Name: isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription
Uploaded: 2021-08-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription at JoVE.com

Bu çalışma bir NIH MIRA hibesi (R35GM124678'den J. S.'ye) tarafından desteklendi.

1. Medya hazırlıkları
<ol><li>Üreticinin talimatlarına uyarak steril lysogeny et suyu (LB) agar plakaları ve sıvı ortam hazırlayın.</li>
	<li>Çizgi Escherichia coli (E. coli) bir LB agar plakası üzerinde OP50 suş. Bakteri çizgisini bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>E. coli OP50 çizgi plakasını kuluçkadan sonra 4 °C'de saklayın. E. coli OP50 plaka, nem kaybını önlemek için parafilme sarılırsa 2 hafta boyunca 4 °C'de güvenle saklanabilir....

<ol>
	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Blackwell, T. K., Walker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+mechanisms.">Transcription mechanisms.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-16 (2006).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-15 (2007).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+properties+of+the+Caenorhabditis+elegans+TATA-box-binding+protein.">Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).</li><li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+activation+of+transcription+by+UNC-86+and+MEC-3+in+Caenorhabditis+elegans+embryo+extracts.">Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts.</a> EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).</li><li>Shan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope-labeled+immunoassays+without+radiation+waste.">Isotope-labeled immunoassays without radiation waste.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).</li><li>Voss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+non-radioactive+eukaryotic+in+vitro+transcription+assay+for+sensitive+quantification+of+RNA+polymerase+II+activity.">A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity.</a> BMC Molecular Biology. 15, 7 (2014).</li><li>Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+Caenorhabditis+elegans+transcription+system.">A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87 (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Zbacnik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+buffers+in+protein+formulations.">Role of buffers in protein formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).</li></ol>

C. elegans , düşük maliyetli bakımı ve genetik manipülasyon kolaylığı nedeniyle ökaryotik transkripsiyon sistemini incelemek için çekici bir model organizmadır. Burada L4 C. elegans fonksiyonel olarak aktif nükleer özün tutarlı izolasyonu için bir protokol açıklanmıştır. Bu protokol transkripsiyon etkinliğini görselleştirmeye odaklansa da, transkripsiyon aktivitesinin daha hassas bir ölçümünü elde etmek için transkripsiyon sonrası üretilen cDNA RT-qPCR kullanılarak <su...

