Name: isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription
Uploaded: 2021-08-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av et NIH MIRA-tilskudd (R35GM124678 til J. S.).

1. Medieforberedelser
<ol><li>Forbered steril lysogenibuljong (LB) agarplater og flytende medier i henhold til produsentens instruksjoner.</li>
	<li>Streak Escherichia coli (E. coli) strekker OP50 på en LB agar plate. Inkuber bakteriene ved 37 °C over natten.</li>
	<li>Oppbevar E. coli OP50-strekplaten ved 4 °C etter inkubasjon. E. coli OP50-platen kan trygt oppbevares ved 4 °C i 2 uker hvis den pakkes inn i parafilm for å forhindre fuktighetstap.</li>
	<li>Forbered 2 L av Nemat...

<ol>
	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Blackwell, T. K., Walker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+mechanisms.">Transcription mechanisms.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-16 (2006).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-15 (2007).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+properties+of+the+Caenorhabditis+elegans+TATA-box-binding+protein.">Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+activation+of+transcription+by+UNC-86+and+MEC-3+in+Caenorhabditis+elegans+embryo+extracts.">Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts.</a> EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).</li><li>Shan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope-labeled+immunoassays+without+radiation+waste.">Isotope-labeled immunoassays without radiation waste.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).</li><li>Voss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+non-radioactive+eukaryotic+in+vitro+transcription+assay+for+sensitive+quantification+of+RNA+polymerase+II+activity.">A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity.</a> BMC Molecular Biology. 15, 7 (2014).</li><li>Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+Caenorhabditis+elegans+transcription+system.">A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87 (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Zbacnik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+buffers+in+protein+formulations.">Role of buffers in protein formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).</li></ol>

C. elegans er en tiltalende modellorganisme for å studere det eukaryote transkripsjonssystemet på grunn av det rimelige vedlikeholdet og den enkle genetiske manipulasjonen. Her beskrives en protokoll for konsekvent isolering av funksjonelt aktivt atomekstrakt fra L4 C. elegans . Selv om denne protokollen fokuserte på å visualisere transkripsjonsaktivitet, kan cDNA produsert etter transkripsjonsmessig kvantifiseres ved hjelp av RT-qPCR for å oppnå en mer presis måling av transkri...

