Name: brain pericyte calcium and hemodynamic imaging in transgenic mice in vivo
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo at JoVE.com

J. Meza est soutenu par des bourses de Mitacs et de Research Manitoba. Le financement de ces travaux a été fourni par les Instituts de recherche en santé du Canada, Research Manitoba, la Manitoba Medical Service Foundation, le financement de démarrage de l’Université du Manitoba et Brain Canada par l’entremise du Fonds canadien de recherche sur le cerveau, avec le soutien financier de Santé Canada et de la Fondation Azrieli. Les opinions exprimées ici ne représentent pas nécessairement celles du ministre de la Santé ou du gouvernement du Canada.

<ol>
	<li>Armulik, A., Genov&#233;, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes:+Developmental,+physiological,+and+pathological+perspectives,+problems,+and+promises.">Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises.</a> Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li><li>Armulik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+regulate+the+blood-brain+barrier.">Pericytes regulate the blood-brain barrier.</a> Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).</li><li>Berthiaume, A. -. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organizational+hierarchy+and+structural+diversity+of+microvascular+pericytes+in+adult+mouse+cortex.">Organizational hierarchy and structural diversity of microvascular pericytes in adult mouse cortex.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 39 (3), 411-425 (2017).</li><li>Hill, R. 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Jackson Laboratory Available from: <a target="_blank" href="https://www.jax.org/strain/028345">https://www.jax.org/strain/028345</a> (2021)</li><li>Ohkura, M., Sasaki, T., Kobayashi, C., Ikegaya, Y., Nakai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+genetically+encoded+red+fluorescent+Ca2++indicator+for+detecting+optically+evoked+action+potentials.">An improved genetically encoded red fluorescent Ca2+ indicator for detecting optically evoked action potentials.</a> PLoS ONE. 7 (7), (2012).</li><li>Stobart, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+calcium+imaging+of+astrocytes+reveals+distinct+cellular+compartment+responses+to+sensory+stimulation.">Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation.</a> Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).</li><li>Stobart, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+circuit+activity+evokes+rapid+astrocyte+calcium+signals+on+a+similar+timescale+to+neurons.">Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons.</a> Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> JoVE. (12), e680 (2008).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+the+primary+somatosensory+cortex+using+Thy1-GCaMP6s+transgenic+mice.">Imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using Thy1-GCaMP6s transgenic mice.</a> JoVE. (143), e56297 (2019).</li><li>Ellefsen, K. L., Settle, B., Parker, I., Smith, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+algorithm+for+automated+detection,+localization+and+measurement+of+local+calcium+signals+from+camera-based+imaging.">An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging.</a> Cell Calcium. 56 (3), 147-156 (2014).</li><li>Barrett, M. J. P., Ferrari, K. D., Stobart, J. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+pericytes+regulate+cerebral+blood+flow+in+health+and+disease.">Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease.</a> Nature. 508 (1), 55-60 (2014).</li><li>Nilsson, H., Aalkjaer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasomotion:+mechanisms+and+physiological+importance.">Vasomotion: mechanisms and physiological importance.</a> Molecular interventions. 3 (2), 79-89 (2003).</li><li>Rungta, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+arbors+in+layer+II+/+III+somatosensory+cortex.">Vascular arbors in layer II / III somatosensory cortex.</a> Communications Biology. , (2021).