Name: isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription
Uploaded: 2021-08-11T14:00:00
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1. 미디어 준비
<ol><li>제조 업체의 지시에 따라 멸균 리소제니 국물 (LB) 한천 플레이트 및 액체 매체를 준비합니다.</li>
	<li>LB 한천 플레이트 에서 연속 에슈리치아 대장균 (대장균) 변형 OP50. 하룻밤 사이에 37°C에서 박테리아 를 배양합니다.</li>
	<li>인큐베이션 후 4°C에 대장균 OP50 행판을 보관합니다. 대장균 OP50 플레이트는 수분 손실을 방지하기 위해 파라필름에 싸인 ?...

<ol>
	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Blackwell, T. K., Walker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+mechanisms.">Transcription mechanisms.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-16 (2006).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-15 (2007).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+properties+of+the+Caenorhabditis+elegans+TATA-box-binding+protein.">Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+activation+of+transcription+by+UNC-86+and+MEC-3+in+Caenorhabditis+elegans+embryo+extracts.">Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts.</a> EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).</li><li>Shan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope-labeled+immunoassays+without+radiation+waste.">Isotope-labeled immunoassays without radiation waste.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).</li><li>Voss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+non-radioactive+eukaryotic+in+vitro+transcription+assay+for+sensitive+quantification+of+RNA+polymerase+II+activity.">A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity.</a> BMC Molecular Biology. 15, 7 (2014).</li><li>Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+Caenorhabditis+elegans+transcription+system.">A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87 (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Zbacnik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+buffers+in+protein+formulations.">Role of buffers in protein formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).</li></ol>

C. elegans 는 저비용 유지 보수와 유전 조작의 용이성 으로 인해 진핵 전사 시스템을 연구하는 매력적인 모델 유기체입니다. 여기서 L4 C. elegans 로부터 기능적으로 활성 핵 추출물의 일관된 절연을 위한 프로토콜이 설명된다. 이 프로토콜은 전사 활성을 시각화하는 데 초점을 맞추고 있지만, 전사 후 생성된 cDNA는 RT-qPCR을 사용하여 전사 활성8의 보다 정밀한 측정을 얻?...