Küçük, serbest yaşayan nematod Caenorhabditis elegans , çok çeşitli biyolojik soruları ele almak için basit ama güçlü bir model organizmadır. 1963'te piyasaya sürülmesinden bu yana, nematodlar nörobiyoloji, metabolizma, yaşlanma, gelişim, bağışıklık ve genetik1 sorularını yanıtlamak için paha biçilmez olmuştur1. Hayvanın ideal bir model organizma olmasını sağlayan birçok özelliğinden bazıları arasında kısa nesil süre, RNA parazitinin etkinliği, şeffaf vücut ve hem hücresel soyunun hem de sinir sisteminin tamamlanmış haritaları bulunur.
Nematodun bilime katkıları çok büyük olsa da, ökaryotik transkripsiyon sistemini aydınlatmak için yetenmemiştir, bu mekanizmalar hakkındaki anlayışımızın çoğu maya, meyve sineği ve memeli hücre kültüründen nükleer ekstrakt kullanan çalışmalardan gelmektedir2. Araştırmacıları fonksiyonel nükleer özüt çıkarmaktan vazgeçiren en büyük engel nematodun sert dış manikürüdür. Bu dış iskelet çapraz bağlı kollajenler, cuticlins, glikoproteinler ve lipitlerden oluşur ve C. eleganları larva aşamasından yetişkinliğe kadar kimyasal veya mekanik kuvvetlerle protein ekstraksiyona dayanıklı hale getirir3. C. elegans nükleer ekstresi kullanan bir in vitro transkripsiyon sistemi bir zamanlar geliştirilmiştir, ancak sistemin sınırlı kapsamı nedeniyle yaygın olarak benimsenmemiştir ve özü hazırlamak için Dounce homojenizatörün kullanılması protein kararsızlığına yol açabilir4,5.
C. eleganları kırmak için bir Dounce homojenizatör kullanan nükleer ekstrakt izolasyonu için önceki protokolün aksine, bu protokol bir Balch homojenizatör kullanır. Balch homojenizatör iki ana bileşenden oluşur: bir tungsten karbür topu ve bir uçtan diğerine sıkılmış bir kanala sahip paslanmaz çelik bir blok. Balch homojenizatörü tungsten karbür topu ile yüklenir ve taşlama odasını kapatmak için her iki tarafa da kapatılmıştır. Şırınnalar, taşlama odasına giden iki dikey bağlantı noktasına yüklenebilir. Malzeme bir şırınnadan diğerine taşlama odasından geçirilirken, şırınnalardan gelen basınç malzemeyi top ile odanın duvarı arasındaki dar bir boşluktan geçirir. Bu yavaş ve sabit basınç, dar boşluktan kolayca geçebilen tutarlı bir boyuta ulaşana kadar malzemeyi kırar. C. elegans'ı sürekli ama yumuşak bir basınçla dar boşluktan zorlamak, hayvanları açar ve içeriklerini çevredeki tampona bırakır. Top boyutlarının değiştirilmesi boşluğu daha da sıkılaştırarak yeni salınan hücreleri kırar ve çekirdeği tampona boşaltır. Santrifüjlemenin birden fazla örneği çekirdekleri hücre kalıntılarının geri kalanından ayırarak temiz bir nükleer özün toplanmasına izin verir. Balch homojenizatör, Dounce homojenizatöre göre birkaç nedenden dolayı tercih edilir: sistem çok sayıda hayvanı idare edebilir ve tek bir denemede yüksek miktarda aktif protein çıkarmayı mümkün hale getirir; topların ve çelik bloğun hassas işlenmesi, birden fazla numune arasında tutarlı taşlama sağlar; ağır çelik blok bir ısı emici görevi görür, ısıyı taşlama odasından düzgün bir şekilde çeker ve denatüre etmeyi önler.
İzolasyondan sonra, nükleer ekstrakt transkripsiyon aktivitesi herhangi bir biyokimyasal deneyde kullanılmadan önce doğrulanmalıdır. Geleneksel olarak, transkripsiyon aktivitesi, yeni sentezlenen RNA'yı izlemek ve görselleştirmek için radyolabelli nükleotidler kullanılarak ölçüldü. Bununla birlikte, radyoaktif etiketleme, kullanım ve bertaraf sırasında önlem gerektirdiği için külfetli olabilir6. Günümüzde teknolojik gelişmeler, araştırmacıların nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR)7 gibi teknikleri kullanarak küçük RNA miktarlarını bile ölçmek için çok daha az zararlı veya zahmetli yöntemler kullanmalarına izin verir. Burada protokol, aktif nükleer özü larva evresi 4 (L4) C. eleganlardan izole etmek ve transkripsiyon aktivitesini bir in vitro sistemde görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Consumables and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL 8-Strip Tubes &#38; Flat Strip Caps, Clear</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL Individual PCR tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;24-153G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL sterile microtubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-282S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% absolute molecular grade ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP2818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol, Koptec</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>&#160;V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm petri plates</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>&#160;T3325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>&#160;28-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL plastic syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Norm-Ject syringes</td>
			<td>Henke-Sass Wolf GmbH</td>
			<td>4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL vacuum filter cup 0.22 &#181;m PES, Stericup Millipore Express Plus</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipet</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>&#160;89130-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Criterion</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;C7432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>&#160;CA3510-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol proof marker</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;90000-264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans</td>
			<td>CGC</td>
			<td>N2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control DNA temple cloning primers, Forward 5&#8217;- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;15508-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel stain, SYBR safe</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder mix, O&#8217;gene ruler</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Loading Dye, 6x TriTrack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;FERR1161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase, Baseline-ZERO</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;DB0715K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50 strain</td>
			<td>CGC</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe</td>
			<td>Promega</td>
			<td>&#160;E3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes Solution, 1 M Gibco</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 37%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypochlorite bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium dichloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium weigh dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;02-202-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides, Vista vision</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>16004-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade water, Hypure</td>
			<td>Hyclone Laboratories</td>
			<td>&#160;SH30538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;N1638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR system, FailSafe with premix A</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>&#160;FS99100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P39111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein assay kit, Qubit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;Q33211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse transcription kit, Sensiscript</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction kit RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>&#160;N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;BDH9286-12KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;1-09137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filter with 0.2 &#181;m Polyethersulfone membrane</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>28145-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;200-334-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Forward 5&#8217;- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transcription primers, Reverse 5&#8217;- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#176;C incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C freezer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer</td>
			<td>Isobiotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, Eppendorf 5418 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5401000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, VWR Clinical 50</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82013-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope, Leica M80</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer, Qubit 2.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging system, iBright FL1500</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;A44241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>12621-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges, Eppendorf 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETBOY acu 2</td>
			<td>Integra</td>
			<td>155017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking platform</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of active caenorhabditis elegans nuclear extract and reconstitution for in vitro transcription