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La présente méthode fournit des détails sur l’injection de veines de queue de souris avec un cathéter, l’acquisition d’images au microscope à deux photons pour les piles de profondeur, les films de signalisation du calcium cellulaire, la création de kymographes hémodynamiques et l’analyse du calcium et de l’hémodynamique avec nos algorithmes de traitement d’image17 (Figure 1). Ces techniques présentent plusieurs avantages qui améliorent les résultats de l’imagerie in vivo et réduisent le temps, les ressources et le stress animal pendant la séance. Tout d’abord, l’utilisation d’un cathéter pour l’injection de la veine caudale offre plus de contrôle sur l’aiguille, la seringue et la quantité de substance injectée dans la circulation de la souris. De plus, il empêche l’injection de colorant dans le tissu de la queue, ce qui permet d’économiser des réactifs coûteux. Deuxièmement, nous utilisons des souris transgéniques qui expriment des capteurs de calcium génétiquement codés dans les péricytes en enseumant et démontrent comment les localiser dans le réseau vasculaire cérébral avec une pile z de profondeur, ce qui facilite l’identification et la relocalisation des cellules lors de sessions d’imagerie ultérieures à long terme. C’est un facteur important dans les études péricytaires et assure une classification cellulaire correcte6,7. Troisièmement, nous fournissons nos paramètres pour la collecte de films de calcium et de données de balayage linéaire hémodynamique qui constituent un bon point de départ pour mesurer les signaux cellulaires dynamiques. Enfin, nous présentons nos algorithmes de traitement d’image17, une boîte à outils complète de traitement d’image qui contient plusieurs approches pour le prétraitement d’image (comme le démélange spectral), l’analyse d’image calcique et l’analyse hémodynamique (diamètre, vitesse, etc.). Ces algorithmes peuvent générer des tracés pour une visualisation rapide et facile des données, tout en minimisant le niveau d’expertise utilisateur requis pour analyser les résultats. De plus, il peut être automatisé avec quelques lignes de code pour traiter rapidement par lots plusieurs jeux de données avec les mêmes paramètres. Cela peut potentiellement améliorer la visualisation des données et l’investissement en temps du chercheur.
La clé pour collecter de bonnes données d’imagerie calcique est d’ajuster la puissance laser et les paramètres PMT pour une acquisition claire du signal de fluorescence, mais aussi de collecter des données à une fréquence d’images suffisante pour capturer l’ensemble de l’événement calcique. Les données de ce protocole ont été acquises à 10-11 images par seconde, ce qui capture les oscillations de calcium plus lentes dans les péricytes en gainant. Il existe également plusieurs étapes au cours de l’analyse qui peuvent améliorer les résultats de l’analyse. Premièrement, le démélange spectral est bénéfique s’il existe un chevauchement important entre les spectres d’émission des fluorophores(figure 2). La fluorescéine-dextran a été utilisée dans ce protocole parce qu’il s’agit d’un conjugué de dextran rentable et disponible dans le commerce qui est couramment utilisé pour les mesures hémodynamiques5. Le démélange spectral aide à nettoyer les données pour une meilleure détection des signaux calciques, mais d’autres fluorophores avec des spectres d’émission plus étroits pourraient également être utilisés. Deuxièmement, la sélection à la main des structures cellulaires en tant que ROI (Figure 3) est utile pour classer les événements calciques dans différentes régions sous-cellulaires telles que le soma ou les branches de processus. La sélection du retour sur investissement basée sur l’activité (Figure 4)16 fournit plus d’informations spatiales et temporelles sur les événements individuels du calcium. Cela peut être utile pour déterminer la fréquence des événements calciques dans une zone donnée ou la propagation des événements à d’autres zones cellulaires. L’utilisation d’un logiciel de programmation pour analyser les données d’imagerie peut faire gagner des heures aux chercheurs lorsque les données sont traitées par lots, mais cela nécessite un investissement initial en temps pour ajuster les paramètres afin d’obtenir des résultats optimaux. Les facteurs les plus importants sont la taille attendue (en μm2)de la région active ainsi que la durée du signal (le temps minimum du signal et le temps maximum du signal doivent être définis). Les chercheurs doivent d’abord examiner quelques exemples de films de la série T pour déterminer au mieux quels paramètres correspondent à leurs données. Enfin, des données de mauvaise qualité acquises au microscope peuvent grandement entraver l’analyse du calcium et de l’hémodynamique(Figure 6). Par conséquent, il faut prendre soin d’optimiser les paramètres d’acquisition du microscope au début. Avec ces facteurs à l’esprit, ce protocole peut être adapté pour s’adapter à l’imagerie calcique ou à l’analyse d’autres signaux cellulaires dynamiques (par exemple, sodium fluorescent, potassium, métabolite ou fluctuations de tension) dans d’autres tissus ou types de cellules.
