Name: brain pericyte calcium and hemodynamic imaging in transgenic mice in vivo
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo at JoVE.com

J. Meza støttes af stipendier fra Mitacs og Research Manitoba. Finansiering af dette arbejde blev ydet af canadiske institutter for sundhedsforskning, Research Manitoba, Manitoba Medical Service Foundation, opstart finansiering fra University of Manitoba og Brain Canada gennem Canada Brain Research Fund, med økonomisk støtte fra Health Canada og Azrieli Foundation. De synspunkter, der kommer til udtryk heri, repræsenterer ikke nødvendigvis sundhedsministerens eller Canadas regerings synspunkter.

<ol>
	<li>Armulik, A., Genov&#233;, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes:+Developmental,+physiological,+and+pathological+perspectives,+problems,+and+promises.">Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises.</a> Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li><li>Armulik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+regulate+the+blood-brain+barrier.">Pericytes regulate the blood-brain barrier.</a> Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).</li><li>Berthiaume, A. -. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+remodeling+of+pericytes+in+vivo+maintains+capillary+coverage+in+the+adult+mouse+brain.">Dynamic remodeling of pericytes in vivo maintains capillary coverage in the adult mouse brain.</a> Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).</li><li>Rungta, R. L., Chaigneau, E., Osmanski, B. -. F. F., Charpak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+compartmentalization+of+functional+hyperemia+from+the+synapse+to+the+pia.">Vascular compartmentalization of functional hyperemia from the synapse to the pia.</a> Neuron. 99 (2), 362-375 (2018).</li><li>Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+artery-specific+fluorescent+dye+for+studying+neurovascular+coupling.">An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling.</a> Nature Methods. 9 (3), 273-276 (2012).</li><li>Gonzales, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+pericytes+determine+the+direction+of+blood+flow+at+capillary+junctions.">Contractile pericytes determine the direction of blood flow at capillary junctions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 27022-27033 (2020).</li><li>Hartmann, D. a., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericyte+structure+and+distribution+in+the+cerebral+cortex+revealed+by+high-resolution+imaging+of+transgenic+mice.">Pericyte structure and distribution in the cerebral cortex revealed by high-resolution imaging of transgenic mice.</a> Neurophotonics. 2 (4), 041402 (2015).</li><li>Grant, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organizational+hierarchy+and+structural+diversity+of+microvascular+pericytes+in+adult+mouse+cortex.">Organizational hierarchy and structural diversity of microvascular pericytes in adult mouse cortex.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 39 (3), 411-425 (2017).</li><li>Hill, R. A., Tong, L., Yuan, P., Murikinati, S., Gupta, S., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+blood+flow+in+the+normal+and+ischemic+brain+is+controlled+by+arteriolar+smooth+muscle+cell+contractility+and+not+by+capillary+pericytes.">Regional blood flow in the normal and ischemic brain is controlled by arteriolar smooth muscle cell contractility and not by capillary pericytes.</a> Neuron. 87 (1), 95-110 (2015).</li><li>28345 - STOCK Tg(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J. Jackson Laboratory Available from: <a target="_blank" href="https://www.jax.org/strain/028345">https://www.jax.org/strain/028345</a> (2021)</li><li>Ohkura, M., Sasaki, T., Kobayashi, C., Ikegaya, Y., Nakai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+genetically+encoded+red+fluorescent+Ca2++indicator+for+detecting+optically+evoked+action+potentials.">An improved genetically encoded red fluorescent Ca2+ indicator for detecting optically evoked action potentials.</a> PLoS ONE. 7 (7), (2012).</li><li>Stobart, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+calcium+imaging+of+astrocytes+reveals+distinct+cellular+compartment+responses+to+sensory+stimulation.">Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation.</a> Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).