Caenorhabditis elegans, 1963 yılında piyasaya sürüldüldüklerinden beri biyolojik araştırmalar için önemli bir model sistemidir. Bununla birlikte, C. elegans, in vitro transkripsiyon ve DNA replikasyon gibi nükleer özlerini kullanarak biyolojik reaksiyonların biyokimyasal çalışmasında tam olarak kullanılmamıştır. Biyokimyasal çalışmalarda C. elegans'ı kullanmanın önemli bir engeli, nükleer özün aktivitesini feda etmeden nematodun kalın dış kütikülünü bozuyor. Kıtkeni kırmak için Dounce homojenizasyon veya sonication gibi çeşitli yöntemler kullanılırken, genellikle protein kararsızlığına yol açarlar. Aktif nükleer proteinlerin in vitro reaksiyonlar için larva veya yetişkin C. eleganlardan izole edilmesi için belirlenmiş bir protokol yoktur. Burada protokol, larva evresi 4 C. eleganların balç homojenizatörü kullanılarak homojenizasyonunu ayrıntılı olarak açıklar. Balch homojenizatör, hayvanları bu süreçte kütikülleri kıran dar bir boşluktan yavaşça zorlamak için basınç kullanır. Balch homojenizatörün düzgün tasarımı ve hassas işlenmesi, deneyler arasında hayvanların tutarlı bir şekilde taşlanmasına izin verir. Balch homojenizatörden elde edilen homojenatın fraksiyone edilmesi, C. eleganların transkripsiyon aktivitesini test etmek için bir in vitro yöntemde kullanılabilecek işlevsel olarak aktif nükleer ekstrakt sağlar.

Özetlenen adımların ardından fonksiyonel nükleer ekstrakt (Şekil 1) verilmelidir, taşlama veya yıkama adımlarındaki sapma zayıf aktiviteye veya düşük verime yol açabilir. Fonksiyonel C. elegans nükleer özü elde edilirse, daha önce açıklanan in vitro teste eklendiğinde CMV promotörünün bölgesini DNA şablonuna aşağı doğru yazıya dökecektir. Elde edilen RNA transkript, geleneksel yöntemler kullanılarak nükle...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription at JoVE.com

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Burada, larva evresi 4 C. eleganlardan aktif nükleer özü izole etmek ve transkripsiyon aktivitesini bir in vitro sistemde görselleştirmek için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Aktif Caenorhabditis elegans'ın in vitro transkripsiyon için Nükleer Ekstrakt ve Rekonsitasyonu İzolasyonu