Den lille, frittlevende nematoden Caenorhabditis elegans er en enkel, men kraftig modellorganisme for å adressere et bredt spekter av biologiske spørsmål. Siden introduksjonen i 1963 har nematodene vært uvurderlige for å svare på spørsmål innen nevrobiologi, metabolisme, aldring, utvikling, immunitet og genetikk1. Noen av dyrets mange egenskaper som gjør det til en ideell modellorganisme inkluderer kort generasjonstid, effektiviteten av RNA-interferens, gjennomsiktig kropp og de ferdige kartene over både cellulær avstamning og nervesystem.
Mens nematodens bidrag til vitenskapen er enorme, har de blitt underbrukt for å belyse det eukaryote transkripsjonssystemet, med det meste av vår forståelse om disse mekanismene som kommer fra studier som bruker atomekstrakt fra gjær, fruktflue og pattedyrcellekultur2. Det største hinderet som fraråder forskere å trekke ut funksjonell atomekstrakt er nematodens tøffe ytre kutikal. Dette eksoskjelettet består av krysskoblede kollagener, cuticlins, glykoproteiner og lipider, noe som gjør C. elegans fra larvalstadium til voksen alder motstandsdyktig mot proteinutvinning via kjemiske eller mekaniske krefter3. Et in vitro transkripsjonssystem ved hjelp av C. elegans kjernefysisk ekstrakt ble en gang utviklet, men ikke allment vedtatt på grunn av systemets begrensede omfang, og bruken av Dounce homogenisator for å forberede ekstraktet kan føre til protein ustabilitet4,5.
I motsetning til den forrige protokollen for kjernefysisk ekstraktisolasjon som brukte en Dounce homogenisator for å bryte C. elegans, bruker denne protokollen en Balch homogenisator. Balch homogenisator består av to hovedkomponenter: en wolframkarbidkule og en blokk i rustfritt stål med en kanal som kjeder seg gjennom fra den ene enden til den andre. Balch homogenisator er lastet med wolframkarbidkulen og avkortet på hver side for å forsegle slipekammeret. Sprøyter kan lastes på de to vertikale portene som fører inn i slipekammeret. Når materialet overføres fra den ene sprøyten til den andre gjennom slipekammeret, tvinger trykket fra sprøytene materialet gjennom et smalt gap mellom ballen og veggen av kammeret. Dette langsomme og konstante trykket bryter materialet til det når en konsistent størrelse som lett kan passere gjennom det smale gapet. Å tvinge C. elegans gjennom det smale gapet via et konstant, men mildt trykk bryter dyrene åpne, og frigjør innholdet i den omkringliggende bufferen. Veksling av kulestørrelser strammer gapet ytterligere, bryter de nylig utgitte cellene og frigjør kjernene i bufferen. Flere tilfeller av sentrifugering skiller kjernene fra resten av celleavfallet, noe som muliggjør innsamling av et rent atomekstrakt. Balch homogenisator er foretrukket fremfor Dounce homogenisator av flere grunner: systemet kan håndtere et stort antall dyr, noe som gjør det mulig å trekke ut en høy mengde aktive proteiner i et enkelt forsøk; den nøyaktige maskineringen av ballene og stålblokken gir konsistent sliping mellom flere prøver; Den tunge stålblokken fungerer som en kjøleribbe, og trekker ensartet varme bort fra slipekammeret, og forhindrer denaturering.
Etter isolasjon må den kjernefysiske ekstrakttranskripsjonsaktiviteten verifiseres før den brukes i biokjemiske eksperimenter. Tradisjonelt ble transkripsjonsaktivitet målt ved hjelp av radiomerkede nukleotider for å spore og visualisere den nylig syntetiserte RNA. Radioaktiv merking kan imidlertid være belastende, da det krever forsiktighet under bruk og avhending6. Teknologiske fremskritt gjør det mulig for forskere i dag å bruke mye mindre skadelige eller plagsomme metoder for å måle selv små RNA-mengder ved hjelp av teknikker som kvantitativ sanntids PCR (qRT-PCR)7. Her beskriver protokollen en metode for å isolere aktivt kjernefysisk ekstrakt fra larvaltrinn 4 (L4) C. elegans og visualisere transkripsjonsaktivitet i et in vitro-system.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Consumables and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL 8-Strip Tubes &#38; Flat Strip Caps, Clear</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL Individual PCR tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-153G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL sterile microtubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-282S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% absolute molecular grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP2818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol, Koptec</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>&#160;V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm petri plates</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>&#160;T3325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;28-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL plastic syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Norm-Ject syringes</td>
			<td>Henke-Sass Wolf GmbH</td>
			<td>4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL vacuum filter cup 0.22 &#181;m PES, Stericup Millipore Express Plus</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Criterion</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;C7432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>&#160;CA3510-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol proof marker</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;90000-264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans</td>
			<td>CGC</td>
			<td>N2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;15508-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel stain, SYBR safe</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder mix, O&#8217;gene ruler</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Loading Dye, 6x TriTrack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;FERR1161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase, Baseline-ZERO</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;DB0715K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50 strain</td>
			<td>CGC</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe</td>
			<td>Promega</td>
			<td>&#160;E3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes Solution, 1 M Gibco</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 37%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypochlorite bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium weigh dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;02-202-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides, Vista vision</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>16004-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade water, Hypure</td>
			<td>Hyclone Laboratories</td>
			<td>&#160;SH30538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;N1638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR system, FailSafe with premix A</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;FS99100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P39111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein assay kit, Qubit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;Q33211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse transcription kit, Sensiscript</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction kit RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>&#160;N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;BDH9286-12KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;1-09137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filter with 0.2 &#181;m Polyethersulfone membrane</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>28145-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;200-334-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Forward 5&#8217;- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Reverse 5&#8217;- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C freezer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer</td>
			<td>Isobiotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, Eppendorf 5418 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5401000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, VWR Clinical 50</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82013-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope, Leica M80</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer, Qubit 2.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging system, iBright FL1500</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;A44241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>12621-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges, Eppendorf 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETBOY acu 2</td>
			<td>Integra</td>
			<td>155017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking platform</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription

Caenorhabditis elegans har vært et viktig modellsystem for biologisk forskning siden det ble introdusert i 1963. Imidlertid har C. elegans ikke blitt fullt utnyttet i den biokjemiske studien av biologiske reaksjoner ved hjelp av sine kjernefysiske ekstrakter som in vitro transkripsjon og DNA-replikasjon. Et betydelig hinder for å bruke C. elegans i biokjemiske studier forstyrrer nematodens tykke ytre kutikal uten å ofre aktiviteten til atomekstraktet. Mens flere metoder brukes til å bryte kutiklet, for eksempel Dounce homogenisering eller sonikering, fører de ofte til protein ustabilitet. Det er ingen etablerte protokoller for å isolere aktive atomproteiner fra larve eller voksne C. elegans for in vitro-reaksjoner . Her beskriver protokollen i detalj homogeniseringen av larvetrinn 4 C. elegans ved hjelp av en Balch homogenisator. Balch homogenisator bruker trykk for å sakte tvinge dyrene gjennom et smalt gap som bryter kutiklet i prosessen. Den ensartede designen og presis maskinering av Balch homogenisator muliggjør konsekvent sliping av dyr mellom eksperimenter. Fraksjonering av homogenatet oppnådd fra Balch homogenisator gir funksjonelt aktiv kjernefysisk ekstrakt som kan brukes i en in vitro-metode for analyse av transkripsjonsaktivitet av C. elegans.

Ved å følge de skisserte trinnene skal gi funksjonell kjerneekstrakt (figur 1), kan avvik i slipe- eller vasketrinnene føre til dårlig aktivitet eller lave utbytter. Hvis funksjonell C. elegans kjernefysisk ekstrakt oppnås, vil det transkribere regionen nedstrøms CMV-promotoren på DNA-malen når den legges til den tidligere beskrevne in vitro-analysen . Den resulterende RNA-transkripsjonen kan renses fra atomproteiner og DNA-mal ved ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription at JoVE.com

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Her beskriver vi en detaljert protokoll for å isolere aktivt atomekstrakt fra larvaltrinn 4 C. elegans og visualisere transkripsjonsaktivitet i et in vitro-system .

Isolering av aktiv caenorhabditt elegans kjernefysisk ekstrakt og rekonstituering for in vitro transkripsjon