Ce protocole présente plusieurs limitations. Tout d’abord, les données sont recueillies sous anesthésie, ce qui affecte l’activité cérébrale et pourrait avoir un impact sur le flux sanguin. Une imagerie similaire peut être effectuée chez des souris éveillées qui sont entraînées à accepter la fixation de la tête pour des résultats plus physiologiques. De plus, il est important de se rappeler que nous recueillons des images en 2 dimensions d’une cellule en 3 dimensions et d’un vaisseau sanguin in vivo. Par conséquent, nous ne pouvons capturer qu’une faction des événements calciques dans ces cellules ou le flux sanguin dans une seule section de vaisseau sanguin à la fois.
Une autre limite à noter est que l’imagerie calcique à deux photons est sensible aux artefacts de mouvement, où le mouvement à l’intérieur et à l’extérieur du plan focal peut être confondu avec les fluctuations du calcium. Ce protocole a été réalisé sous anesthésie, ce qui limite les mouvements de l’animal; cependant, les artefacts de mouvement peuvent être introduits par la fréquence respiratoire de la souris, la fréquence cardiaque, l’enflure possible des tissus et, dans le cas de l’enségainage des péricytes, la contraction des vaisseaux ou la vasomotion 4,6,18,19. Les artefacts de mouvement peuvent être atténués par plusieurs stratégies. Les packages de traitement d’image utilisés dans ce protocole incluent une étape de correction de mouvement en option, qui utilise un moteur de convolution 2D pour aligner les images au sein de la série T en fonction de la vascularisation visible13,17. Les images avec des changements significatifs dans le plan focal sont identifiées par cet algorithme et peuvent être exclues de l’analyse. De plus, il est possible d’utiliser des stratégies statistiques dans les packages de traitement d’imagerie, comme un Z-score lors de la génération des traces de fluorescence pour normaliser les fluctuations de calcium induites par le mouvement20. L’approche la plus robuste pour tenir compte des artefacts de mouvement dans l’imagerie à deux photons consiste à combiner l’expression de deux indicateurs fluorescents dans la même cellule, tels qu’un indicateur de calcium (par exemple, GCaMP) et un rapporteur fluorescent (par exemple, mCherry) indépendant du calcium. Les fluctuations du rapporteur fluorescent peuvent alors être attribuées au mouvement et sont soustraites du signal de l’indicateur de calcium pour normaliser les artefacts de mouvement.
Le but de ce protocole est de fournir une compréhension claire de la façon de recueillir des données optimales d’imagerie calcique et de flux sanguin in vivo et de présenter de nouvelles méthodes et de nouveaux outils d’analyse que les chercheurs peuvent mettre en œuvre afin d’améliorer leurs résultats. Ces techniques peuvent être appliquées pour étudier le rôle de différentes populations de péricytes dans le contrôle du flux sanguin ou dans différents états de maladie cérébrale. Ces paramètres d’imagerie peuvent également être utilisés pour étudier le calcium et le flux sanguin dans d’autres types de cellules et systèmes d’organes et des principes similaires s’appliquent à d’autres techniques d’imagerie dynamique rendues possibles par d’autres capteurs génétiquement codés, au-delà du calcium.

Le système nerveux central se compose d’artérioles pénétrantes, de capillaires et de veinules ascendantes. Au sein de ce réseau, les cellules murales telles que les cellules musculaires lisses vasculaires enveloppent les artérioles et les péricytes étendent les processus cellulaires le long des premières branches artérioles et capillaires1. Les péricytes semblent avoir plusieurs rôles dans le cerveau, y compris le maintien de la barrière hémato-encéphalique1,2, la migration et la motilité3, les propriétés potentielles des cellules souches et la régulation du flux sanguin cérébral4,5,6. De nombreux rôles fonctionnels des péricytes ont été liés à des fluctuations du calcium intracellulaire qui peuvent réguler la dilatation ou la contraction de ces cellules4,5,6.
