Name: isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription
Uploaded: 2021-08-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription at JoVE.com

この作業は、NIH MIRA助成金(J.S.にR35GM124678)によって支えられていました。

1. メディアの準備
<ol><li>メーカーの指示に従って、無菌リソジニーブロス(LB)寒天プレートと液体培地を準備します。</li>
	<li>LB寒天板上のスリーク エシェリヒア大腸菌 (大腸菌)株OP50。一晩で37°Cで細菌ストリークをインキュベートします。</li>
	<li>大腸菌OP50ストリークプレートはインキュベーション後4°Cで保管してください。大腸菌OP50プレートは、水分損失を防...

<ol>
	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Blackwell, T. K., Walker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+mechanisms.">Transcription mechanisms.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-16 (2006).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-15 (2007).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+properties+of+the+Caenorhabditis+elegans+TATA-box-binding+protein.">Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+activation+of+transcription+by+UNC-86+and+MEC-3+in+Caenorhabditis+elegans+embryo+extracts.">Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts.</a> EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).</li><li>Shan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope-labeled+immunoassays+without+radiation+waste.">Isotope-labeled immunoassays without radiation waste.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).</li><li>Voss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+non-radioactive+eukaryotic+in+vitro+transcription+assay+for+sensitive+quantification+of+RNA+polymerase+II+activity.">A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity.</a> BMC Molecular Biology. 15, 7 (2014).</li><li>Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+Caenorhabditis+elegans+transcription+system.">A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87 (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Zbacnik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+buffers+in+protein+formulations.">Role of buffers in protein formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).</li></ol>

C.エレガンス は、その低コストのメンテナンスと遺伝子操作の容易さのために真核生物転写システムを研究する魅力的なモデル生物です。ここでは、L4 C. エレガンス からの機能的に活性な核抽出物を一貫して分離するためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは転写活性の可視化に焦点を当てたが、転写後に産生されたcDNAをRT-qPCRを用いて定量化し、転写活性の測定?...