작고 자유로운 선충 인 Caenorhabditis elegans 는 광범위한 생물학적 질문을 해결하기위한 간단하면서도 강력한 모델 유기체입니다. 1963년에 도입된 이래, 선충은 신경생물학, 신진대사, 노화, 발달, 면역 및 유전학1에 있는 질문에 대답하는 데 귀중했습니다. 이상적인 모델 유기체를 만드는 동물의 많은 특성 중 일부는 짧은 세대 시간, RNA 간섭의 효과, 투명한 신체 및 세포 혈통과 신경계 의 완성 된지도를 포함합니다.
과학에 대한 선충의 기여는 광대하지만, 그들은 효모, 과일 파리 및 포유류 세포 배양2에서 핵 추출물을 사용하여 연구에서 오는 이러한 메커니즘에 대한 우리의 이해의 대부분과 함께, 진핵 전사 시스템을 해명하기 위해 활용되었습니다. 기능성 핵 추출물추출에서 연구원을 설득하는 가장 큰 장애물은 선충의 거친 외부 표피입니다. 이 외골격은 교차 연결된 콜라겐, 큐티클린, 당단백질 및 지질을 포함하며, 화학적 또는 기계적 힘을 통한 단백질 추출에 내성이 있는 성년기에 이르기까지 C. 엘레간을 만듭니다3. C. elegans 핵 추출물을 이용한 체외 전사 시스템은 한때 개발되었지만 시스템의 제한된 범위로 인해 널리 채택되지 않았으며, 추출물을 준비하기 위한 두스균제의 사용은 단백질 불안정성으로 이어질 수 있다4,5.
C. elegans를 깨기 위해 Dounce 균질화제를 활용한 핵 추출물 격리를 위한 이전 프로토콜과 달리 이 프로토콜은 발치 균질화제를 사용합니다. 발치 균질화는 텅스텐 초경 공과 한쪽 끝에서 다른 끝까지 지루하게 채널이있는 스테인레스 스틸 블록의 두 가지 주요 구성 요소로 구성됩니다. 발치 균질화는 텅스텐 초경 공으로 로드되고 분쇄 챔버를 밀봉하기 위해 양쪽에 덮여있다. 주사기는 연삭 챔버로 이어지는 두 개의 수직 포트에 로드할 수 있습니다. 재료가 분쇄 챔버를 통해 다른 주사기에서 다른 주사기에서 전달될 때, 주사기의 압력은 공과 챔버의 벽 사이의 좁은 간격을 통해 재료를 강제로. 이 느리고 일정한 압력은 좁은 틈새를 쉽게 통과할 수 있는 일관된 크기에 도달할 때까지 재료를 분해합니다. 일정한 압력을 통해 좁은 간격을 통해 C. elegans를 강제로 동물을 열어, 주변 버퍼로 자신의 내용을 해제. 볼 크기를 전환하면 간격이 더욱 강화되어 새로 방출된 세포를 깨고 핵을 완충제로 풀어 놓습니다. 원심분리의 여러 인스턴스는 핵을 세포 잔해의 나머지 부분과 분리하여 깨끗한 핵 추출물의 수집을 허용합니다. 발치 균질화는 여러 가지 이유로 Dounce 균질화보다 선호됩니다 : 시스템은 한 번의 시도에서 높은 양의 활성 단백질을 추출 할 수 있도록 많은 수의 동물을 처리 할 수 있습니다. 공과 강철 블록의 정확한 가공은 여러 샘플 사이의 일관된 연삭을 허용합니다. 무거운 강철 블록은 방열판 역할을하며 연삭 챔버에서 균일하게 열을 끌어 들여 데칭을 방지합니다.
격리 후, 핵 추출물 전사 활성은 생화학 적 실험에 사용되기 전에 검증되어야합니다. 전통적으로, 전사 활성은 방사성 표지된 뉴클레오티드를 사용하여 측정하여 새로 합성된 RNA를 추적하고 시각화하였다. 그러나 방사성 라벨은 사용 및 폐기 시 예방 조치가 필요하기 때문에 부담스러울 수 있습니다6. 기술 발전은 오늘날 연구원들이 훨씬 덜 유해하거나 번거로운 방법을 사용하여 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)7과 같은 기술을 사용하여 소량의 RNA 양을 측정 할 수 있게합니다. 여기서, 프로토콜은 애벌레 단계 4 (L4) C. elegans 에서 활성 핵 추출물을 분리하고 체외 시스템에서 전사 활성을 시각화하는 방법을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Consumables and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL 8-Strip Tubes &#38; Flat Strip Caps, Clear</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL Individual PCR tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-153G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL sterile microtubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-282S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% absolute molecular grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP2818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol, Koptec</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>&#160;V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm petri plates</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>&#160;T3325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;28-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL plastic syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Norm-Ject syringes</td>
			<td>Henke-Sass Wolf GmbH</td>
			<td>4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL vacuum filter cup 0.22 &#181;m PES, Stericup Millipore Express Plus</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Criterion</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;C7432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>&#160;CA3510-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol proof marker</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;90000-264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans</td>
			<td>CGC</td>
			<td>N2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;15508-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel stain, SYBR safe</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder mix, O&#8217;gene ruler</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Loading Dye, 6x TriTrack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;FERR1161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase, Baseline-ZERO</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;DB0715K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50 strain</td>
			<td>CGC</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe</td>
			<td>Promega</td>
			<td>&#160;E3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes Solution, 1 M Gibco</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 37%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypochlorite bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium weigh dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;02-202-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides, Vista vision</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>16004-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade water, Hypure</td>
			<td>Hyclone Laboratories</td>
			<td>&#160;SH30538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;N1638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR system, FailSafe with premix A</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;FS99100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P39111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein assay kit, Qubit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;Q33211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse transcription kit, Sensiscript</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction kit RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>&#160;N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;BDH9286-12KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;1-09137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filter with 0.2 &#181;m Polyethersulfone membrane</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>28145-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;200-334-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Forward 5&#8217;- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Reverse 5&#8217;- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C freezer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer</td>
			<td>Isobiotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, Eppendorf 5418 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5401000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, VWR Clinical 50</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82013-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope, Leica M80</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer, Qubit 2.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging system, iBright FL1500</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;A44241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>12621-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges, Eppendorf 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETBOY acu 2</td>
			<td>Integra</td>
			<td>155017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking platform</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription

Caenorhabditis elegans는 1963년에 도입된 이래 생물학 연구를 위한 중요한 모형 시스템이었습니다. 그러나, C. elegans는 체외 전사 및 DNA 복제와 같은 핵 추출물을 사용하여 생물학적 반응의 생화학 연구에서 완전히 활용되지 않았습니다. 생화학 연구에서 C. elegans를 사용 하 여 중요 한 장애물은 핵 추출 물의 활동을 희생 하지 않고 선충의 두꺼운 외부 큐 티 클을 방해. 여러 가지 방법은 Dounce 균질화 또는 초음파 처리와 같은 표피를 깨는 데 사용되지만 종종 단백질 불안정으로 이어질 수 있습니다. 체외 반응에 대한 애벌레 또는 성인 C. elegans에서 활성 핵 단백질을 격리하기위한 확립 된 프로토콜이 없습니다. 여기서, 프로토콜은 발치 균질화제를 사용하여 애벌레 단계 4 C. elegans의 균질화를 자세히 설명합니다. 발치 균질화는 압력을 사용하여 동물을 천천히 좁은 틈새를 통해 동물을 강제로 밀어 내어 그 과정에서 큐티클을 깨뜨린다. 발치 균질화제의 균일한 디자인과 정밀한 가공은 실험 사이에 동물의 일관된 분쇄를 가능하게 합니다. 발치 균질화로부터 얻은 균질화는 C. 예르건의 전사 활성을 속이는 시험관 내 방법으로 사용될 수 있는 기능적으로 활성 핵 추출물을 산출한다.

설명된 단계에 따라 기능성 핵 추출물 (그림 1)을 산출해야 하며, 연삭 또는 세척 단계의 편차는 활동이 좋지 않거나 수율이 낮을 수 있습니다. 기능성 C. elegans 핵 추출물이 얻어지면, 이전에 기술된 시험관 분석 에 추가될 때 DNA 템플릿상CMV 프로모터의 하류 영역을 전사한다. 결과 RNA 전사체는 종래의 방법을 사용하여 핵 단백질 및 DNA ?...

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Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

여기서는 애벌레 4C. 예르간 에서 활성 핵 추출물을 분리하고 체외 시스템에서 전사 활동을 시각화하기 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

