Name: isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription
Uploaded: 2021-08-11T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por una subvención NIH MIRA (R35GM124678 a J. S.).

1. Preparación de los medios de comunicación
<ol><li>Prepare placas de agar de caldo de lisogenia (LB) estériles y medios líquidos siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Streak Escherichia coli (E. coli) cepa OP50 en una placa de agar LB. Incubar la racha de bacterias a 37 °C durante la noche.</li>
	<li>Guarde la placa de rayas de E. coli OP50 a 4 °C después de la incubación. La placa op50 de E. coli se puede almacenar de forma segura a 4 °C durante 2 semanas ...

<ol>
	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Blackwell, T. K., Walker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+mechanisms.">Transcription mechanisms.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-16 (2006).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-15 (2007).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+properties+of+the+Caenorhabditis+elegans+TATA-box-binding+protein.">Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+activation+of+transcription+by+UNC-86+and+MEC-3+in+Caenorhabditis+elegans+embryo+extracts.">Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts.</a> EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).</li><li>Shan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope-labeled+immunoassays+without+radiation+waste.">Isotope-labeled immunoassays without radiation waste.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).</li><li>Voss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+non-radioactive+eukaryotic+in+vitro+transcription+assay+for+sensitive+quantification+of+RNA+polymerase+II+activity.">A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity.</a> BMC Molecular Biology. 15, 7 (2014).</li><li>Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+Caenorhabditis+elegans+transcription+system.">A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87 (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Zbacnik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+buffers+in+protein+formulations.">Role of buffers in protein formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).</li></ol>

C. elegans es un organismo modelo atractivo para estudiar el sistema de transcripción eucariota debido a su bajo costo de mantenimiento y la facilidad de manipulación genética. Aquí se describe un protocolo para el aislamiento consistente del extracto nuclear funcionalmente activo de L4 C. elegans . Aunque este protocolo se centró en visualizar la actividad de transcripción, el ADNc producido post-transcripcionalmente se puede cuantificar mediante RT-qPCR para obtener una medición más precisa de...