小さくて自由に生きている線虫カ エノハブディティスエレガンス は、幅広い生物学的問題に取り組むシンプルでありながら強力なモデル生物です。1963年の導入以来、線虫は神経生物学、代謝、老化、発達、免疫、遺伝学1の質問に答えるのに非常に貴重なされています。理想的なモデル生物となる動物の多くの特徴のいくつかは、短い生成時間、RNA干渉の有効性、透明な身体、およびその細胞系統と神経系の両方の完成した地図を含む。
線虫の科学への貢献は膨大ですが、真核転写システムを解明するために十分に利用されておらず、酵母、フルーツフライ、哺乳類細胞培養からの核抽出物を用いた研究から得られたメカニズムに関する理解のほとんどが得ています。研究者が機能性核抽出物を抽出するのを妨げる最大のハードルは、線虫のタフな外キューティクルです。この外骨格は、架橋されたコラーゲン、キューティクリン、糖タンパク質、および脂質を含み、幼虫期から化学的または機械的な力を介したタンパク質抽出に耐性を持つC.エレガンスを作る3。C.エレガンス核抽出物を用いたインビトロ転写システムは、かつて開発されたが、システムの限られた範囲のために広く採用されておらず、抽出物を調製するためのDounceホモジナイザーの使用は、タンパク質不安定性につながる可能性がある4,5。
C.エレガンスを破るためにDounceホモジナイザーを利用した核抽出分離のための以前のプロトコルとは異なり、このプロトコルはバルチホモジナイザーを使用しています。Balchホモジナイザーは2つの主要なコンポーネントから成っている:タングステンカーバイドボールと一方の端から別の端に退屈チャネルを持つステンレス鋼のブロック。バルチホモジナイザーはタングステンカーバイドボールを積み込み、粉砕室を密封するために両側にキャップされます。シリンジは、粉砕室につながる2つの垂直ポートに積み込むことができます。材料が一方の注射器からもう一方のシリンジに粉砕室を通って渡されると、注射器からの圧力は、ボールとチャンバーの壁との間の狭い隙間を通って材料を強制します。この遅く、一定の圧力は、それが容易に狭いギャップを通過することができる一貫したサイズに達するまで材料を壊す。一定でありながら穏やかな圧力を介して狭い隙間を通ってC.エレガンスを強制すると、動物が開き、周囲の緩衝液に内容物が放出されます。ボールサイズの切り替えにより、ギャップがさらに引き締まり、新たに放出された細胞が破壊され、核がバッファに解放されます。遠心分離の複数のインスタンスは、細胞の破片の残りの部分から核を分離し、きれいな核抽出物の収集を可能にする。バルチホモジナイザーは、いくつかの理由からDounceホモジナイザーよりも好ましい:システムは、一度の試みで活性タンパク質の大量を抽出することが可能になり、動物の多数を処理することができます。ボールとスチールブロックの精密な加工は、複数のサンプル間で一貫した研削を可能にします。重い鋼ブロックはヒートシンクとして機能し、均一に研削室から熱を引き出し、変性を防ぎます。
単離後、核抽出物の転写活性は、生化学的実験で使用される前に検証する必要があります。従来、転写活性は、新たに合成されたRNAを追跡および可視化するために、放射性標識ヌクレオチドを用いて測定した。しかし、放射性標識は使用時および処分時に注意を要するため、負担が大きくなる可能性があります。技術の進歩により、研究者は定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)7などの技術を用いて、より有害でない、または面倒な方法を使用して、少量のRNA量を測定することができます。ここで、プロトコルは、幼虫期4(L4) C.エレガンス から活性核抽出物を単離し、 インビトロ 系における転写活性を可視化する方法を説明する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Consumables and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL 8-Strip Tubes &#38; Flat Strip Caps, Clear</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL Individual PCR tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-153G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL sterile microtubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-282S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% absolute molecular grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP2818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol, Koptec</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>&#160;V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm petri plates</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>&#160;T3325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;28-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL plastic syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Norm-Ject syringes</td>
			<td>Henke-Sass Wolf GmbH</td>
			<td>4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL vacuum filter cup 0.22 &#181;m PES, Stericup Millipore Express Plus</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Criterion</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;C7432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>&#160;CA3510-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol proof marker</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;90000-264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans</td>
			<td>CGC</td>
			<td>N2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;15508-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel stain, SYBR safe</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder mix, O&#8217;gene ruler</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Loading Dye, 6x TriTrack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;FERR1161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase, Baseline-ZERO</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;DB0715K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50 strain</td>
			<td>CGC</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe</td>
			<td>Promega</td>
			<td>&#160;E3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes Solution, 1 M Gibco</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 37%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypochlorite bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium weigh dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;02-202-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides, Vista vision</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>16004-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade water, Hypure</td>
			<td>Hyclone Laboratories</td>
			<td>&#160;SH30538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;N1638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR system, FailSafe with premix A</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;FS99100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P39111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein assay kit, Qubit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;Q33211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse transcription kit, Sensiscript</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction kit RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>&#160;N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;BDH9286-12KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;1-09137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filter with 0.2 &#181;m Polyethersulfone membrane</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>28145-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;200-334-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Forward 5&#8217;- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Reverse 5&#8217;- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C freezer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer</td>
			<td>Isobiotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, Eppendorf 5418 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5401000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, VWR Clinical 50</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82013-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope, Leica M80</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer, Qubit 2.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging system, iBright FL1500</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;A44241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>12621-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges, Eppendorf 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETBOY acu 2</td>
			<td>Integra</td>
			<td>155017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking platform</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription

カエノハブディティス・エレガンスは、1963年に導入されて以来、生物研究にとって重要なモデルシステムとなっています。しかし、C.エレガンスは、インビトロ転写やDNA複製などの核抽出物を用いた生物学的反応の生化学的研究に十分に利用されていない。生化学的研究でC.エレガンスを使用するための重要なハードルは、核抽出物の活性を犠牲にすることなく、線虫の厚い外側のキューティクルを破壊することです。ドオンス均質化や超音波処理など、キューティクルを壊すためにいくつかの方法が使用されますが、タンパク質の不安定性につながることがよくあります。インビトロ反応のために、活性核タンパク質を幼虫または成人C.エレガンスから単離するための確立されたプロトコルはありません。ここで、プロトコルは、バルチホモジナイザーを用いた幼虫ステージ4 C.エレガンスの均質化について詳細に説明する。バルチホモジナイザーは、圧力を使用して、その過程でキューティクルを壊す狭い隙間からゆっくりと動物を強制します。バルチホモジナイザーの均一な設計および精密な機械化は実験間の動物の一貫した粉砕を可能にする。バルチホモジナイザーから得られたホモジネートを分画すると、C.エレガンスの転写活性をアッセリングするインビトロ法で使用できる機能的に活性な核抽出物を得る。

概説されたステップに従って機能的核抽出物 (図1)を得る必要があり、粉砕または洗浄ステップの偏差は、不十分な活動または低い収率につながる可能性があります。機能的 C.エレガンス 核抽出物が得られた場合、先に説明した インビトロ アッセイに添加した場合に、DNAテンプレート上のCMVプロモーターの下流の領域を転写する?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription at JoVE.com

