Name: isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription
Uploaded: 2021-08-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом NIH MIRA (R35GM124678 для J. S.).

1. Подготовка СМИ
<ol><li>Приготовьте стерильный лизогенный бульон (LB) агаровые пластины и жидкие среды, следуя инструкциям производителя.</li>
	<li>Полоса кишечной палочки (E. coli) штамм OP50 на агаровой пластине LB. Инкубируйте полосу бактерий при 37 °C в течение ночи.</li>
	<li>Храните пластин...

<ol>
	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Blackwell, T. K., Walker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+mechanisms.">Transcription mechanisms.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-16 (2006).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-15 (2007).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+properties+of+the+Caenorhabditis+elegans+TATA-box-binding+protein.">Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+activation+of+transcription+by+UNC-86+and+MEC-3+in+Caenorhabditis+elegans+embryo+extracts.">Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts.</a> EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).</li><li>Shan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope-labeled+immunoassays+without+radiation+waste.">Isotope-labeled immunoassays without radiation waste.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).</li><li>Voss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+non-radioactive+eukaryotic+in+vitro+transcription+assay+for+sensitive+quantification+of+RNA+polymerase+II+activity.">A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity.</a> BMC Molecular Biology. 15, 7 (2014).</li><li>Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+Caenorhabditis+elegans+transcription+system.">A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87 (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Zbacnik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+buffers+in+protein+formulations.">Role of buffers in protein formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).</li></ol>

C. elegans является привлекательным модельным организмом для изучения системы эукариотической транскрипции из-за ее недорогого обслуживания и простоты генетических манипуляций. Здесь описан протокол последовательного выделения функционально активного ядерного экстракта из L4 C. e...

Маленькая, свободно живущая нематода Caenorhabditis elegans является простым, но мощным модельным организмом для решения широкого круга биологических вопросов. С момента своего появления в 1963 году нематоды были бесценны для ответа на вопросы в нейробиологии, метаболизме, старении, развитии, иммунитете и генетике1. Некоторые из многих характеристик животного, которые делают его идеальным модельным организмом, включают короткое время генерации, эффективность РНК-интерференции, прозрачное тело и завершенные карты как его клеточной линии, так и нервной системы.
Хотя вклад нематод в науку огромен, они были недостаточно использованы для выяснения системы транскрипции эукариот, причем большая часть нашего понимания этих механизмов исходит из исследований с использованием ядерного экстракта дрожжей, плодовой мухи и культуры клеток млекопитающих2. Самым большим препятствием, которое отговаривает исследователей от извлечения функционального ядерного экстракта, является жесткая внешняя кутикула нематоды. Этот экзоскелет содержит сшитые коллагены, кутиклины, гликопротеины и липиды, что делает C. elegans от личиночной стадии до взрослой жизни устойчивыми к экстракции белка с помощью химических или механических сил3. Система транскрипции in vitro с использованием ядерного экстракта C. elegans была когда-то разработана, но не получила широкого распространения из-за ограниченного объема системы, и использование гомогенизатора Dounce для приготовления экстракта может привести к нестабильности белка4,5.
В отличие от предыдущего протокола для изоляции ядерного экстракта, в котором использовался гомогенизатор Dounce для разрушения C. elegans, этот протокол использует гомогенизатор Balch. Гомогенизатор Balch состоит из двух основных компонентов: шарика из карбида вольфрама и блока из нержавеющей стали с каналом, просверленным от одного конца до другого. Гомогенизатор Balch загружается шариком из карбида вольфрама и закрывается с обеих сторон для герметизации шлифовальной камеры. Шприцы могут быть загружены на два вертикальных порта, ведущих в шлифовальную камеру. Когда материал передается от одного шприца к другому через шлифовальную камеру, давление от шприцев заставляет материал проходить через узкий зазор между шаром и стенкой камеры. Это медленное и постоянное давление разрушает материал, пока он не достигнет постоянного размера, который способен легко проходить через узкий зазор. Заставляя C. elegans проходить через узкую щель с помощью постоянного, но мягкого давления, животные открываются, выпуская их содержимое в окружающий буфер. Переключение размеров шарика еще больше затягивает зазор, разрывая вновь высвобождаемые клетки и освобождая ядра в буфер. Многочисленные случаи центрифугирования отделяют ядра от остального клеточного мусора, что позволяет собирать чистый ядерный экстракт. Гомогенизатор Balch предпочтительнее гомогенизатора Dounce по нескольким причинам: система может обрабатывать большое количество животных, что позволяет извлекать большое количество активных белков за одну попытку; точная обработка шариков и стального блока обеспечивает последовательное шлифование между несколькими образцами; тяжелый стальной блок действует как радиатор, равномерно отводя тепло от шлифовальной камеры, предотвращая денатурацию.
После выделения транскрипционная активность ядерного экстракта должна быть проверена перед использованием в любых биохимических экспериментах. Традиционно активность транскрипции измеряли с использованием меченых радиоактивными нуклеотидами для отслеживания и визуализации вновь синтезированной РНК. Однако радиоактивная маркировка может быть обременительной, поскольку она требует предосторожности во время использования и удаления6. Технологические достижения позволяют исследователям сегодня использовать гораздо менее вредные или неприятные методы для измерения даже небольших количеств РНК с использованием таких методов, как количественная ПЦР в реальном времени (qRT-PCR)7. Здесь протокол описывает метод выделения активного ядерного экстракта из личиночной стадии 4 (L4) C. elegans и визуализации транскрипционной активности в системе in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Consumables and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL 8-Strip Tubes &#38; Flat Strip Caps, Clear</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL Individual PCR tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-153G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL sterile microtubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-282S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% absolute molecular grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP2818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol, Koptec</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>&#160;V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm petri plates</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>&#160;T3325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;28-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL plastic syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Norm-Ject syringes</td>
			<td>Henke-Sass Wolf GmbH</td>
			<td>4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL vacuum filter cup 0.22 &#181;m PES, Stericup Millipore Express Plus</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Criterion</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;C7432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>&#160;CA3510-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol proof marker</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;90000-264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans</td>
			<td>CGC</td>
			<td>N2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;15508-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel stain, SYBR safe</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder mix, O&#8217;gene ruler</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Loading Dye, 6x TriTrack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;FERR1161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase, Baseline-ZERO</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;DB0715K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50 strain</td>
			<td>CGC</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe</td>
			<td>Promega</td>
			<td>&#160;E3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes Solution, 1 M Gibco</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 37%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypochlorite bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium weigh dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;02-202-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides, Vista vision</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>16004-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade water, Hypure</td>
			<td>Hyclone Laboratories</td>
			<td>&#160;SH30538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;N1638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR system, FailSafe with premix A</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;FS99100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P39111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein assay kit, Qubit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;Q33211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse transcription kit, Sensiscript</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction kit RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>&#160;N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;BDH9286-12KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;1-09137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filter with 0.2 &#181;m Polyethersulfone membrane</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>28145-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;200-334-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Forward 5&#8217;- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Reverse 5&#8217;- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C freezer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer</td>
			<td>Isobiotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, Eppendorf 5418 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5401000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, VWR Clinical 50</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82013-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope, Leica M80</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer, Qubit 2.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging system, iBright FL1500</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;A44241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>12621-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges, Eppendorf 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETBOY acu 2</td>
			<td>Integra</td>
			<td>155017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking platform</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription

Caenorhabditis elegans является важной модельной системой для биологических исследований с тех пор, как она была введена в 1963 году. Однако C. elegans не был полностью использован в биохимическом исследовании биологических реакций с использованием его ядерных экстрактов, таких как транскрипция in vitro и репликация ДНК. Значительным препятствием для использования C. elegans в биохимических исследованиях является разрушение толстой внешней кутикулы нематоды без ущерба для активности ядерного экстракта. Хотя для разрушения кутикулы используется несколько методов, таких как гомогенизация Dounce или обработка ультразвуком, они часто приводят к нестабильности белка. Не существует установленных протоколов выделения активных ядерных белков из личинок или взрослых C. elegans для реакций in vitro . Здесь протокол подробно описывает гомогенизацию личинок стадии 4 C. elegans с использованием гомогенизатора Balch. Гомогенизатор Balch использует давление, чтобы медленно проталкивать животных через узкую щель, разрывающую кутикулу в процессе. Однородная конструкция и точная обработка гомогенизатора Balch обеспечивают последовательное измельчение животных между экспериментами. Фракционирование гомогената, полученного из гомогенизатора Балха, дает функционально активный ядерный экстракт, который может быть использован в методе in vitro для анализа транскрипционной активности C. elegans.

Следуя описанным шагам, следует получить функциональный ядерный экстракт (рисунок 1), отклонение на этапах измельчения или промывки может привести к плохой активности или низкому выходу. Если получен функциональный ядерный экстракт C. elegans , он буд...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription at JoVE.com

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Здесь мы опишем подробный протокол выделения активного ядерного экстракта из личиночной стадии 4 C. elegans и визуализации транскрипционной активности в системе in vitro .

Выделение активного caenorhabditis elegans Nuclear Extract и восстановление для транскрипции in vitro