El pequeño nematodo de vida libre Caenorhabditis elegans es un organismo modelo simple pero poderoso para abordar una amplia gama de preguntas biológicas. Desde su introducción en 1963, los nematodos han sido invaluables para responder preguntas en neurobiología, metabolismo, envejecimiento, desarrollo, inmunidad y genética1. Algunas de las muchas características del animal que lo convierten en un organismo modelo ideal incluyen el corto tiempo de generación, la efectividad de la interferencia de ARN, el cuerpo transparente y los mapas completos tanto de su linaje celular como de su sistema nervioso.
Si bien las contribuciones del nematodo a la ciencia son vastas, se han subutilizado para dilucidar el sistema de transcripción eucariota, y la mayor parte de nuestra comprensión sobre estos mecanismos proviene de estudios que utilizan extracto nuclear de levadura, mosca de la fruta y cultivo de células de mamíferos2. El mayor obstáculo que disuade a los investigadores de extraer extracto nuclear funcional es la dura cutícula externa del nematodo. Este exoesqueleto comprende colágenos, cuticlinas, glicoproteínas y lípidos reticulados, lo que hace que C. elegans desde la etapa larvaria hasta la edad adulta sea resistente a la extracción de proteínas a través de fuerzas químicas o mecánicas3. Una vez se desarrolló un sistema de transcripción in vitro que utiliza extracto nuclear de C. elegans, pero no se adoptó ampliamente debido al alcance limitado del sistema, y el uso del homogeneizador Dounce para preparar el extracto podría conducir a la inestabilidad de la proteína4,5.
A diferencia del protocolo anterior para el aislamiento de extractos nucleares que utilizaba un homogeneizador Dounce para romper C. elegans, este protocolo utiliza un homogeneizador Balch. El homogeneizador Balch consta de dos componentes principales: una bola de carburo de tungsteno y un bloque de acero inoxidable con un canal perforado de un extremo a otro. El homogeneizador Balch se carga con la bola de carburo de tungsteno y se tapa a cada lado para sellar la cámara de molienda. Las jeringas se pueden cargar en los dos puertos verticales que conducen a la cámara de molienda. A medida que el material pasa de una jeringa a la otra a través de la cámara de molienda, la presión de las jeringas fuerza el material a través de un espacio estrecho entre la bola y la pared de la cámara. Esta presión lenta y constante rompe el material hasta que alcanza un tamaño consistente que es capaz de pasar a través del espacio estrecho fácilmente. Forzar a C. elegans a través de la estrecha brecha a través de una presión constante pero suave rompe la apertura de los animales, liberando su contenido en el amortiguador circundante. Cambiar el tamaño de las bolas aprieta aún más la brecha, rompiendo las células recién liberadas y libera los núcleos en el tampón. Múltiples instancias de centrifugación separan los núcleos del resto de los desechos celulares, lo que permite la recolección de un extracto nuclear limpio. El homogeneizador Balch es preferido sobre el homogeneizador Dounce por varias razones: el sistema puede manejar una gran cantidad de animales, lo que permite extraer una gran cantidad de proteínas activas en un solo intento; el mecanizado preciso de las bolas y el bloque de acero permite un rectificado consistente entre múltiples muestras; el bloque de acero pesado actúa como un disipador de calor, extrayendo uniformemente el calor de la cámara de molienda, evitando la desnaturalización.
Después del aislamiento, la actividad transcripcional del extracto nuclear debe verificarse antes de ser utilizada en cualquier experimento bioquímico. Tradicionalmente, la actividad de transcripción se medía utilizando nucleótidos radiomarcados para rastrear y visualizar el ARN recién sintetizado. Sin embargo, el etiquetado radiactivo puede ser oneroso, ya que requiere precaución durante el uso y la eliminación6. Los avances tecnológicos permiten a los investigadores de hoy utilizar métodos mucho menos dañinos o problemáticos para medir incluso pequeñas cantidades de ARN utilizando técnicas como la PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)7. Aquí, el protocolo describe un método para aislar el extracto nuclear activo de la etapa larvaria 4 (L4) C. elegans y visualizar la actividad de transcripción en un sistema in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Consumables and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL 8-Strip Tubes &#38; Flat Strip Caps, Clear</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL Individual PCR tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-153G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL sterile microtubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-282S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% absolute molecular grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP2818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol, Koptec</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>&#160;V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm petri plates</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>&#160;T3325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;28-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL plastic syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Norm-Ject syringes</td>
			<td>Henke-Sass Wolf GmbH</td>
			<td>4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL vacuum filter cup 0.22 &#181;m PES, Stericup Millipore Express Plus</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Criterion</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;C7432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>&#160;CA3510-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol proof marker</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;90000-264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans</td>
			<td>CGC</td>
			<td>N2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;15508-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel stain, SYBR safe</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder mix, O&#8217;gene ruler</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Loading Dye, 6x TriTrack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;FERR1161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase, Baseline-ZERO</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;DB0715K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50 strain</td>
			<td>CGC</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe</td>
			<td>Promega</td>
			<td>&#160;E3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes Solution, 1 M Gibco</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 37%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypochlorite bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium weigh dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;02-202-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides, Vista vision</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>16004-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade water, Hypure</td>
			<td>Hyclone Laboratories</td>
			<td>&#160;SH30538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;N1638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR system, FailSafe with premix A</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;FS99100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P39111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein assay kit, Qubit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;Q33211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse transcription kit, Sensiscript</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction kit RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>&#160;N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;BDH9286-12KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;1-09137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filter with 0.2 &#181;m Polyethersulfone membrane</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>28145-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;200-334-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Forward 5&#8217;- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Reverse 5&#8217;- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C freezer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer</td>
			<td>Isobiotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, Eppendorf 5418 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5401000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, VWR Clinical 50</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82013-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope, Leica M80</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer, Qubit 2.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging system, iBright FL1500</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;A44241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>12621-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges, Eppendorf 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETBOY acu 2</td>
			<td>Integra</td>
			<td>155017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking platform</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription

Caenorhabditis elegans ha sido un importante sistema modelo para la investigación biológica desde que se introdujo en 1963. Sin embargo, C. elegans no se ha utilizado completamente en el estudio bioquímico de reacciones biológicas utilizando sus extractos nucleares, como la transcripción in vitro y la replicación del ADN. Un obstáculo significativo para el uso de C. elegans en estudios bioquímicos es interrumpir la gruesa cutícula externa del nematodo sin sacrificar la actividad del extracto nuclear. Si bien se utilizan varios métodos para romper la cutícula, como la homogeneización o la sonicación de Dounce, a menudo conducen a la inestabilidad de las proteínas. No existen protocolos establecidos para aislar proteínas nucleares activas de larvas o adultos de C. elegans para reacciones in vitro . Aquí, el protocolo describe en detalle la homogeneización de la etapa larvaria 4 C. elegans utilizando un homogeneizador Balch. El homogeneizador Balch utiliza presión para forzar lentamente a los animales a través de un estrecho espacio que rompe la cutícula en el proceso. El diseño uniforme y el mecanizado preciso del homogeneizador Balch permiten una molienda constante de animales entre experimentos. El fraccionamiento del homogeneizado obtenido del homogeneizador Balch produce un extracto nuclear funcionalmente activo que se puede utilizar en un método in vitro para evaluar la actividad de transcripción de C. elegans.

Siguiendo los pasos descritos se debe producir extracto nuclear funcional (Figura 1), la desviación en los pasos de molienda o lavado puede conducir a una actividad deficiente o bajos rendimientos. Si se obtiene extracto nuclear funcional de C. elegans , transcribirá la región aguas abajo del promotor cmv en la plantilla de ADN cuando se agregue al ensayo in vitro descrito anteriormente. La transcripción de ARN resultante se puede purif...

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Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Aquí, describimos un protocolo detallado para aislar el extracto nuclear activo de la etapa larvaria 4 de C. elegans y visualizar la actividad de transcripción en un sistema in vitro .

Aislamiento del extracto nuclear activo de Caenorhabditis elegans y reconstitución para la transcripción in vitro

