Name: isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription
Uploaded: 2021-08-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ett NIH MIRA-bidrag (R35GM124678 till J. S.).

1. Medieförberedelser
<ol><li>Förbered sterila lysogena buljongplattor (LB) och flytande medier enligt tillverkarens instruktioner.</li>
	<li>Streak Escherichia coli (E. coli) stam OP50 på en LB agar tallrik. Inkubera bakteriestrimmen vid 37 °C över natten.</li>
	<li>Förvara E. coli OP50-streckplattan vid 4 °C efter inkubation. E. coli OP50-plattan kan förvaras säkert vid 4 °C i 2 veckor om den är insvept i parafilm för att förhindra fuktförlust.</li>
	<li>Förbered 2 L...

<ol>
	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Blackwell, T. K., Walker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+mechanisms.">Transcription mechanisms.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-16 (2006).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-15 (2007).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+properties+of+the+Caenorhabditis+elegans+TATA-box-binding+protein.">Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+activation+of+transcription+by+UNC-86+and+MEC-3+in+Caenorhabditis+elegans+embryo+extracts.">Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts.</a> EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).</li><li>Shan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope-labeled+immunoassays+without+radiation+waste.">Isotope-labeled immunoassays without radiation waste.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).</li><li>Voss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+non-radioactive+eukaryotic+in+vitro+transcription+assay+for+sensitive+quantification+of+RNA+polymerase+II+activity.">A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity.</a> BMC Molecular Biology. 15, 7 (2014).</li><li>Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+Caenorhabditis+elegans+transcription+system.">A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87 (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Zbacnik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+buffers+in+protein+formulations.">Role of buffers in protein formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).</li></ol>

C. elegans är en tilltalande modellorganism för att studera det eukaryota transkriptionssystemet på grund av dess billiga underhåll och den enkla genetiska manipulationen. Här beskrivs ett protokoll för konsekvent isolering av funktionellt aktiva kärnämne extrakt från L4 C. elegans . Även om detta protokoll fokuserade på att visualisera transkription verksamhet, cDNA produceras post-transcriptionally kan kvantifieras med RT-qPCR för att få en mer exakt mätning av transkription <sup class="...