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

Bu protokol, C.eleganların biyokimyasal çalışması için teknik bir boşluğu doldurur ve model organizma olarak yararlılıklarını genişletir. Bu teknik hem basit hem de sağlamdır ve işlevsel olarak aktif C.elegans nükleer ekstresinin tutarlı bir şekilde izole edilmesini sağlar. Senkronize L1 hayvanlarını Escherichia coli OP50 ile tohumlanmış 10 adet 150 milimetre nematod büyüme ortamı içeren plakalara yerleştirerek başlayın ve hayvanların L4 aşamasına ulaşana kadar 20 santigrat derecede 48 saat büyümesine izin verin.Hipotonik ve hipertonik tamponlar hazırlandıktan sonra, öğütme odasını% 70 etanol ile su basarak Balch homojenizatörini temizleyin. Daha sonra fazla etanol kaldırmak için odayı deiyonize su ile durulayın. Tungsten karbür topını öğütme haznesine yerleştirin.Balch homojenizatör varilinin uçlarını kapla ve kapakları sağlanan başparmak vidalarıyla sabitle. Daha sonra metin el yazmasında açıklandığı gibi örnek başına tam hipotonik ve hipertonik tamponların beş mililitresini hazırlayın. Daha sonra steril, iki mililitrelik bir şırıngayı bir mililitre tam hipotonik tamponla doldurun ve Balch homojenizatörün taşlama odasını hafifçe yıkayın ve odada yaklaşık 500 mikrolitre tam hipotonik tampon bırakın.Yıkanmış homojenizonu buzda saklayın ve 30 dakika soğumaya bırakın. İyi beslenen L4 hayvanlarını M9 tamponu ile 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın ve hayvanları üç dakika boyunca 1.000 kez g'da santrifüjleyin. Süpernatant çıkarın ve süpernatant temiz olana kadar hayvan peletini yıkamaya devam edin.Daha sonra hayvanları üç mililitre soğuk hipotonik tamponla yıkayın ve gösterildiği gibi tekrar santrifüj yapın. Süpernatan hipotonik tamponu çıkardıktan sonra, hayvan peletine bir mililitre tam hipotonik tampon ekleyin ve hayvan süspansiyonu yeni bir steril, iki mililitrelik şırınna aktarın. Buzda tutulan hayvanları homojenizleştirmek için, hayvanları tungsten topu ile yüklü Balch homojenizatörün öğütme odasından hafifçe itin.Sonra hayvanları şırınd içinde geri toplayın ve bu prosedürü 30 kez tekrarlayın. 30 homojenizasyon döngüsünden sonra, Balch homojenizatörden maksimum hayvan süspansiyonu toplayın ve şırıngayı ucu 1,7 mililitrelik bir mikrotüp içinde aşağı doğru yerleştirilmiş olarak saklayın. Tungsten topunu çıkarın ve taşlama odasını deiyonize suyla temizleyin.Kurulayın ve topu ilgili etiketli tüpe geri verin. Daha sonra 7.9880 milimetre çapında ve 12 mikrometre boşluk açıklığı olan tungsten toplarını taşlama odasına yerleştirin ve homojenizatörü yeniden yerleştirin. Taşlama haznesini bir mililitre buz gibi tam hipotonik tamponla tekrar yıkayın.Süspansiyonu gösterildiği gibi 25 kez ezin. Hayvan süspansiyonu temiz, 1,7 mililitrelik bir mikrotüp içine aktarın ve süspansiyonu buzda saklayın. Hayvan bedenlerini ve enkazı santrifüjle aşağı doğru pelet.Pipet 40 mikrolitresi, giriş fraksiyonu olarak etiketlenmiş bir tüpe ve fraksiyonu buz üzerinde saklayın. Kalan süpernatantı peleni bozmadan yeni bir 1,7 mililitrelik tüpe ve çekirdeği peletmek için santrifüje aktarın. Daha sonra peletlenmiş çekirdekleri rahatsız etmeden süpernatantı sitozolitik fraksiyon olarak etiketlenmiş yeni bir 1.7 mililitrelik tüpe aktarın.Çekirdek peletini yıkamak için, pelete 500 mikrolitre tam hipotonik tampon ekleyin, peleti askıya alın ve beş dakika boyunca dört santigrat derecede 4.000 kez santrifüjleyin. Santrifüjlemenin sonunda, nükleer peleti 500 mikrolitre taze tam hipotonik tamponda yeniden ıslatın ve numuneyi gösterildiği gibi tekrar santrifüj edin. Daha sonra peleti 40 mikrolitre tam hipertonik tamponda çözün.Nükleer süspansiyonu nükleer fraksiyon etiketli 1.7 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve buzda saklayın. Floresan nicelleştirme kiti kullanarak üç fraksiyonun protein konsantrasyonunu belirleyin. Nükleer fraksiyonları altı mikrogram nükleer protein içeren tek kullanımlık tüplere ayırın ve kuru buz ve etanol banyosunda dondurun.Numuneleri daha fazla kullanıma kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Temsili jel görüntüsü, CMV promotör DNA şablonunu kullanarak Caenorhabditis elegans L4 larva nükleer ekstresinin transkripsiyon ürünlerini gösterir. Aktif nükleer proteinlerin başarılı izolasyonu, in vitro transkripsiyondan sonra 132 baz çift bandı ile sonuçlandı ve başarısız izolasyon zayıf bir bant veya bir bandın olmamasına neden oldu.Tüm arabellekleri açıkça etiketlemeyi unutmayın. Uygunsuz tamponlar nükleer proteinlerin işlevselliğine zarar verebilir. Ayrıca, proteinlerin denatüre olmasını önlemek için homojenizatör buz soğuk tutun.Bu tekniğin geliştirilmesi, araştırmacıların stresli koşullar sırasında C.eleganların RNA transkripsiyon oranını ölçmelerine izin vererek, hayvanın transkripsiyon oranının çevresel koşullara bağlı olarak değişebileceğini gösterdi.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Yalıtım ve solunum ölçümleri mitokondri Arabidopsis thaliana üzerinden

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Küçük ölçekli Renkölçer deneyleri, intrasellüler laktat ve Pyruvate nematodunun Caenorhabditis elegans içinde

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Large-scale tarımı plaka tabanlı Caenorhabditis elegans: diyabet metabolik değişiklikler çalışma için numune hazırlama

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Vitro Sulandırma Protein kalıpları üzerinde desteklenen Lipid Bilayers kendi kendini düzenleme

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Yalıtım fizyolojik aktif Thylakoids ve onların kullanımı enerji bağımlı Protein taşıma deneyleri

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Transkripsiyon protein-protein etkileşimlerini Incelemek için Biolayer Interferometri (BLı) uygulaması

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans 2-Arachidonoylglycerol Quantification için Bir Deuterated Standart Sentezi

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi Caenorhabditis elegans Protein Etkileşimleri Çalışması için

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...