuclei dal resto dei detriti cellulari, consentendo la raccolta di un estratto nucleare pulito. L'omogeneizzatore Balch è preferito all'omogeneizzatore Dounce per diversi motivi: il sistema può gestire un gran numero di animali, rendendo possibile l'estrazione di un'elevata quantità di proteine attive in un solo tentativo; la lavorazione precisa delle sfere e del blocco di acciaio consente una rettifica costante tra più campioni; il pesante blocco di acciaio funge da dissipatore di calore, allontanando uniformemente il calore dalla camera di macinazione, prevenendo la denaturazione.
Dopo l'isolamento, l'attività trascrizionale dell'estratto nucleare deve essere verificata prima di essere utilizzata in qualsiasi esperimento biochimico. Tradizionalmente, l'attività di trascrizione è stata misurata utilizzando nucleotidi radiomarcati per tracciare e visualizzare l'RNA appena sintetizzato. Tuttavia, l'etichettatura radioattiva può essere onerosa in quanto richiede precauzioni durante l'uso e lo smaltimento6. I progressi tecnologici consentono oggi ai ricercatori di utilizzare metodi molto meno dannosi o fastidiosi per misurare anche piccole quantità di RNA utilizzando tecniche come la PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR)7. Qui, il protocollo descrive un metodo per isolare l'estratto nucleare attivo dallo stadio larvale 4 (L4) C. elegans e visualizzare l'attività di trascrizione in un sistema in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Consumables and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL 8-Strip Tubes &#38; Flat Strip Caps, Clear</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL Individual PCR tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-153G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL sterile microtubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-282S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% absolute molecular grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP2818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol, Koptec</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>&#160;V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm petri plates</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>&#160;T3325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;28-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL plastic syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Norm-Ject syringes</td>
			<td>Henke-Sass Wolf GmbH</td>
			<td>4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL vacuum filter cup 0.22 &#181;m PES, Stericup Millipore Express Plus</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Criterion</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;C7432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>&#160;CA3510-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol proof marker</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;90000-264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans</td>
			<td>CGC</td>
			<td>N2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;15508-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel stain, SYBR safe</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder mix, O&#8217;gene ruler</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Loading Dye, 6x TriTrack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;FERR1161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase, Baseline-ZERO</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;DB0715K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50 strain</td>
			<td>CGC</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe</td>
			<td>Promega</td>
			<td>&#160;E3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes Solution, 1 M Gibco</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 37%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypochlorite bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium weigh dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;02-202-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides, Vista vision</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>16004-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade water, Hypure</td>
			<td>Hyclone Laboratories</td>
			<td>&#160;SH30538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;N1638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR system, FailSafe with premix A</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;FS99100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P39111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein assay kit, Qubit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;Q33211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse transcription kit, Sensiscript</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction kit RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>&#160;N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;BDH9286-12KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;1-09137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filter with 0.2 &#181;m Polyethersulfone membrane</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>28145-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;200-334-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Forward 5&#8217;- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Reverse 5&#8217;- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C freezer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer</td>
			<td>Isobiotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, Eppendorf 5418 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5401000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, VWR Clinical 50</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82013-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope, Leica M80</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer, Qubit 2.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging system, iBright FL1500</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;A44241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>12621-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges, Eppendorf 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETBOY acu 2</td>
			<td>Integra</td>
			<td>155017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking platform</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription

Caenorhabditis elegans è stato un importante sistema modello per la ricerca biologica da quando è stato introdotto nel 1963. Tuttavia, C. elegans non è stato pienamente utilizzato nello studio biochimico delle reazioni biologiche utilizzando i suoi estratti nucleari come la trascrizione in vitro e la replicazione del DNA. Un ostacolo significativo per l'uso di C. elegans negli studi biochimici è interrompere la spessa cuticola esterna del nematode senza sacrificare l'attività dell'estratto nucleare. Mentre diversi metodi sono usati per rompere la cuticola, come l'omogeneizzazione di Dounce o la sonicazione, spesso portano all'instabilità delle proteine. Non esistono protocolli stabiliti per isolare proteine nucleari attive da larve o C. elegans adulti per reazioni in vitro . Qui, il protocollo descrive in dettaglio l'omogeneizzazione dello stadio larvale 4 C. elegans utilizzando un omogeneizzatore Balch. L'omogeneizzatore Balch utilizza la pressione per forzare lentamente gli animali attraverso uno stretto spazio che rompe la cuticola nel processo. Il design uniforme e la lavorazione precisa dell'omogeneizzatore Balch consentono una rettifica costante degli animali tra gli esperimenti. Il frazionamento dell'omogeneizzatore ottenuto dall'omogeneizzatore di Balch produce un estratto nucleare funzionalmente attivo che può essere utilizzato in un metodo in vitro per l'analisi dell'attività di trascrizione di C. elegans.

Seguendo i passaggi delineati dovrebbe produrre estratto nucleare funzionale (Figura 1), la deviazione nelle fasi di macinazione o lavaggio può portare a scarsa attività o bassi rendimenti. Se si ottiene un estratto nucleare funzionale di C. elegans , trascriverà la regione a valle del promotore CMV sul modello di DNA quando aggiunto al test in vitro precedentemente descritto. Il trascritto di RNA risultante può essere purificato dalle ...

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Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per isolare l'estratto nucleare attivo dallo stadio larvale 4 C. elegans e visualizzare l'attività di trascrizione in un sistema in vitro .