</li><li>Stobart, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+circuit+activity+evokes+rapid+astrocyte+calcium+signals+on+a+similar+timescale+to+neurons.">Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons.</a> Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> JoVE. (12), e680 (2008).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+the+primary+somatosensory+cortex+using+Thy1-GCaMP6s+transgenic+mice.">Imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using Thy1-GCaMP6s transgenic mice.</a> JoVE. (143), e56297 (2019).</li><li>Ellefsen, K. L., Settle, B., Parker, I., Smith, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+algorithm+for+automated+detection,+localization+and+measurement+of+local+calcium+signals+from+camera-based+imaging.">An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging.</a> Cell Calcium. 56 (3), 147-156 (2014).</li><li>Barrett, M. J. P., Ferrari, K. D., Stobart, J. L., Holub, M., Weber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHIPS:+an+extensible+toolbox+for+cellular+and+hemodynamic+two-photon+image+analysis.">CHIPS: an extensible toolbox for cellular and hemodynamic two-photon image analysis.</a> Neuroinformatics. 16, 145-147 (2018).</li><li>Hall, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+pericytes+regulate+cerebral+blood+flow+in+health+and+disease.">Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease.</a> Nature. 508 (1), 55-60 (2014).</li><li>Nilsson, H., Aalkjaer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasomotion:+mechanisms+and+physiological+importance.">Vasomotion: mechanisms and physiological importance.</a> Molecular interventions. 3 (2), 79-89 (2003).</li><li>Rungta, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+arbors+in+layer+II+/+III+somatosensory+cortex.">Vascular arbors in layer II / III somatosensory cortex.</a> Communications Biology. , (2021).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Den nuværende metode giver detaljer om mus hale vene injektion med et kateter, to-foton mikroskop billede erhvervelse for dybde stakke, celle calcium signalering film, oprettelse af hæmodynamiske kymografer, og calcium og hæmodynamisk analyse med vores billedbehandling algoritmer17 (Figur 1). Der er flere fordele ved disse teknikker, der forbedrer in vivo imaging resultatet og reducere tid, ressourcer og dyr stress i løbet af sessionen. For det første giver brugen af et kateter til haleåreindsprøjtning mere kontrol over nålen, sprøjten og mængden af stof, der injiceres i musens cirkulation. Derudover forhindrer det farvestofindsprøjtning i halevævet, hvilket sparer dyre reagenser. For det andet bruger vi transgene mus, der udtrykker genetisk kodede calciumsensorer i ophedning af pericytter og demonstrerer, hvordan man lokaliserer dem i hjernens vaskulære netværk med en dybde z-stak, hvilket letter celleidentifikation og flytning i efterfølgende billeddannelsessessioner på lang sigt. Dette er en vigtig faktor i pericyte undersøgelser og sikrer korrekt celle klassificering6,7. For det tredje leverer vi vores parametre til indsamling af calciumfilm og hæmodynamiske linjescanningsdata, som er et godt udgangspunkt for måling af dynamiske cellulære signaler. Endelig præsenterer vi vores billedbehandlingsalgoritmer17, en omfattende billedbehandlingsværktøjskasse, der indeholder flere tilgange til billedforbehandling (såsom spektral unmixing), calciumbilledanalyse og hæmodynamisk analyse (diameter, hastighed osv.). Disse algoritmer kan generere plots til en hurtig og nem visualisering af dataene, samtidig med at det niveau af brugerekspertise, der kræves for at analysere resultaterne, minimeres. Desuden kan det automatiseres med et par linjer kode til hurtigt batch behandle flere datasæt med de samme parametre. Dette kan potentielt forbedre datavisualisering og forskeren.
Nøglen til at indsamle gode calcium imaging data er at justere laser magt og PMT indstillinger for klar fluorescens signal erhvervelse, men også at indsamle data med en tilstrækkelig billedhastighed til at fange hele calcium begivenhed. Dataene i denne protokol blev erhvervet med 10-11 billeder i sekundet, hvilket fanger de langsommere calciumsvingninger i ensheathing pericytter. Der er også flere trin under analysen, der kan forbedre analyseresultatet. For det første er spektral ub blanding gavnligt, hvis der er en betydelig overlapning mellem emissionsspektre af fluorophorer (Figur 2). Fluorescein-dextran blev brugt i denne protokol, fordi det er en omkostningseffektiv og