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

Denne protokollen fyller et teknisk gap for den biokjemiske studien av C.elegans og utvider deres nytte som modellorganisme. Denne teknikken er både enkel og robust, noe som gir konsistent isolasjon av funksjonelt aktive C.elegans kjernefysiske ekstrakt. Begynn med å plassere de synkroniserte L1-dyrene på 10 150 millimeter nematodevekstmedieholdige plater frøet med Escherichia coli OP50, og la dyrene vokse i 48 timer ved 20 grader Celsius til de når L4-scenen.Når de hypotoniske og hypertoniske bufferne er forberedt, rengjør Balch homogenisatoren ved å oversvømme slipekammeret med 70% etanol. Skyll deretter kammeret med deionisert vann for å fjerne overflødig etanol. Sett wolframkarbidkulen inn i slipekammeret.Cap endene av Balch homogenisatorens fat, og sikre hettene med de medfølgende tommelskruene. Forbered deretter fem milliliter av de komplette hypotoniske og hypertoniske bufferne per prøve som beskrevet i tekstmanuskriptet. Fyll deretter en steril sprøyte med to milliliter med en milliliter komplett hypotonisk buffer, og skyll forsiktig slipekammeret til Balch-homogenisatoren, og la omtrent 500 mikroliter med komplett hypotonisk buffer i kammeret.Oppbevar den spylte homogenisatoren på is, og la den avkjøles i 30 minutter. Samle de godt matede L4-dyrene med M9-buffer i et 15 milliliter konisk rør, og sentrifuger dyrene på 1000 ganger g i tre minutter. Fjern supernatanten, og fortsett å vaske dyrepellet til supernatanten er klar.Vask deretter dyrene med tre milliliter kald hypotonisk buffer, og sentrifuger igjen som demonstrert. Etter å ha fjernet den supernatante hypotoniske bufferen, legg til en milliliter komplett hypotonisk buffer til dyrepelleten, og overfør dyreopphenget til en ny steril, to milliliter sprøyte. For homogenisering av dyrene som holdes på is, skyv dyrene forsiktig gjennom slipekammeret til Balch homogenisatoren lastet med wolframkulen.Samle deretter dyrene tilbake i sprøyten, og gjenta denne prosedyren 30 ganger. Etter 30 sykluser med homogenisering, samle maksimal dyreoppheng fra Balch homogenisator, og lagre sprøyten med spissen plassert nedover inne i en 1,7 milliliter mikrotube. Fjern wolframkulen, og rengjør slipekammeret med deionisert vann.Tørk og returner ballen til det respektive merkede røret. Sett deretter wolframkulen med 7,9880 millimeter diameter og 12 mikrometer gapklaring inn i slipekammeret, og reseal homogenisatoren. Skyll slipekammeret igjen med en milliliter iskald, komplett hypotonisk buffer.Slip suspensjonen 25 ganger som vist. Overfør dyrets suspensjon til en ren, 1,7 milliliter mikrotube, og lagre suspensjonen på is. Pellet ned dyrekroppene og rusk ved sentrifugering.Pipette 40 mikroliter av supernatanten til et rør merket som inngangsfraksjon, og lagre fraksjonen på is. Overfør den gjenværende supernatanten til et nytt 1,7 milliliterrør uten å forstyrre pelletsen, og sentrifuger til pelletskjernen. Overfør deretter supernatanten uten å forstyrre de pelleterte kjernene til et nytt 1,7 milliliterrør merket som cytosolisk brøkdel.For å vaske kjernen pellet, legg til 500 mikroliter med komplett hypotonisk buffer til pellets, suspendere pellets og sentrifuger ved 4000 ganger g ved fire grader Celsius i fem minutter. På slutten av sentrifugeringen, resuspend kjernefysisk pellet i 500 mikroliter av frisk komplett hypotonisk buffer, og igjen sentrifugere prøven som demonstrert. Løs deretter pelletsen i 40 mikroliter med fullstendig hypertonisk buffer.Overfør kjernefysisk suspensjon til et nytt 1,7 milliliterrør merket kjernefysisk brøkdel, og lagre det på is. Bestem proteinkonsentrasjonen av tre fraksjoner ved hjelp av et fluorescerende kvantifiseringssett. Aliquot kjernefysiske fraksjoner i engangsrør som inneholder seks mikrogram av atomproteinet, og snap fryse i tørris og etanol bad.Oppbevar prøvene ved minus 80 grader Celsius inntil videre bruk. Det representative gelbildet viser transkripsjonsproduktene til Caenorhabditis elegans L4 larver kjernefysisk ekstrakt ved hjelp av CMV-promotør DNA-malen. Den vellykkede isolasjonen av aktive kjerneproteiner resulterte i et 132 baseparbånd etter en in vitro-transkripsjon, og mislykket isolasjon resulterte i et svakt bånd eller fravær av et band.Husk å merke de fullstendige bufferne tydelig. Upassende buffere kan skade funksjonaliteten til atomproteinene. Hold også homogenisatoren iskald for å forhindre denaturering av proteinene.Utvikling av denne teknikken tillot forskere å måle frekvensen av RNA-transkripsjon av C.elegans under stressende forhold, og viste at dyrets transkripsjonshastighet kan endres avhengig av miljøforhold.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolasjon og respiratoriske målinger av mitokondrier fra Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metode for høy gjennomstrømning kjemiske Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensing og rekonstituering av TRPV1 for Spectroscopic analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Småskala kolorimetrisk analyser av intracellulær laktat og Pyruvate i Rundormer Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-baserte stor skala dyrking av Caenorhabditis elegans: Sample forberedelse for studiet av metabolske forandringer i Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Rekonstituering selv organisere Protein mønstre på støttede Lipid Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolering av fysiologisk aktiv Thylakoids og deres bruk i energi avhengig av Protein Transport analyser

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Anvendelse av Biolayer laboratoriefasiliteter (BLI) for å studere protein-protein interaksjoner i transkripsjon

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Syntese av en Deuterert standard for kvantifisering av 2-Arachidonoylglycerol i Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for studiet av proteininteraksjoner i Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...