Plusieurs études récentes ont établi des critères pour identifier différents types de péricytescérébraux 7,8. Les cellules murales dans les 4 premières branches des artérioles pénétrantes sont des péricytes gainants en fonction de leur expression de la protéine contractile α-lisse actine musculaire (αSMA) et de leur somata ovoïde saillant avec des processus qui enveloppentautour desvaisseaux 7,8,9. Pour visualiser les fluctuations calciques dans les péricytes ensaissés, ce protocole utilise une nouvelle lignée de souris transgénique, Acta2-RCaMP1.07, également connue sous le nom de Tg(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J10. Ces souris expriment l’indicateur de calcium génétiquement codé en rouge, RCaMP1.07, dans les cellules exprimant l’αSMA (cellules musculaires lisses vasculaires et péricytes gainants). Les colonies de reproduction sont maintenues en croisant des animaux non transporteurs avec des hémizygotes. RCaMP1.07 est une protéine fluorescente rouge avec un domaine de liaison à la calmoduline, qui augmente la fluorescence lors de la liaison au calcium intracellulaire10,11. Ce protocole décrit les étapes de l’imagerie calcique combinée des péricytes en gainant et des mesures du débit sanguin par microscopie à deux photons, y compris les procédures d’injection de colorants fluorescents dans la veine de la queue, l’acquisition d’images au microscope chez des souris anesthésiées et l’analyse de données avec des plates-formes de programmation (Figure 1). Ces techniques sont utiles pour répondre aux questions sur la physiologie cellulaire murale, mais peuvent être adaptées pour étudier les transitoires de calcium dans n’importe quel type de cellule du cerveau ou d’un autre système organique.
Une souris Acta2-RCaMP1.07 femelle de 10 mois a été utilisée pour l’expérience présentée dans cet article. La souris a subi une intervention chirurgicale pour une fenêtre crânienne chronique et une tête après l’implantation deux mois auparavant. Les détails du protocole chirurgical sont discutés dans les études précédentes12,13 et des procédures similaires ont été effectuées dans d’autres protocoles précédemment publiés14,15. Le système vasculaire est marqué avec de la fluorescéine-dextran verte (70 000 MW, solution anionique, 2,5 % p/v) injectée par voie intraveineuse. Ce colorant est rentable et facilement disponible auprès de sources commerciales, mais il a un spectre d’émission plus large qui peut chevaucher l’émission RCaMP et saigner lors de l’acquisition d’images au microscope. Les étapes du démélange spectral sont décrites à la section 4 ci-dessous pour contourner ce problème, mais d’autres colorants verts avec des spectres d’émission plus étroits, tels que ceux basés sur l’EGFP, peuvent également être utilisés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acta2-RCaMP1.07</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>28345</td>
			<td>In the video protocol the animal model used is a female mouse&#160; of&#160; 10 months, 1 day old.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applicators (Regular)</td>
			<td>Bisco</td>
			<td>X-80250P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFormats package for MATLAB</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Denominated in this protocol as &#34;image processing packages&#34;.&#160; Available in: https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIPS MATLAB toolbox</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Denomitaded in this protocol as &#34;image processing algorithms&#34;. Barrett MJP, Ferrari KD, Stobart JL, Holub M, Weber B. CHIPS: an Extensible Toolbox for Cellular and Hemodynamic Two-Photon Image Analysis. Neuroinformatics. 2018;16(1):145-147. doi:10.1007/s12021-017-9344-y. Available in: https://github.com/EIN-lab/CHIPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Ultrasound Gel, Medium viscosity</td>
			<td>HealthCare Plus</td>
			<td>UGC250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 70,000 MW, neutral</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Lube Plus</td>
			<td>Optixcare</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>Image J</td>
			<td>NA</td>
			<td>Denominated in this protocol as &#34;image processor software&#34;.&#160; Available in: https://imagej.net/Fiji/Downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCaMP6sfl/fl</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Post fixing platform</td>