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

ここでは、幼虫期 4C.エレガン スから活性核抽出物を単離し、 インビトロ 系で転写活性を可視化するための詳細なプロトコルについて説明する。

能動 カエノハブディティス・エレガンス 核抽出物の分離と インビトロ 転写のための再構成

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

このプロトコルは、C.elegansの生化学的研究のための技術的なギャップを埋め、モデル生物としての有用性を拡大します。この技術は、機能的に活性C.elegans核抽出物の一貫した分離を可能にする、シンプルで堅牢な両方です。まず、同期したL1動物を、大腸菌OP50を播種した10個の150ミリメートルの線虫増殖培地含有プレートに配置し、L4段階に達するまで摂氏20度で48時間成長させることから始めます。低張および高張バッファーを調製したら、70%エタノールで粉砕チャンバーをフラッディングすることにより、バルチホモジナイザーを洗浄します。その後、余分なエタノールを除去するために脱イオン水でチャンバーをすすぎ。タングステンカーバイドボールを粉砕室に挿入します。バルチホモジナイザーのバレルの端部をキャップし、付属のつまみねじでキャップを固定します。次に、テキスト原稿に記載されているように、サンプルごとに完全な低張りおよび高張性バッファーの5ミリリットルを調製する。次に、滅菌した2ミリリットルのシリンジに1ミリリットルの完全な低張性バッファーを充填し、バルチホモジナイザーの粉砕チャンバーを静かに洗い流し、チャンバーに約500マイクロリットルの完全な低張バッファーを残します。洗い流したホモジナイザーを氷の上に保管し、30分間冷まします。M9バッファーを持つ十分に供給されたL4動物を15ミリリットルの円錐管に集め、動物を1,000倍gで3分間遠心分離します。上清を取り除き、上清がはっきりするまで動物ペレットを洗浄し続ける。次に、3ミリリットルの冷たい低張バッファーで動物を洗浄し、再び遠心分離機を示した。上清低張バッファーを除去した後、動物のペレットに完全な低張バッファーの 1 ミリリットルを追加し、新しい滅菌、2 ミリリットルのシリンジに動物の懸濁液を転送します。氷の上に保管されている動物を均質化するために、タングステンボールを積んだバルチホモジナイザーの粉砕室を通して動物を静かに押し込みます。次に、動物を注射器に回収し、この手順を30回繰り返します。ホモジナイゼーションの30サイクル後、バルチホモジナイザーから最大の動物懸濁液を収集し、1.7ミリリットルマイクロチューブ内の下方に配置された先端を持つ注射器を保管します。タングステンボールを取り出し、脱イオン水で粉砕室を洗浄します。乾いて、それぞれのラベル付きチューブにボールを戻します。その後、直径7.9880ミリメートルのタングステンボールと12マイクロメートルのギャップクリアランスを粉砕室に挿入し、ホモジナイザーを再シールします。氷冷完全低張性緩衝液の1ミリリットルで再び粉砕室を洗い流します。実証したように、懸濁液を25回粉砕します。動物の懸濁液を清潔な1.7ミリリットルマイクロチューブに移し、懸濁液を氷の上に保管します。遠心分離によって動物の体と破片をペレットダウン。ピペット40マイクロリットルの上清を入力画分としてラベル付けされたチューブにし、その分画を氷の上に保存する。残りの上清をペレットを邪魔することなく新しい1.7ミリリットルチューブに移し、遠心分離機を核にペレット化します。次に、ペレット核を乱さずに上清を、細胞質画分として標識された新しい1.7ミリリットルチューブに移します。核ペレットを洗浄するには、ペレットに500マイクロリットルの完全な低張度バッファーを加え、ペレットを懸濁し、遠心分離機を4,000倍の4°Cで5分間加えます。遠心分離の終わりに、500マイクロリットルの新鮮な完全な低張性緩衝液中の核ペレットを再懸濁し、サンプルを再び遠心分離する。その後、ペレットを完全な高トニックバッファーの 40 マイクロリットルに溶解します。核懸濁液を核分率とラベル付けされた新しい1.7ミリリットルのチューブに移し、氷の上に保管する。蛍光定量キットを使用して、3つの画分のタンパク質濃度を決定します。核分率を核タンパク質6マイクログラムを含む単回使用チューブにアリコートし、ドライアイスとエタノール浴で凍結する。さらに使用するまで、サンプルをマイナス80°Cで保管してください。代表的なゲル画像は、CMVプロモーターDNAテンプレートを用いたカエノハブディティス・エレガンスL4幼虫核抽出物の転写産物を示す。活性核タンパク質の分離に成功すると、インビトロ転写後に132塩基対バンドが発生し、分離が失敗すると、弱いバンドまたはバンドの不在が生じる。バッファー全体に明確なラベルを付けることを忘れないでください。不適切なバッファーは、核タンパク質の機能性を損なう可能性があります。また、タンパク質の変性を防ぐために、ホモジナイザー氷を冷たく保ちます。この技術を開発することで、研究者はストレスの多い条件下でのC.elegansのRNA転写速度を測定することができ、動物の転写速度は環境条件に応じて変化する可能性があることを示しました。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

分離とシロイヌナズナ由来のミトコンドリアの呼吸測定

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

カエノラブディティス ・ エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

精製と TRPV1 の分光学的解析のための再構成

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

小規模な比色試金の細胞内乳酸と線虫の線虫のピルビン酸

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

線虫の大規模栽培のプレート ・ ベース: 糖尿病の代謝変化に関する研究のための試料作製

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

体外自己組織化人工脂質膜上のタンパク質パターンの再構成

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

生理活性とエネルギー依存性タンパク質輸送アッセイでの使用の分離

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

転写におけるタンパク質とタンパク質の相互作用を研究するための生体層干渉計(BLI)の応用

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

カエノルハブ炎エレガンスにおける2-アラチドノイルグリセロールの定量のための過熱基準の合成

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

イン・ビボヒドロキシルラジカルプロテインフットプリントにおけるカエノハブディティス・エレガンスにおけるタンパク質相互作用の研究

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

能動 カエノハブディティス・エレガンス 核抽出物の分離と インビトロ 転写のための再構成

能動カエノハブディティス・エレガンス核抽出物の分離とインビトロ転写のための再構成