Den lilla, frilevande nematoden Caenorhabditis elegans är en enkel men kraftfull modellorganism för att ta itu med ett brett spektrum av biologiska frågor. Sedan introduktionen 1963 har nematoderna varit ovärderliga för att svara på frågor inom neurobiologi, metabolism, åldrande, utveckling, immunitet och genetik1. Några av djurets många egenskaper som gör det till en idealisk modellorganism inkluderar kort generationstid, effektiviteten av RNA-interferens, transparent kropp och de färdiga kartorna över både dess cellulära härstamning och nervsystem.
Medan nematodens bidrag till vetenskapen är enorma, har de underutnyttjats för att klargöra det eukaryota transkriptionssystemet, med det mesta av vår förståelse för dessa mekanismer som kommer från studier med kärnextrakt från jäst, fruktfluga och däggdjurscellkultur2. Det största hindret som avskräcker forskare från att utvinna funktionellt kärnextrakt är nematodens tuffa yttre nagelband. Detta exoskelett består av korslänkade kollagener, cuticlins, glykoproteiner och lipider, vilket gör C. elegans från larvstadium till vuxen ålder resistent mot proteinutvinning via kemiska eller mekaniska krafter3. Ett in vitro transkriptionssystem med C. elegans kärnextrakt utvecklades en gång men inte allmänt antogs på grund av systemets begränsade omfattning, och användningen av Dounce homogenizer för att förbereda extraktet kan leda till protein instabilitet4,5.
Till skillnad från det tidigare protokollet för kärnextraktisolering som använde en Dounce homogenisator för att bryta C. elegans, använder detta protokoll en Balch homogenisator. Balch homogenisator består av två huvudkomponenter: en volframkarbidboll och ett rostfritt stålblock med en kanal uttråkad från ena änden till en annan. Balch homogenisator är laddad med volframkarbidbollen och täckt på vardera sidan för att försegla slipkammaren. Sprutor kan laddas på de två vertikala portarna som leder in i slipkammaren. När materialet överförs från en spruta till en annan genom slipkammaren tvingar trycket från sprutorna materialet genom ett smalt mellanrum mellan bollen och kammarens vägg. Detta långsamma och konstanta tryck bryter materialet tills det når en jämn storlek som lätt kan passera genom det smala gapet. Att tvinga C. elegans genom det smala gapet via ett konstant men ändå mjukt tryck bryter djuren öppna och släpper ut deras innehåll i den omgivande bufferten. Om du byter bollstorlekar skärps gapet ytterligare, de nyutgivna cellerna bryts och kärnorna frigörs i bufferten. Flera fall av centrifugering separerar kärnorna från resten av cellskräpet, vilket möjliggör insamling av ett rent kärnextrakt. Balch homogenisator föredras framför Dounce homogenisator av flera skäl: systemet kan hantera ett stort antal djur, vilket gör det möjligt att extrahera en hög mängd aktiva proteiner i ett enda försök; Den exakta bearbetningen av bollarna och stålblocket möjliggör konsekvent slipning mellan flera prover. det tunga stålblocket fungerar som en kylfläns och drar jämnt bort värme från slipkammaren, vilket förhindrar denaturering.
Efter isolering måste transkriptionsaktiviteten av kärnextrakt verifieras innan den används i några biokemiska experiment. Traditionellt mättes transkriptionsaktivitet med hjälp av radiomärkta nukleotider för att spåra och visualisera det nyligen syntetiserade RNA. Radioaktiv märkning kan dock vara betungande eftersom det kräver försiktighet vid användning och bortskaffande6. Tekniska framsteg gör det möjligt för forskare idag att använda mycket mindre skadliga eller besvärliga metoder för att mäta även små RNA-mängder med hjälp av tekniker som kvantitativ realtid PCR (qRT-PCR)7. Här beskriver protokollet en metod för att isolera aktiva kärnextrakt från larvstadium 4 (L4) C. elegans och visualisera transkriptionsaktivitet i ett in vitro-system.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Consumables and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL 8-Strip Tubes &#38; Flat Strip Caps, Clear</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL Individual PCR tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-153G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL sterile microtubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-282S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% absolute molecular grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP2818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol, Koptec</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>&#160;V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm petri plates</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>&#160;T3325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;28-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL plastic syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Norm-Ject syringes</td>
			<td>Henke-Sass Wolf GmbH</td>
			<td>4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL vacuum filter cup 0.22 &#181;m PES, Stericup Millipore Express Plus</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Criterion</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;C7432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>&#160;CA3510-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol proof marker</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;90000-264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans</td>
			<td>CGC</td>
			<td>N2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;15508-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel stain, SYBR safe</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder mix, O&#8217;gene ruler</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Loading Dye, 6x TriTrack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;FERR1161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase, Baseline-ZERO</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;DB0715K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50 strain</td>
			<td>CGC</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe</td>
			<td>Promega</td>
			<td>&#160;E3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes Solution, 1 M Gibco</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 37%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypochlorite bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium weigh dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;02-202-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides, Vista vision</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>16004-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade water, Hypure</td>
			<td>Hyclone Laboratories</td>
			<td>&#160;SH30538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;N1638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR system, FailSafe with premix A</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;FS99100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P39111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein assay kit, Qubit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;Q33211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse transcription kit, Sensiscript</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction kit RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>&#160;N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;BDH9286-12KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;1-09137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filter with 0.2 &#181;m Polyethersulfone membrane</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>28145-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;200-334-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Forward 5&#8217;- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Reverse 5&#8217;- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C freezer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer</td>
			<td>Isobiotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, Eppendorf 5418 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5401000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, VWR Clinical 50</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82013-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope, Leica M80</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer, Qubit 2.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging system, iBright FL1500</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;A44241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>12621-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges, Eppendorf 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETBOY acu 2</td>
			<td>Integra</td>
			<td>155017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking platform</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription

Caenorhabditis elegans har varit ett viktigt modellsystem för biologisk forskning sedan det infördes 1963. C. elegans har dock inte utnyttjats fullt ut i den biokemiska studien av biologiska reaktioner med hjälp av dess kärnextrakt såsom in vitro-transkription och DNA-replikering. Ett betydande hinder för att använda C. elegans i biokemiska studier stör nematodens tjocka yttre nagelband utan att offra aktiviteten hos kärnextraktet. Medan flera metoder används för att bryta nagelbandet, såsom Dounce homogenisering eller ultraljudsbehandling, leder de ofta till proteininstabilitet. Det finns inga etablerade protokoll för att isolera aktiva nukleära proteiner från larva eller vuxen C. elegans för in vitro reaktioner . Här beskriver protokollet i detalj homogeniseringen av larvstadium 4 C. elegans med hjälp av en Balch homogenisator. Balch homogenisator använder tryck för att långsamt tvinga djuren genom ett smalt mellanrum som bryter nagelbandet i processen. Balch homogenisators enhetliga konstruktion och exakta bearbetning möjliggör konsekvent slipning av djur mellan experimenten. Fraktionering av homogenatet som erhålls från Balch homogenisator ger funktionellt aktiva kärnextrakt som kan användas i en in vitro-metod för att analysera transkriptionsaktiviteten hos C. elegans.

Enligt de skisserade stegen bör ge funktionellt kärnextrakt (figur 1) kan avvikelse i slip- eller tvättstegen leda till dålig aktivitet eller låg avkastning. Om funktionellT C. elegans kärnextrakt erhålls kommer det att transkribera regionen nedströms CMV-promotorn på DNA-mallen när den läggs till i den tidigare beskrivna in vitro-analysen . Den resulterande RNA-transkriptionen kan renas från kärnproteinerna och DNA-mallen med ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription at JoVE.com

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att isolera aktiva kärnämne extrakt från larv steg 4 C. elegans och visualisera transkription verksamhet i ett in vitro system.

Isolering av aktiv caenorhabditis elegans kärnextrakt och rekonstitution för in vitro-transkription