			<td>University of Zurich</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Narketan 100 mg/mL)</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>440893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB R2020b</td>
			<td></td>
			<td>NA</td>
			<td>Denominated in this protocol as &#34;programming platform &#34;. Available in: https://www.mathworks.com/downloads/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 0.3mmx25mm</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective XLUMPLFLN20XW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/lumplfln-w/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR&#946;-CreERT2</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>30201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing, PE10 I.D. 28mm (0.11&#8221;) O.D. 61mm (.024&#8221;)</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prairie View</td>
			<td>Bruker Fluorescence Microscopy</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima In Vitro Multiphoton Microscope</td>
			<td>Bruker Fluorescence Microscopy</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Under Tank Heater</td>
			<td>Reptitherm U.T.H</td>
			<td>E169064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (Rompun 20 mg/mL)</td>
			<td>Bayer HealthCare</td>
			<td>2169592</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

brain pericyte calcium and hemodynamic imaging in transgenic mice in vivo

Les progrès récents de la biologie des protéines et de la génétique de la souris ont permis de mesurer in vivo les fluctuations intracellulaires du calcium des cellules cérébrales et de les corréler avec l’hémodynamique locale. Ce protocole utilise des souris transgéniques qui ont été préparées avec une fenêtre crânienne chronique et expriment l’indicateur de calcium génétiquement codé, RCaMP1.07, sous le promoteur de l’actine musculaire α lisse pour étiqueter spécifiquement les cellules murales, telles que les cellules musculaires lisses vasculaires et les péricytes gainants. Les étapes sont décrites sur la façon de préparer un cathéter veineux de la queue pour l’injection intraveineuse de colorants fluorescents pour tracer le flux sanguin, ainsi que sur la façon de mesurer le calcium péricyte cérébral et l’hémodynamique locale des vaisseaux sanguins (diamètre, vitesse des globules rouges, etc.) par microscopie à deux photons in vivo à travers la fenêtre crânienne chez des souris anesthésiées à la kétamine / xylazine. Enfin, des détails sont fournis pour l’analyse des fluctuations du calcium et des films de flux sanguin via les algorithmes de traitement d’image développés par Barrett et al. 2018, en mettant l’accent sur la façon dont ces processus peuvent être adaptés à d’autres données d’imagerie cellulaire.

La fluorescéine-dextran a un large spectre d’émission qui peut saigner dans le canal rouge, ce qui a un impact sur la détection du RCaMP dans les péricytes ensanglantés(Figure 2A). Le démélange spectral après l’acquisition des données dans le logiciel réduit le saignement de la fluorescéine à travers (Figure 2B, plus bas), améliorant la détection du signal calcique dans les étapes d’analyse ultérieures.
L’analyse du calcium avec les algorithmes de traitement d’image utilisés dans ce protocole permet plusieurs approches différentes pour identifier les ROI et les fluctuations du calcium intracellulaire (c.-à-d. les signaux de calcium). La sélection des structures cellulaires à la main permet de détecter les fluctuations calciques à l’intérieur de ces régions (Figure 3A), y compris différents types de pics de signal, tels que les pics simples et les pics multiples, après que les traces de calcium normalisées sont filtrées passe-bas et passe-bande (Figure 3B). De plus, les ROI sont identifiés en regroupant les pixels actifs où l’intensité de fluorescence change au fil du temps à l’aide d’algorithmes de traitement d’image développés par Ellefsen et al.2014 16 et Barrett et al. 201817 (Figure 4). Cela peut être appliqué à n’importe quel signal cellulaire dynamique en ajustant le temps, le seuil et les paramètres spatiaux pour englober la taille et la forme attendues du signal. La diminution du seuil d’identification du signal révèle plus de régions d’intérêt(Figure 4B).