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

Este protocolo llena un vacío técnico para el estudio bioquímico de C.elegans y amplía su utilidad como organismo modelo. Esta técnica es simple y robusta, lo que permite un aislamiento constante del extracto nuclear de C.elegans funcionalmente activo. Comience colocando los animales L1 sincronizados en 10 placas que contienen medios de crecimiento de nematodos de 150 milímetros sembrados con Escherichia coli OP50, y permita que los animales crezcan durante 48 horas a 20 grados Centígrados hasta que alcancen la etapa L4.Una vez preparados los tampones hipotónicos e hipertónicos, limpie el homogeneizador Balch inundando la cámara de molienda con etanol al 70%. Luego enjuague la cámara con agua desionizada para eliminar el exceso de etanol. Inserte la bola de carburo de tungsteno en la cámara de molienda.Tapa los extremos del cañón del homogeneizador Balch y asegura las tapas con los tornillos de pulgar proporcionados. Luego prepare cinco mililitros de los tampones hipotónicos e hipertónicos completos por muestra como se describe en el manuscrito de texto. A continuación, llene una jeringa estéril de dos mililitros con un mililitro de tampón hipotónico completo y enjuague suavemente la cámara de molienda del homogeneizador Balch, dejando aproximadamente 500 microlitros de tampón hipotónico completo en la cámara.Guarde el homogeneizador enjuagado en hielo y déjelo enfriar durante 30 minutos. Recoja los animales L4 bien alimentados con tampón M9 en un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue a los animales a 1.000 veces g durante tres minutos. Retire el sobrenadante y continúe lavando el pellet animal hasta que el sobrenadante esté claro.A continuación, lave a los animales con tres mililitros de tampón hipotónico frío y centrífique nuevamente como se ha demostrado. Después de retirar el tampón hipotónico sobrenadante, agregue un mililitro de tampón hipotónico completo al gránulo animal y transfiera la suspensión animal a una nueva jeringa estéril de dos mililitros. Para homogeneizar los animales mantenidos en hielo, empuje suavemente a los animales a través de la cámara de molienda del homogeneizador Balch cargado con la bola de tungsteno.Luego recoja a los animales en la jeringa y repita este procedimiento 30 veces. Después de 30 ciclos de homogeneización, recoja la suspensión máxima de animales del homogeneizador Balch y guarde la jeringa con la punta colocada hacia abajo dentro de un microtubo de 1,7 mililitros. Retire la bola de tungsteno y limpie la cámara de molienda con agua desionizada.Seque y devuelva la bola al tubo etiquetado respectivo. Luego inserte la bola de tungsteno con un diámetro de 7.9880 milímetros y un espacio libre de 12 micrómetros en la cámara de molienda, y vuelva a sellar el homogeneizador. Enjuague la cámara de molienda nuevamente con un mililitro de tampón hipotónico completo helado.Moler la suspensión 25 veces como se ha demostrado. Transfiera la suspensión del animal a un microtubo limpio de 1,7 mililitros y guarde la suspensión en hielo. Pellet por los cuerpos de los animales y los escombros por centrifugación.Pipetee 40 microlitros del sobrenadante a un tubo etiquetado como fracción de entrada y almacene la fracción en hielo. Transfiera el sobrenadante restante a un nuevo tubo de 1,7 mililitros sin perturbar el pellet, y centrífuga para granular los núcleos. Luego transfiera el sobrenadante sin perturbar los núcleos granulados a un nuevo tubo de 1,7 mililitros marcado como fracción citosólica.Para lavar el pellet de núcleos, agregue 500 microlitros de tampón hipotónico completo al pellet, suspenda el pellet y centrífique a 4, 000 veces g a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Al final de la centrifugación, vuelva a suspender el gránulo nuclear en 500 microlitros de tampón hipotónico completo fresco, y vuelva a centrifugar la muestra como se ha demostrado. Luego disuelva el pellet en 40 microlitros de tampón hipertónico completo.Transfiera la suspensión nuclear a una nueva fracción nuclear etiquetada con tubo de 1,7 mililitros y guárdela en hielo. Determine la concentración de proteínas de tres fracciones utilizando un kit de cuantificación fluorescente. Alícuota las fracciones nucleares en tubos de un solo uso que contengan seis microgramos de la proteína nuclear, y congele en hielo seco y baño de etanol.Guarde las muestras a menos 80 grados centígrados hasta su uso posterior. La imagen representativa del gel muestra los productos de transcripción del extracto nuclear de larvas de Caenorhabditis elegans L4 utilizando la plantilla de ADN promotor de CMV. El aislamiento exitoso de proteínas nucleares activas resultó en una banda de 132 pares de bases después de una transcripción in vitro, y el aislamiento fallido resultó en una banda débil o la ausencia de una banda.Recuerde etiquetar claramente los búferes completos. Los tampones inapropiados pueden dañar la funcionalidad de las proteínas nucleares. Además, mantenga el homogeneizador helado para evitar la desnaturalización de las proteínas.El desarrollo de esta técnica permitió a los investigadores medir la tasa de transcripción de ARN de C.elegans durante condiciones estresantes, lo que demuestra que la tasa de transcripción del animal puede cambiar dependiendo de las condiciones ambientales.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Aislamiento y medidas respiratoria de las mitocondrias de Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Investigación

Bioquímica

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

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Un método Simple para la detección química de alto rendimiento en Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Purificación y reconstitución de TRPV1 para análisis espectroscópico

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Análisis colorimétrico de lactato intracelular en pequeña escala y del piruvato en el nematodo Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Base de placa de cultivo a gran escala de elegans de Caenorhabditis: preparación de muestras para el estudio de alteraciones metabólicas en la Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitución de la uno mismo-organización de patrones de proteínas en bicapas lipídicas soportadas

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Aislamiento de tilacoides fisiológicamente activos y su uso en ensayos de transporte dependiente de energía

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Aplicación de la interferometría de Biolayer (BLI) para el estudio de las interacciones proteínas y proteínas en la transcripción

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Síntesis de un estándar deuterated para la cuantificación de 2-Arachidonoylglycerol en Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

En Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting para el Estudio de Interacciones Proteicas en Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...