kommercielt tilgængelig dextran konjugat, der er almindeligt anvendt til hæmodynamiske målinger5. Spektral ublandet hjælper med at rydde op i dataene til forbedret påvisning af calciumsignaler, men alternative fluorophorer med smallere emissionsspektre kan også bruges. For det andet er det nyttigt at vælge cellestrukturer som INVESTERINGSAFKAST (Figur 3) til klassificering af calciumhændelser i forskellige subcellulære områder, f.eks. Aktivitetsbaseret valg af investeringsafkast (figur 4)16 giver mere rumlig og tidsmæssig information om individuelle calciumhændelser. Dette kan være nyttigt, når du bestemmer hyppigheden af calciumhændelser i et givet område eller formering af begivenheder til andre cellulære områder. Brugen af programmeringssoftware til at analysere billeddata kan spare forskerne timer, når data batchbehandles, men det kræver en indledende tidsinvestering at justere parametrene for optimale resultater. De vigtigste faktorer er den forventede størrelse (i μm2) i det aktive område samt signalets varighed (minimum signaltid og maksimal signaltid skal defineres). Forskere skal undersøge nogle eksempel T-serie film først for bedst at afgøre, hvilke parametre der passer til deres data. Endelig kan data af dårlig kvalitet, der er indsamlet på mikroskopet, i høj grad hindre analysen af calcium og hæmodynamik (Figur 6). Derfor bør man passe på at optimere indstillingerne for anskaffelse af mikroskop i begyndelsen. Med disse faktorer i tankerne, denne protokol, der kan tilpasses til at passe calcium billeddannelse eller analyse af andre dynamiske cellulære signaler (f.eks fluorescerende natrium, kalium, metabolit, eller spænding udsving) i andre væv eller celletyper.
Der er flere begrænsninger i denne protokol. For det første indsamles dataene under anæstesi, hvilket påvirker hjernens aktivitet og kan påvirke blodgennemstrømningen. Lignende billeddannelse kan gøres i vågen mus, der er uddannet til at acceptere hovedfiksering for mere fysiologiske resultater. Derudover er det vigtigt at huske, at vi indsamler 2-dimensionelle billeder af en 3-dimensionel celle og blodkar in vivo. Derfor kan vi kun fange en fraktion af calciumhændelserne i disse celler eller blodgennemstrømningen i en enkelt del af blodkarret ad gangen.
En anden begrænsning at bemærke er, at to-foton calcium imaging er følsom over for bevægelse artefakter, hvor bevægelse ind og ud af brændpunktet flyet kan forveksles med calcium udsving. Denne protokol blev udført under anæstesi, hvilket begrænser dyrets bevægelse; bevægelsesartefakter kan dog introduceres ved musens vejrtrækningshastighed, puls, mulig vævs hævelse og i tilfælde af ophedning af pericytter, karsammentrækning eller vasomotion 4,6,18,19. Bevægelse artefakter kan afbødes af flere strategier. De billedbehandlingspakker, der bruges i denne protokol, omfatter et valgfrit bevægelseskorrektionstrin, som bruger et 2D-bøjningsprogram til at justere billederne i T-serien baseret på den synlige vaskulatur13,17. Rammer med væsentlige ændringer i fokusplanet identificeres af denne algoritme og kan udelukkes fra analyse. Derudover er det muligt at bruge statistiske strategier inden for billedbehandlingspakkerne, såsom en Z-score, når fluorescenssporene genereres, for at normalisere bevægelsen inducerede calciumudsving20. Den mest robuste tilgang til at tage højde for bevægelse artefakter i to-foton imaging er at kombinere udtryk for to fluorescerende indikatorer inden for samme celle, såsom en calcium indikator (f.eks GCaMP) og en fluorescerende reporter (f.eks mCherry), der er calcium-uafhængig. Udsving i fluorescerende reporter kan derefter tilskrives bevægelse og trækkes fra calcium indikator signal til at normalisere bevægelse artefakter.
Formålet med denne protokol er at give en klar forståelse af, hvordan man indsamler optimale calcium imaging og blodgennemstrømning data in vivo og at præsentere nye metoder og analyseværktøjer, som forskerne kan gennemføre for at forbedre deres resultater. Disse teknikker kan anvendes til at studere den rolle, forskellige pericytes populationer i blodgennemstrømningen kontrol eller i forskellige hjernesygdom stater. Disse billeddannelse parametre kan også bruges til at studere calcium og blodgennemstrømning i andre celletyper og organsystemer og lignende principper gælder for andre dynamiske billeddannelse teknikker, der er muliggjort af andre genetisk kodede sensorer, ud over calcium.