생체외 전사에 대한 활성 Caenorhabditis elegans 핵 추출물 및 재구성의 고립

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

이 프로토콜은 C.elegans의 생화학 연구를 위한 기술적인 격차를 채우고 모형 유기체로 그들의 유용성을 확장합니다. 이 기술은 간단하고 견고하며 기능적으로 활성 C.elegans 핵 추출물을 일관되게 격리할 수 있습니다. 먼저 동기화된 L1 동물을 10 150mm 선충 성장 미디어 함유 플레이트에 Escherichia coli OP50으로 시드하고, 동물이 L4 단계에 도달할 때까지 섭씨 20도에서 48시간 동안 성장할 수 있도록 합니다.저근상 및 고독 완충제가 준비되면 70%에탄올로 분쇄챔버를 범람하여 발치 균질화제를 청소하십시오. 그런 다음 여분의 에탄올을 제거하기 위해 탈이온 된 물로 챔버를 헹구는 다. 텅스텐 초경 공을 연삭 챔버에 삽입합니다.발치 균질화의 배럴 의 끝을 캡, 제공된 엄지 나사와 캡을 확보. 그런 다음 텍스트 원고에 설명된 대로 샘플당 완전한 저혈압 및 고독 버퍼 5밀리리터를 준비합니다. 다음으로 멸균, 완전한 저혈압 완충제 1밀리리터로 2밀리리터 주사기를 채우고 발치 균질화제의 연삭 챔버를 부드럽게 플러시하여 약 500마이크로리터의 완전한 저혈압 버퍼를 챔버에 남깁니다.플러시 균질화제를 얼음위에 보관하고 30분 동안 식힙니다. 15밀리리터 원물 튜브에서 M9 버퍼로 잘 먹인 L4 동물을 수집하고, 동물을 3분 동안 1, 000배 g에서 원심분리합니다. 상체를 제거하고, 상체가 명확해질 때까지 동물 펠릿을 계속 씻는다.다음으로 차가운 저혈압 완충제 의 세 밀리리터와 원심 분리기로 동물을 씻어 설명대로 다시 씻어. 상체 저혈압 버퍼를 제거한 후 동물 펠릿에 완전한 저혈압 버퍼 1 밀리리터를 추가하고 동물 현탁액을 새로운 멸균 2 밀리리터 주사기로 옮직합니다. 얼음 위에 보관된 동물을 균질화하기 위해 텅스텐 볼이 들어있는 발치 균질화제의 분쇄 챔버를 부드럽게 밀어 넣습니다.그런 다음 동물을 주사기에 다시 모으고이 절차를 30 번 반복하십시오. 30사이클의 균질화 후 발치 균질화로부터 최대 동물 현탁액을 수집하고, 1.7밀리리터 마이크로튜브 내부에 아래쪽으로 배치된 팁으로 주사기를 보관한다. 텅스텐 공을 제거하고, 탈이온 물로 분쇄 챔버를 청소합니다.건조하고 각각의 레이블튜브에 공을 반환합니다. 그런 다음 7.9880 밀리미터 직경과 12 마이크로미터 갭 클리어런스를 연삭 챔버에 삽입하고 균질화기를 다시 밀봉합니다. 얼음 차가운 완전한 저혈압 버퍼 1 밀리리터로 분쇄 챔버를 다시 플러시하십시오.현탁액을 25회 갈아도. 동물 현탁액을 깨끗한 1.7 밀리리터 마이크로튜브로 옮기고 서스펜션을 얼음 위에 보관합니다. 원심분리에 의해 동물의 몸과 파편을 아래로 펠릿.피펫 40 마이크로리터는 입력 분수로 표시된 튜브에 상체40 마이크로리터를 저장하고 얼음에 분획을 저장합니다. 펠릿을 방해하지 않고 새로운 1.7 밀리리터 튜브로 남은 상체를 옮기고, 원심분리기를 핵을 펠릿으로 옮기다. 그런 다음 펠릿 핵을 방해하지 않고 체세포 분획으로 표시된 새로운 1.7 밀리리터 튜브로 체상화를 전달합니다.핵 펠릿을 세척하려면 펠릿에 완전한 저혈압 완충제 500 마이크로리터를 추가하고 펠릿을 중단하고 원심분리기를 섭씨 4도에서 000배 에서 5분간 첨가합니다. 원심분리가 끝나면, 500마이크로리터의 핵펠릿을 신선한 완전한 저혈압 완충제로 재보중단하고, 다시 시료를 원심분리한다. 그런 다음 펠릿을 완전한 고원완의 40 마이크로리터에 녹입니다.핵 현탁액을 핵 분획으로 표시된 새로운 1.7 밀리리터 튜브로 옮기고 얼음 위에 보관하십시오. 형광 정량화 키트를 사용하여 3분분의 단백질 농도를 결정합니다. 핵 분획을 핵 단백질 6마이크로그램을 포함하는 일회용 튜브에 알리쿼트하고 드라이 아이스와 에탄올 욕조에서 동결을 스냅합니다.추가 사용까지 샘플을 영하 80도까지 보관하십시오. 대표적인 젤 이미지는 CMV 프로모터 DNA 템플릿을 이용한 Caenorhabditis elegans L4 애벌레 핵 추출물의 전사 산물을 보여줍니다. 활성 핵 단백질의 성공적인 격리는 시험관 내 전사 후 132 개의 베이스 페어 밴드가 발생했으며, 실패한 격리는 약한 밴드 또는 밴드의 부재를 초래했습니다.전체 버퍼에 명확하게 레이블을 지정해야 합니다. 부적절한 완충제는 핵 단백질의 기능에 해를 끼칠 수 있습니다. 또한 균질화 얼음을 차갑게 유지하여 단백질의 데마징을 방지합니다.이 기술을 개발하면 연구자들은 스트레스가 많은 조건 동안 C.elegans의 RNA 전사 속도를 측정할 수 있게 되어 환경 조건에 따라 동물의 전사 율이 변경될 수 있음을 보여 주어 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

절연 및 호흡 측정의 미토 콘 드리 아 애기 thaliana 에서

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

연구

생화학

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

꼬마 선 충 에서 높은 처리량 화학 심사 하는 간단한 방법

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

정화 및 분 광 분석에 대 한 TRPV1의 재구성

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

소규모 색도계 분석 실험의 세포내 젖이 나올와 꼬마 선 충 의 선 충 Pyruvate

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

꼬마 선 충의 대규모 재배 플레이트 기반: 당뇨병에서 대사 변경의 연구에 대 한 샘플 준비

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

생체 외에서 자가 지원된 지질 Bilayers에 단백질 패턴 구성의 재구성

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

생리 적으로 활성 Thylakoids 및 에너지 의존 단백질 수송 분석 실험에 있는 그들의 사용의 격리

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

전사에서 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 생체층 간섭측정기(BLI) 적용

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

케노하브디티스 예쁜꼬마선충에서 2-아라키도노일글리세롤의 정량화를 위한 신분화 표준의 합성

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

체노하브디염 예쁜꼬마선충의 단백질 상호작용 연구를 위한 생체내 하이드록실 라디칼 단백질 발자국

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...