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

Этот протокол заполняет технический пробел для биохимического изучения C.elegans и расширяет их полезность в качестве модельного организма. Этот метод является простым и надежным, что позволяет последовательно выделять функционально активный ядерный экстракт C.elegans. Начните с размещения синхронизированных животных L1 на 10 150-миллиметровых пластинах, содержащих питательные среды нематод, засеянных Escherichia coli OP50, и позвольте животным расти в течение 48 часов при 20 градусах Цельсия, пока они не достигнут стадии L4.После того, как гипотонические и гипертонические буферы подготовлены, очистите гомогенизатор Balch, затопив камеру измельчения 70% этанолом. Затем промойте камеру деионизированной водой, чтобы удалить избыток этанола. Вставьте шарик из карбида вольфрама в шлифовальную камеру.Закройте концы ствола гомогенизатора Balch и закрепите крышки с помощью прилагаемых винтов. Затем подготовьте пять миллилитров полного гипотонического и гипертонического буферов на образец, как описано в тексте рукописи. Затем заполните стерильный двухмиллилитровой шприц одним миллилитром полного гипотонического буфера и осторожно промывайте шлифовальную камеру гомогенизатора Балха, оставив в камере примерно 500 микролитров полного гипотонического буфера.Храните промытый гомогенизатор на льду и дайте ему остыть в течение 30 минут. Соберите сытых животных L4 с буфером M9 в 15-миллилитровую коническую трубку и центрифугируйте животных по 1000 раз в г в течение трех минут. Удалите супернатант и продолжайте мыть гранулы животного до тех пор, пока супернатант не станет прозрачным.Затем промыть животных тремя миллилитрами холодного гипотонического буфера и снова центрифугой, как показано. После удаления надводного гипотонического буфера добавьте один миллилитр полного гипотонического буфера к грануле животного и перенесите суспензию животного в новый стерильный двухмиллилитровой шприц. Для гомогенизации животных, содержащихся на льду, осторожно протолкните животных через шлифовальную камеру гомогенизатора Balch, загруженного вольфрамовым шариком.Затем соберите животных обратно в шприц и повторите эту процедуру 30 раз. После 30 циклов гомогенизации соберите максимальную суспензию животного из гомогенизатора Balch и храните шприц с наконечником, расположенным вниз внутри 1,7-миллилитровой микротрубки. Извлеките вольфрамовый шарик и очистите шлифовальную камеру деионизированной водой.Высушите и верните шарик в соответствующую маркированную трубку. Затем вставьте вольфрамовый шарик диаметром 7,9880 миллиметра и зазором 12 микрометров в шлифовальную камеру и повторно запечатайте гомогенизатор. Снова промыть камеру измельчения одним миллилитром ледяного полного гипотонического буфера.Измельчите суспензию 25 раз, как показано на рисунке. Переложите суспензию животного в чистую 1,7-миллилитровую микропробирку и храните суспензию на льду. Наносите удары по телам животных и мусору путем центрифугирования.Пипетка 40 микролитров супернатанта в трубку, помеченную как входная фракция, и храните фракцию на льду. Перенесите оставшийся супернатант в новую 1,7-миллилитровую трубку, не нарушая гранулу, и центрифугу для гранулирования ядер. Затем перенесите супернатант, не нарушая гранулированные ядра, в новую 1,7-миллилитровую трубку, помеченную как цитозольная фракция.Чтобы промыть гранулу ядер, добавьте в гранулу 500 микролитров полного гипотонического буфера, суспендируйте гранулу и центрифугируйте в 4000 раз в г при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. В конце центрифугирования повторно суспендируют ядерную гранулу в 500 микролитрах свежего полного гипотонического буфера и снова центрифугируют образец, как показано на рисунке. Затем растворить гранулу в 40 микролитрах полного гипертонического буфера.Перенесите ядерную суспензию в новую 1,7-миллилитровую трубку с маркировкой ядерной фракции и храните ее на льду. Определите концентрацию белка в трех фракциях с помощью флуоресцентного количественного набора. Аликвотирование ядерных фракций в одноразовые пробирки, содержащие шесть микрограммов ядерного белка, и мгновенная заморозка в ванне с сухим льдом и этанолом.Храните образцы при температуре минус 80 градусов цельсия до дальнейшего использования. Репрезентативное изображение геля показывает продукты транскрипции ядерного экстракта личинок Caenorhabditis elegans L4 с использованием шаблона ДНК промотора ЦМВ. Успешная изоляция активных ядерных белков привела к созданию полосы 132 пар оснований после транскрипции in vitro, а неудачная изоляция привела к слабой полосе или отсутствию полосы.Не забудьте четко обозначить полные буферы. Неподходящие буферы могут нанести вред функциональности ядерных белков. Кроме того, держите гомогенизатор ледяным холодным, чтобы предотвратить денатурацию белков.Разработка этого метода позволила исследователям измерить скорость транскрипции РНК C.elegans во время стрессовых условий, показав, что скорость транскрипции животного может изменяться в зависимости от условий окружающей среды.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Изоляция и дыхательных измерения митохондрий от Резуховидка Таля

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Простой метод для высокой пропускной способности химического скрининга в Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Очистка и восстановление TRPV1 для спектроскопического анализа

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Мелких колориметрические Assays внутриклеточных лактата и пирувата в нематоды Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

На основе плиты крупномасштабного культивирования Caenorhabditis elegans: Пробоподготовка для изучения метаболические изменения при сахарном диабете

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

В пробирке Воссоздание самоорганизующихся структур белков на поддерживаемых липидных бислоев

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Изоляция физиологически активных тилакоидов и их использования в энергии зависимых белков транспорт анализов

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Применение биослойной интерферометрии (BLI) для изучения белково-белковых взаимодействий в транскрипции

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Синтез пониженного стандарта для количественной оценки 2-Arachidonoylglycerol в Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

В Vivo Hydroxyl радикальный белок следдля изучения взаимодействия белков в Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...