Centralnervesystemet vaskulatur består af gennemtrængende arterioler, kapillærer, og stigende venules. Inden for dette netværk, vægmaleri celler såsom vaskulære glatte muskelceller omslutter arterioles og pericytter udvide cellulære processer langs de første arteriole grene og kapillærer1. Pericytter synes at have flere roller i hjernen, herunder vedligeholdelse af blod -hjerne-barrieren1,2, migration og motilitet3, potentielle stamcelleegenskaber, og regulering af hjernens blodgennemstrømning4,5,6. Mange af pericytes funktionelle roller er blevet knyttet til udsving i intracellulært calcium , der kan regulere udvidelse eller sammentrækning af disse celler4,5,6.
Flere nylige undersøgelser har fastsat kriterier for at identificere forskellige typer hjerne pericytter7,8. Vægmalericeller inden for de første 4 grene af gennemtrængende arterioler opvarmer pericytter baseret på deres udtryk for det kontraktile protein α-smooth muskel actin (αSMA) og deres fremspringende, ægformede somata med processer, der ombrydes omkring kar7,8,9. For at visualisere calciumudsving i ensheathing pericytter bruger denne protokol en ny transgen muselinje, Acta2-RCaMP1.07, også kendt som Tg(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J10. Disse mus udtrykker den røde genetisk kodede calciumindikator, RCaMP1.07, i αSMA udtrykke celler (vaskulære glatte muskelceller og ensheathing pericytter). Avlskolonier opretholdes ved at krydse noncarrier dyr med hemizygotes. RCaMP1.07 er et rødt fluorescerende protein med et calmodulin bindende domæne, som øger fluorescensen ved binding til det intracellulære calcium10,11. Denne protokol skitserer trinene for kombineret calciumbilleddannelse af ensheathing pericytter og blodgennemstrømningsmålinger ved to fotonmikroskopi, herunder procedurer for haleveninindsprøjtning af fluorescerende farvestoffer, mikroskopbilledopsamling i bedøvede mus og dataanalyse med programmeringsplatforme (Figur 1). Disse teknikker er nyttige til at behandle spørgsmål om vægmalericellefysiologi, men kan tilpasses til at studere calciumtransienter i enhver celletype i hjernen eller et andet organsystem.
En 10 måneder gammel kvindelig Acta2-RCaMP1.07 mus blev brugt til eksperimentet præsenteret i denne artikel. Musen gennemgik kirurgi for kronisk kranievindue og hoved post implantation to måneder før. Detaljer for den kirurgiske protokol diskuteres i tidligere undersøgelser12,13 og lignende procedurer er blevet udført i andre tidligere offentliggjorte protokoller14,15. Vaskulaturen er mærket med grøn fluorescein-Dextran (70.000 MW, anionisk opløsning, 2,5% w /v) injiceret intravenøst. Dette farvestof er omkostningseffektivt og let tilgængeligt fra kommercielle kilder, men det har et bredere emissionsspektrum, der kan overlappe med RCaMP-emission og bløde igennem under erhvervelse af mikroskopbilled. Trin til spektral blanding er skitseret i afsnit 4 nedenfor for at omgå dette, men andre grønne farvestoffer med smallere emissionsspektre, såsom dem, der er baseret på EGFP, kan også anvendes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acta2-RCaMP1.07</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>28345</td>
			<td>In the video protocol the animal model used is a female mouse&#160; of&#160; 10 months, 1 day old.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applicators (Regular)</td>
			<td>Bisco</td>
			<td>X-80250P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFormats package for MATLAB</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Denominated in this protocol as &#34;image processing packages&#34;.&#160; Available in: https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIPS MATLAB toolbox</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Denomitaded in this protocol as &#34;image processing algorithms&#34;. Barrett MJP, Ferrari KD, Stobart JL, Holub M, Weber B. CHIPS: an Extensible Toolbox for Cellular and Hemodynamic Two-Photon Image Analysis. Neuroinformatics. 2018;16(1):145-147. doi:10.1007/s12021-017-9344-y. Available in: https://github.com/EIN-lab/CHIPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Ultrasound Gel, Medium viscosity</td>
			<td>HealthCare Plus</td>
			<td>UGC250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 70,000 MW, neutral</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Lube Plus</td>
			<td>Optixcare</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>Image J</td>
			<td>NA</td>
			<td>Denominated in this protocol as &#34;image processor software&#34;.&#160; Available in: https://imagej.net/Fiji/Downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCaMP6sfl/fl</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Post fixing platform</td>
			<td>University of Zurich</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Narketan 100 mg/mL)</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>440893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB R2020b</td>
			<td></td>
			<td>NA</td>
			<td>Denominated in this protocol as &#34;programming platform &#34;. Available in: https://www.mathworks.com/downloads/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 0.3mmx25mm</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective XLUMPLFLN20XW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/lumplfln-w/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR&#946;-CreERT2</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>30201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing, PE10 I.D. 28mm (0.11&#8221;) O.D. 61mm (.024&#8221;)</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prairie View</td>
			<td>Bruker Fluorescence Microscopy</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima In Vitro Multiphoton Microscope</td>
			<td>Bruker Fluorescence Microscopy</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Under Tank Heater</td>
			<td>Reptitherm U.T.H</td>
			<td>E169064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (Rompun 20 mg/mL)</td>
			<td>Bayer HealthCare</td>
			<td>2169592</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