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

Detta protokoll fyller ett tekniskt gap för den biokemiska studien av C.elegans och utökar deras användbarhet som modellorganism. Denna teknik är både enkel och robust, vilket möjliggör konsekvent isolering av funktionellt aktiva C.elegans kärnextrakt. Börja med att placera de synkroniserade L1-djuren på 10 150-millimeters nematodtillväxtmedieinnehållande plattor sådda med Escherichia coli OP50 och låt djuren växa i 48 timmar vid 20 grader Celsius tills de når L4-stadiet.När de hypotona och hypertona buffertarna har beretts rengör du Balch homogenisator genom att översvämma slipkammaren med 70%etanol. Skölj sedan kammaren med avjoniserat vatten för att avlägsna överskottet av etanol. Sätt in volframkarbidbollen i slipkammaren.Kapa ändarna på Balch homogenisators pipa och fäst locken med de medföljande tumskruvarna. Förbered sedan fem milliliter av de fullständiga hypotona och hypertona buffertarna per prov enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Fyll därefter en steril, två milliliter spruta med en milliliter komplett hypotonbuffert och spola försiktigt slipkammaren på Balch homogenisator och lämna cirka 500 mikroliter komplett hypotonbuffert i kammaren.Förvara den spolade homogenisatorn på is och låt den svalna i 30 minuter. Samla de välmatade L4-djuren med M9-buffert i ett koniskt rör på 15 milliliter och centrifugera djuren vid 1 000 gånger g i tre minuter. Ta bort supernatanten och fortsätt att tvätta djurpelleten tills supernatanten är klar.Tvätta sedan djuren med tre milliliter kall hypotonbuffert och centrifugera igen som visats. Efter att ha tagit bort den övernatant hypotona bufferten, tillsätt en milliliter komplett hypotonbuffert till djurpelleten och överför djursuspensionen till en ny steril, två milliliter spruta. För homogenisering av djuren som hålls på is, tryck försiktigt djuren genom slipkammaren i Balch homogenisator laddad med volframbollen.Samla sedan djuren tillbaka i sprutan och upprepa denna procedur 30 gånger. Efter 30 homogeniseringscykler samlar du upp maximal djurfjädring från Balch homogenisator och förvarar sprutan med spetsen placerad nedåt i ett 1,7-milliliter mikrorör. Ta bort volframbollen och rengör slipkammaren med avjoniserat vatten.Torka och sätt tillbaka bollen till respektive märkt rör. Sätt sedan in volframbollen med 7,9880 millimeters diameter och 12 mikrometers mellanrum i slipkammaren och återförslut homogenisatorn. Spola slipkammaren igen med en milliliter iskall komplett hypotonbuffert.Slipa fjädringen 25 gånger som visats. Överför djurfjädringen till ett rent, 1,7-milliliter mikrorör och förvara suspensionen på is. Pellet ner djurkropparna och skräpet genom centrifugering.Pipettera 40 mikroliter av supernatanten till ett rör märkt som ingångsfraktion och förvara fraktionen på is. Överför den återstående supernatanten till ett nytt 1,7-milliliterrör utan att störa pelleten och centrifugera för att pelletera kärnorna. Överför sedan supernatanten utan att störa de pelleterade kärnorna till ett nytt 1,7-milliliterrör märkt som cytosolisk fraktion.För att tvätta nukleipellet, tillsätt 500 mikroliter av fullständig hypotonbuffert till pelleten, suspendera pelleten och centrifugera vid 4 000 gånger g vid fyra grader Celsius i fem minuter. I slutet av centrifugeringen återanvände du kärnpelleten i 500 mikroliter färsk fullständig hypotonbuffert och centrifugerar återigen provet enligt vad som visats. Lös sedan upp pelleten i 40 mikroliter av fullständig hyperton buffert.Överför kärnavstängningen till ett nytt 1,7-milliliterrör märkt kärnfraktion och förvara det på is. Bestäm proteinkoncentrationen på tre fraktioner med hjälp av ett fluorescerande kvantifieringskit. Aliquot kärn- fraktioner in i singel-brukrör som innehåller sex mikrogram av kärn- proteinet, och knäpp frysa i torr is och etanolbad.Förvara proverna på minus 80 grader Celsius tills vidare. Den representativa gel bilden visar transkription produkter av Caenorhabditis elegans L4 larver kärnextrakt med hjälp av CMV promotorn DNA mall. Den framgångsrika isoleringen av aktiva nukleära proteiner resulterade i en 132 bas par band efter en in vitro transkription, och misslyckade isolering resulterade i ett svagt band eller avsaknad av ett band.Kom ihåg att tydligt märka de fullständiga buffertarna. Olämpliga buffertar kan skada kärnproteinernas funktionalitet. Håll också homogenisatorn iskall för att förhindra denaturering av proteinerna.Genom att utveckla denna teknik kunde forskare mäta frekvensen av RNA-transkription av C.elegans under stressiga förhållanden, vilket visar att djurets transkriptionsgrad kan förändras beroende på miljöförhållandena.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolering och respiratoriska mätningar av mitokondrier från Arabidopsis thaliana.

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metod för hög genomströmning kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rening och beredning av TRPV1 för spektroskopisk analys

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Småskaliga kolorimetriska analyser av intracellulära laktat och pyruvat i den nematoder Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Tallrik-baserade storskalig odling av Caenorhabditis elegans: provberedning för studie av metabola förändringar i Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Beredning av självorganiserande Protein mönster på stöds Lipid lipidmonolager

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolering av fysiologiskt aktiva Thylakoids och deras användning i energi-beroende Protein Transport analyser

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Tillämpning av Biolayer interferometri (BLI) för att studera protein-proteininteraktioner vid transkription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Syntes av en Deuterat standard för kvantifiering av 2-Arachidonoylglycerol i Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans In Vi

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...