Isolamento dell'estratto nucleare attivo di Caenorhabditis elegans e ricostituzione per la trascrizione in vitro

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

Questo protocollo colma una lacuna tecnica per lo studio biochimico dei C.elegans e ne amplia l'utilità come organismo modello. Questa tecnica è sia semplice che robusta, consentendo un isolamento coerente dell'estratto nucleare di C.elegans funzionalmente attivo. Inizia posizionando gli animali L1 sincronizzati su 10 piastre contenenti mezzi di crescita di nematodi da 150 millimetri seminate con Escherichia coli OP50 e lascia che gli animali crescano per 48 ore a 20 gradi Celsius fino a raggiungere lo stadio L4.Una volta preparati i tamponi ipotonici e ipertonici, pulire l'omogeneizzatore Balch inondando la camera di macinazione con il 70% di etanolo. Quindi risciacquare la camera con acqua deionizzata per rimuovere l'etanolo in eccesso. Inserire la sfera di carburo di tungsteno nella camera di macinazione.Tappare le estremità della canna dell'omogeneizzatore Balch e fissare i tappi con le viti in dotazione. Quindi preparare cinque millilitri dei tamponi ipotonici e ipertonici completi per campione come descritto nel manoscritto di testo. Quindi riempire una siringa sterile da due millilitri con un millilitro di tampone ipotonico completo e lavare delicatamente la camera di macinazione dell'omogeneizzatore Balch, lasciando circa 500 microlitri di tampone ipotonico completo nella camera.Conservare l'omogeneizzatore lavato sul ghiaccio e lasciarlo raffreddare per 30 minuti. Raccogliere gli animali L4 ben nutriti con tampone M9 in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare gli animali a 1.000 volte g per tre minuti. Rimuovere il surnatante e continuare a lavare il pellet animale fino a quando il surnatante non è chiaro.Quindi lavare gli animali con tre millilitri di tampone ipotonico freddo e centrifugare di nuovo come dimostrato. Dopo aver rimosso il tampone ipotonico surnatante, aggiungere un millilitro di tampone ipotonico completo al pellet animale e trasferire la sospensione animale su una nuova siringa sterile da due millilitri. Per omogeneizzare gli animali tenuti sul ghiaccio, spingere delicatamente gli animali attraverso la camera di macinazione dell'omogeneizzatore Balch caricato con la palla di tungsteno.Quindi raccogliere gli animali nella siringa e ripetere questa procedura 30 volte. Dopo 30 cicli di omogeneizzazione, raccogliere la massima sospensione animale dall'omogeneizzatore Balch e conservare la siringa con la punta posizionata verso il basso all'interno di un microtubo da 1,7 millilitri. Rimuovere la sfera di tungsteno e pulire la camera di macinazione con acqua deionizzata.Asciugare e riportare la palla al rispettivo tubo etichettato. Quindi inserire la sfera di tungsteno con un diametro di 7,9880 millimetri e un distanza di 12 micrometri nella camera di macinazione e richiudere l'omogeneizzatore. Lavare nuovamente la camera di macinazione con un millilitro di tampone ipotonico completo ghiacciato.Macinare la sospensione 25 volte come dimostrato. Trasferire la sospensione animale in un microtubo pulito da 1,7 millilitri e conservare la sospensione sul ghiaccio. Pellet giù i corpi animali e detriti per centrifugazione.Pipettare 40 microlitri del surnatante a un tubo etichettato come frazione di ingresso e conservare la frazione sul ghiaccio. Trasferire il surnatante rimanente in un nuovo tubo da 1,7 millilitri senza disturbare il pellet e centrifugare per pellettare i nuclei. Quindi trasferire il surnatante senza disturbare i nuclei pellettati in un nuovo tubo da 1,7 millilitri etichettato come frazione citosolica.Per lavare il pellet nucleico, aggiungere 500 microlitri di tampone ipotonico completo al pellet, sospendere il pellet e centrifugare a 4.000 volte g a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Alla fine della centrifugazione, risospese il pellet nucleare in 500 microlitri di tampone ipotonico completo fresco e nuovamente centrifugare il campione come dimostrato. Quindi sciogliere il pellet in 40 microlitri di tampone ipertonico completo.Trasferire la sospensione nucleare in un nuovo tubo da 1,7 millilitri etichettato frazione nucleare e conservarla sul ghiaccio. Determinare la concentrazione proteica di tre frazioni utilizzando un kit di quantificazione fluorescente. Aliquotare le frazioni nucleari in tubi monouso contenenti sei microgrammi della proteina nucleare e congelare a scatto nel ghiaccio secco e nel bagno di etanolo.Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius fino a nuovo utilizzo. L'immagine rappresentativa del gel mostra i prodotti di trascrizione dell'estratto nucleare di larve di Caenorhabditis elegans L4 utilizzando il modello di DNA promotore CMV. Il successo dell'isolamento delle proteine nucleari attive ha portato a una banda di 132 coppie di basi dopo una trascrizione in vitro, e l'isolamento senza successo ha provocato una banda debole o l'assenza di una banda.Ricordarsi di etichettare chiaramente i buffer completi. Tamponi inappropriati possono danneggiare la funzionalità delle proteine nucleari. Inoltre, mantenere l'omogeneizzatore ghiacciato per prevenire la denaturazione delle proteine.Lo sviluppo di questa tecnica ha permesso ai ricercatori di misurare il tasso di trascrizione dell'RNA di C.elegans durante condizioni stressanti, dimostrando che il tasso di trascrizione dell'animale può cambiare a seconda delle condizioni ambientali.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Ricerca

Biochimica

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