brain pericyte calcium and hemodynamic imaging in transgenic mice in vivo

Nylige fremskridt inden for proteinbiologi og musegenetik har gjort det muligt at måle intracellulære calciumudsving i hjerneceller in vivo og at korrelere dette med lokal hæmodynamik. Denne protokol bruger transgene mus, der er blevet udarbejdet med et kronisk kranievindue og udtrykker den genetisk kodede calciumindikator, RCaMP1.07, under den α-glatte muskel actin promotor til specifikt at mærke vægmalericeller, såsom vaskulære glatte muskelceller og ophedning pericytter. Trin er skitseret om, hvordan man forbereder en hale venekateter til intravenøs injektion af fluorescerende farvestoffer til at spore blodgennemstrømningen, samt hvordan man måler hjernen pericyt calcium og lokale blodkar hæmodynamik (diameter, rød blodlegemer hastighed, osv.) af to foton mikroskopi in vivo gennem kranievinduet i ketamin / xylazin anæstesiiserede mus. Endelig gives der oplysninger til analyse af calciumudsving og blodgennemstrømningsfilm via billedbehandlingsalgoritmerne udviklet af Barrett et al. 2018 med vægt på, hvordan disse processer kan tilpasses andre cellulære billeddata.

Fluorescein-dextran har et bredt emissionsspektrum, der kan bløde igennem i den røde kanal, påvirker RCaMP-detektion i ensheathing pericytter (Figur 2A). Spektral ublandet efter dataindsamling i softwareprogrammet reducerer fluorescein blødning gennem (Figur 2B, lavere), forbedre calcium signal afsløring i efterfølgende analyse trin.
Calciumanalyse med de billedbehandlingsalgoritmer, der anvendes i denne protokol, giver mulighed for flere forskellige tilgange til identifikation af ROI'er og intracellulære calciumudsving (dvs. calciumsignaler). Valg af cellestrukturer manuelt tillader påvisning af calciumudsving i disse områder (Figur 3A), herunder forskellige typer signaltoppe, f.eks. Derudover identificeres INVESTERINGSAFKAST ved at gruppere aktive pixels sammen, hvor fluorescensintensiteten ændrer sig over tid ved hjælp af billedbehandlingsalgoritmer udviklet af Ellefsen et al. 201416 og Barrett et al. 201817 (Figur 4). Dette kan anvendes på ethvert dynamisk mobilsignal ved at justere tid, tærskel og rumlige parametre, så de omfatter signalets forventede størrelse og form. Hvis tærsklen for signalidentifikation sænkes, finder flere interesseområder (figur 4B).
Lyse og klare hæmodynamiske kymografer kan analyseres for at måle diameter og RBC hastighed i blodkar nær ensheathing pericytter (Figur 5A, B). Diameteren beregnes ud fra fuld bredde ved halv maksimum af fluorescens (Figur 5C). RBC-hastigheden tilnærmes fra striberne lavet af umærkede RBC'er, hvor vinklen indtastes i en Radon-transformation for at beregne hastigheden, flux (celler/celler) og den lineære tæthed (celler/mm; Figur 5D). Kymografer af dårlig kvalitet, hvor der er fluorescensmætning, dårligt signal til støjforhold eller bevægelse af billedbehandlingsfeltet (Figur 6A),skaber upålidelige plots med fejlpunkter (røde kryds), hvor data ikke kan bestemmes (Figur 6B, C). Kvaliteten af de erhvervede data er afgørende for et godt resultat og efter de trin, der er beskrevet i denne protokol, sikrer gode resultater.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig01.jpg"> Figur 1. Oversigt over protokollen. Protokollen præsenterer trinene til at erhverve og analysere fluorescerende calciumbilleder fra hjernen, der opvarmer pericytter og blodgennemstrømningsdata fra nærliggende blodkar i bedøvede mus. Protokollen er opdelt i 4 trin. 1) Procedureforberedelse: opsætning af udstyr og kateterforberedelse; 2) Hale vene injektion; 3) Dataindsamling ved to-foton mikroskopi; 4) Dataanalyse med billedbehandlingsalgoritmer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig02.jpg"> Figur 2. Spektral blanding af fluorophorer. A) Repræsentativt gennemsnitligt billede af RCaMP, der opvarmer pericyt og fluorescein-dextran-mærket blodkar fra en erhvervelse af T-serien. Skalalinje= 10 μm.B) Øvre: Når man overvejer individuelle kanaler, er gennemblødning fra Kanal 2 tydelig i Kanal 1 (venstre). Lavere: Efter spektral ublandet er blødningen reduceret, og signalet fra RCaMP er mere fremtrædende i pericytestrukturen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig03.jpg"> Figur 3. Håndvalgte ROI'er og optimerede kalkspor. A) Interesseområder, der er valgt i den anvendte billedbehandlingssoftware (regnbueformer), kan bruges til at identificere calciumsignalspor. B) Signaltoppe fra normaliserede spor identificeres ved lavpas og båndpas, der filtrerer dataene. Vi definerede signaltærsklen som 3 gange standardafvigelsen for basisperioden (de første 30 rammer), og eventuelle toppe over denne tærskel blev betragtet som et signal (lavere spor). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig04.jpg"> Figur 4. Automatiserede, aktivitetsbaserede INVESTERINGSAFKAST til calciumanalyse. De samme data blev analyseret med en tærskel på 7 gange standardafvigelsen for grundlinjen (A) og 3 gange standardafvigelsen for grundlinjen (B). Hvis du sænker grænsen for identifikation af aktive pixel, finder du flere investeringsafkast (B) og signaltoppe (cirkeldiagram) i pericytterne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig05.jpg"> Figur 5. Kymograph hæmodynamiske målinger. A) Eksempel linjescanning gennem fartøjet. B) Eksempel på veldefinerede kymografer for diameter (venstre) og hastighed (højre). De sorte striber inden for højre bånd af fluorescens svarer til RBCs.C) Diameter analyse med klare vasomotion udsving. D) Hastighedsanalyse med plots for Y axis= RBC flux(celler/celler), linjetæthed (celler/mm), hastighed (mm/s) og stribevinkel (grad), signal-til-støj-forhold (vilkårlige enheder, alias), X axis=time (sek.). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig06.jpg"> Figur 6. Repræsentation af hæmodynamiske målinger af dårlig kvalitet. A) Eksempler på kymografer af dårlig kvalitet med fluorescensmætning, dårligt signal til støjforhold eller bevægelse af billeddannelsesfeltet under erhvervelsen. B og C) Plots svarende til figur 7 af diameter og hastighed data, der har fejlpunkter (røde prikker) på grund af den dårlige kvalitet af kymografer. (billede E, Y axis=Diameter (μm), X axis=time (sek),image F, Y axis= RBC flux(celler/celler), linjetæthed (celler/mm), hastighed (mm/s) og streakvinkel (grad), signal til støjforhold (alias), X axis=time (sek).). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo at JoVE.com

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Denne protokol præsenterer trin til at erhverve og analysere fluorescerende calciumbilleder fra hjernen, der opvarmer pericytter og blodgennemstrømningsdata fra nærliggende blodkar i bedøvede mus. Disse teknikker er nyttige til undersøgelser af vægmalericellefysiologi og kan tilpasses til at undersøge calciumtransienter i enhver celletype.

Hjerne pericyt calcium og hæmodynamisk billeddannelse i transgene mus In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Hjernen vaskulatur er et komplekst netværk af gennemtrængende arteriel, kapillærer, og stigende venules. Disse fartøjer er indkapslet af vægmaleri celler, såsom ophedning pericytter, som udtrykker alpha glat muskel actin, og findes inden for de første fire grene fra gennemtrængende arteriel. Vi bruger Acta2-RCaMP 1,07 transgene mus til at visualisere calciumtransienter i disse celler gennem ekspressionen af den genetisk kodede calciumindikator RCaMP.Calcium spiller en stærk rolle i sammentrækning af disse celler og blodgennemstrømning kontrol. Kapillær pericytter findes længere nedestrøms i det vaskulære netværk og kan mærkes i andre transgene modeller. Vi fokuserer dog på at opvarme pericytter i denne metode.Vores mus er blevet kirurgisk implanteret med et kronisk kranievindue, der giver adgang til hjernens vaskulatur til billeddannelse. Her skitserer vi de nødvendige forberedelsestrin og haleåreindsprøjtning efterfulgt af de to fotonbilleddannelses- og analysemetoder, der er nødvendige for at erhverve pericyt calciumdata og information om blodgennemstrømning hos bedøvede dyr. Følgende elementer er nødvendige for en hale vene kateter injektion:insulin sprøjter, en 15 centimeter stykke PE10 slanger, 30 gauge nåle, gaze, saltvand, tang, grøn fluorescein dextran farvestof, tænger, og saks.Vi har også en nål med ketamin Xylazine anæstesi, som vi vil injicere før billeddannelse, da det er bedre end isoflurane til blodgennemstrømningsmålinger. Brug tangen til at bryde en 30 gauge nål fra navet. Sæt forsigtigt nålen ind i enden af det stykke PE10-slanger, der er fastgjort til en saltvandsfyldt sprøjte.Dette er kateteret til injektion. Bedøve en mus med isoflurane og anvende I-Lube gel. Placer et handskefelt med varmt vand på halen for at udvide den laterale vene.Når halen er renset med ethanol, skal du stikke nålen i venen og forsigtigt injicere saltvand gennem kateteret for at sikre, at nålen er placeret korrekt. Tænd sprøjten på kateteret for en sprøjte fyldt med fluorescein dextran farvestof. Langsomt injicere farvestoffet for at sikre, at der ikke kommer bobler ind i røret.Udskift dextransprøjten med saltvandssprøjten, og skyl slangen, indtil der ikke er noget farvestof tilbage i røret. Tag nålen af og tryk med gaze. Injicer ketamin Xylazine anæstesi til billeddannelse.Med musehovedet fastgjort på en varmepude skal du rengøre kranievinduet med tandapplikatorer. Påfør ultralydsgel på vinduet og fokuser gennem de to fotonmikroskopmål. Til to fotonbilleddannelse bruger vi et mikroskop med tuneable titanium Sapphire laser til lysstofrør, excitation og fotomultiplierrør til emissionsdetektion.I mikroskopsoftwaren skal du indstille bølgelængden til 990 nanometer for at ophidse både RCaMP og fluorescein dextran. Indstil derefter lasereffekten ved at justere pockelcellespændingen og PMT-detektorfølsomheden. Live scanning med disse parametre og højere opløsning, RCaMP positive vægmalericeller og fluorescerende mærket blodplasma kan ses.Erhvervelse af en dybde stak anbefales at korrekt finde pericytter i vaskulære netværk. Når fokuseret på toppen af vævet i nærheden af PO fartøjer, sæt dette som nulpunkt og toppen af Zed serien stakken, derefter fokusere ned i vævet til den ønskede dybde og sæt dette som bunden af stakken. Lasereffekten skal justeres for at stige, efterhånden som mikroskopet bevæger sig dybere gennem stakken.Åbning af Zed-serien i billedbehandlingssoftware, flet de to kanaler som farvede billeder og scan gennem stakken for pericytter og blodkar af interesse. Vælg områder af interesse, der indeholder pericytter, og gem positionerne for at hjælpe med at finde disse pletter igen i fremtidige billedsessioner. For at indsamle og flytte en pericyt calcium begivenhed, øge erhvervelse billedhastigheden til mere end 10 billeder i sekundet.Angiv billedvarigheden til 60 sekunder, og opdater lagringsstien med et entydigt filnavn. Zoom optisk på fartøjet for at tage højde for den lavere opløsning og for at få et nærmere overblik over pericytten. Hent T-serien.For at måle blodkardiameter og rød blodlegemer hastighed, skal du vælge linjescanning for at starte en endimensionel scanning med mikroskopet. Indstil først scanningens varighed i millisekunder. Tegn derefter en linje, der gennemskærer det pågældende fartøj og bevæger sig parallelt langs fartøjet.Dette vil generere en kymograf af fartøjets diameter til venstre og striber af de røde blodlegemer bevæger sig gennem fartøjet til højre. Se materialetabellen for at få en komplet liste over programmer og pakker, der bruges i denne protokol. Vælg først interesseområder i hånden i billedbehandlingssoftware.Indlæs T-seriens fil, tag gennemsnittet af stakken, og lav et farvet billede. Vælg polygonværktøjet, og omrids de synlige ensheathing pericytestrukturer som soma og processer. Giv hvert interesseområde et unikt navn, og gem dem som en zip-mappe, der kan indlæses senere i programmeringssoftwaren.Åbn programmeringssoftwaren, og kontroller, at mapperne til billedbehandlingspakkerne er på stien. Importer calcium T-serien i programmeringssoftwaren, og definer, hvad der er på hver kanal. I dette tilfælde er det et cellulært signal på kanal et og blodplasma på kanal to.Plot dataene som en film i programmeringssoftwaren for at lette visualiseringen. For at fjerne grønne fluorescerende fra fluorescein dextran, der bløder igennem i den røde RCaMP kanal, un-mix kanalerne i billedbehandling pakke. Vælg først et område, der kun indeholder fluorophor 1, RCaMP i dette tilfælde.For det andet skal du vælge en region, der kun indeholder fluorophore 2, fluorescein i plasmaet. Endelig skal du vælge et baggrundsområde, der ikke har hverken fluorophore. Dette genererer en spektral bidragsmatrix, som anvendes på hver pixel i hver kanal.Det forbedrer lokaliseringen af RCaMP-signalet betydeligt, hvilket vil øge påvisning af calciumhændelser i disse strukturer. Der er flere måder, hvorpå calciumbilleddataene kan analyseres i billedbehandlingspakkerne. Kør først den cellulære signalanalyse på den ublandet calciumfilm, og indlæs de områder af interesse fra zip-mappen, der blev valgt fra pericytterne i hånden tidligere.Indstil skaleringsfaktoren til én, fordi regionerne ikke behøver at blive ændret. Efter forarbejdning genererer plots af hver ROY og de normaliserede calciumspor i forskellige farver. Hvis koden ikke registrerer størstedelen af calciumhændelserne i de enkelte spor, skal du ændre de indbyggede parametre i optimeringsboksen, f.eks.For at registrere og klassificere signalerne er det normaliserede calciumspor langt gennemløb og båndpas filtreret, hvilket hjælper med at udjævne dataene for amplitud og med skøn, men også for at afgøre, om signaler er enkelte toppe, multitoppe eller plateauer. Udsout dataene som en CSV-fil til yderligere statistisk analyse. Kør den cellulære signalanalyse en anden gang på den ublandet calciumfilm, og vælg det automatiserede område med interesseidentifikation baseret på aktiviteten og ændringen i fluorescerende i tre dimensioner, X, Y og tid.Plot procesresultaterne for at få vist de identificerede områder af interesse er forskellige farver. Hvis algoritmen ikke registrerer ROY'er, der er tydeligt synlige for øjet i filmen, skal du ændre de indbyggede parametre, såsom at øge det gaussiske filter, der udjævner dataene i tide og reducerer tærsklen for at finde ROY'er til tre gange standardafvigelsen for grundlinjen. Plot ROYs som en film for yderligere visualisering.Udsout dataene som en CSV-fil til yderligere statistisk analyse. Importer datafilen til linjescanning i programmeringssoftwaren, og definer, hvad der er på hver kanal. Kør diameteranalysefunktionen på linjescanningen, som åbner en boks for at vælge det område, der svarer til diameteren i kymografen.Tegn en kasse uden for kymografens fluorescerende grænser, der svarer til fartøjets diameter. Behandl denne dataklasse for at måle den fulde bredde ved halv maxima for kardiameter og generere et plot. Kør derefter hastighedshastigheden på transformationsanalyse og tegn en kasse inde i grænsen til kymograflyserende.Behandl denne dataklasse for at beregne hastigheden, fluxen og den lineære tæthed af røde blodlegemer. Output blodgennemstrømningen resultater som en CSV-fil til yderligere analyse. Valg af cellulære strukturer i hånden tillader påvisning af calciumudsving inden for disse områder, herunder forskellige typer signaltoppe, såsom enkelttoppe og multitoppe, efter at de normaliserede calciumspor er lave pass og båndpas filtreret.Derudover identificeres interesseområder ved at gruppere aktive pixels sammen, hvor fluorescerende intensitet ændrer sig over tid ved hjælp af billedbehandlingsalgoritmer. Dette kan anvendes på ethvert dynamisk mobilsignal ved at justere tid, tærskel og rumlige parametre, så de omfatter signalets forventede størrelse og form. Hvis tærsklen for signalidentifikation sænkes, finder flere interesseområder.Klare, hæmodynamiske kymografer analyseres for at måle diameter og rød blodlegemer hastighed i blodkarrene i nærheden af ensheathing pericytter. Diameteren beregnes ud fra fuld bredde ved halv maksimum af fluorescerende. Den røde blodlegemer hastighed er tilnærmet fra striber lavet af umærkede røde blodlegemer, hvor vinklen er input i en radon transformation til at beregne hastigheden.Kymografer af dårlig kvalitet, hvor der er fluorescerende mætning, dårligt signal til støjforhold eller bevægelse af billeddannelsesfeltet, skaber upålidelige plots med fejlpunkter, angivet som røde kors, hvor data ikke kan bestemmes. Kvaliteten af de erhvervede data er afgørende for et godt resultat og efter de trin, der er beskrevet i denne protokol, sikrer gode resultater. I denne video skitserer vi proceduren for kombineret calciumbilleddannelse af hjernen, der opvarmer pericytter og blodgennemstrømningsmålinger ved to fotonmikroskopi.Disse teknikker er nyttige til at behandle spørgsmål om vægmalericellefysiologi og lokalisering inden for hjernens vaskulære netværk, men de kan tilpasses til at studere calciumtransienter i enhver celletype i hjernen eller andet organsystem.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionel Neuroimaging Med Ultrasonic blod-hjerne barrieren forstyrrelser og mangan-forstærket MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging i C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In vivo Funktionel Brain Imaging tilgang baseret på Bioluminescent Calcium Indikator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Bioluminescens Billeddannelse af Neuroinflammation i transgene mus efter perifer Inokulering af alfa-synuclein Fibriller

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging neurale aktivitet i den primære somatosensoriske Cortex ved hjælp af Thy1-GCaMP6s Transgene mus

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

To-foton Calcium Imaging i Neuronal dendritter i hjernen skiver

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging til at visualisere hjernen svar til hormonforstyrrende signalering i Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

I Vivo Calcium billeddannelse af laterale-line hårcellerne i larve zebrafisk

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging i Mus Ringere Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Stereotaksisk viral injektion og gradientindekslinseimplantation til dyb hjerne in vivo-calciumbilleddannelse

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...