Des kymographes hémodynamiques brillants et clairs peuvent être analysés pour mesurer le diamètre et la vitesse des globules rouges dans les vaisseaux sanguins à proximité des péricytes envelocés (Figure 5A, B). Le diamètre est calculé à partir de la pleine largeur à la moitié maximale de la fluorescence(Figure 5C). La vitesse rbC est approchée à partir des stries faites à partir de globules rouges non étiquetés, où l’angle est entré dans une transformation du radon pour calculer la vitesse, le flux (cellules/s) et la densité linéaire (cellules/mm; Figure 5D). Les kymographes de mauvaise qualité où il y a saturation en fluorescence, mauvais rapport signal/bruit ou mouvement du champ d’imagerie (Figure 6A) créent des tracés peu fiables avec des points d’erreur (croix rouges) où les données ne peuvent pas être déterminées (Figure 6B, C). La qualité des données acquises est essentielle pour un bon résultat et suivre les étapes décrites dans ce protocole garantit de bons résultats.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig01.jpg"> Graphique 1. Résumé du protocole. Le protocole présente les étapes à suivre pour acquérir et analyser des images fluorescentes de calcium à partir de péricytes gainant le cerveau et des données de flux sanguin provenant de vaisseaux sanguins voisins chez des souris anesthésiées. Le protocole est divisé en 4 étapes. 1) Préparation de la procédure: mise en place de l’équipement et préparation du cathéter; 2) Injection de veine caudale; 3) Acquisition de données par microscopie à deux photons; 4) Analyse de données avec des algorithmes de traitement d’images. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig02.jpg"> Graphique 2. Démélange spectral des fluorophores. A) Image moyenne représentative du vaisseau sanguin marqué péricyte et fluorescéine-dextran rCaMP provenant d’une acquisition de la série T. Barre d’échelle = 10 μm.B) Supérieure : Lorsque l’on considère les canaux individuels, le fond perdu du canal 2 est apparent dans le canal 1 (à gauche). Inférieur : Après le démélange spectral, le saignement est réduit et le signal du RCaMP est plus important dans la structure péricytaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig03.jpg"> Graphique 3. Retours à la main sélectionnés et traces de calcium optimisées. A) Les régions d’intérêt sélectionnées dans le logiciel de traitement d’image utilisé (formes arc-en-ciel) peuvent être utilisées pour identifier les traces de signal de calcium. B) Les pics de signal à partir de traces normalisées sont identifiés par passage bas et passe-bande filtrant les données. Nous avons défini le seuil de signal comme 3 fois l’écart-type de la période de référence (30 premières images) et tout pic au-dessus de ce seuil a été considéré comme un signal (trace inférieure). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig04.jpg"> Graphique 4. Rois automatisés basés sur l’activité pour l’analyse du calcium. Les mêmes données ont été analysées avec un seuil de 7 fois l’écart-type de la ligne de base (A) et de 3 fois l’écart-type de la ligne de base (B). En diminuant le seuil d’identification des pixels actifs, on trouve plus de retour sur investissement (B) et de pics de signal (graphique à secteurs) dans les péricytes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig05.jpg"> Graphique 5. Mesures hémodynamiques kymographiques. A) Exemple de balayage de ligne à travers le navire. B) Exemple de kymographes bien définis pour le diamètre (à gauche) et la vitesse (à droite). Les stries noires dans la bande de fluorescence droite correspondent à l’analyse du diamètre rbC.C) avec des fluctuations de vasomotion claires. D) Analyse de la vitesse avec des tracés pour l’axe Y = flux RBC (cellules / s), densité de ligne (cellules / mm), vitesse (mm / s) et angle de traînée (degré), rapport signal / bruit (unités arbitraires, a.u.), axe X = temps (sec). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig06.jpg"> Graphique 6. Représentation de mesures hémodynamiques de mauvaise qualité. A) Exemples de kymographes de mauvaise qualité avec saturation en fluorescence, mauvais rapport signal/bruit ou mouvement du champ d’imagerie pendant l’acquisition. B et C) Graphiques similaires à la figure 7 des données de diamètre et de vitesse qui ont des points d’erreur (points rouges) en raison de la mauvaise qualité des kymographes. (image E, axe Y = diamètre (μm), axe X = temps (sec); image F, axe Y = flux RBC (cellules / s), densité de ligne (cellules / mm), vitesse (mm / s) et angle de traînée (degré), rapport signal / bruit (a.u.), axe X = temps (sec). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Ce protocole présente des étapes pour acquérir et analyser des images fluorescentes de calcium à partir de péricytes ensanglant le cerveau et des données de flux sanguin provenant de vaisseaux sanguins voisins chez des souris anesthésiées. Ces techniques sont utiles pour l’étude de la physiologie cellulaire murale et peuvent être adaptées pour étudier les transitoires de calcium dans n’importe quel type de cellule.

Calcium péricyte cérébral et imagerie hémodynamique chez des souris transgéniques in vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Le système vasculaire cérébral est un réseau complexe d’artères pénétrantes, de capillaires et de veinules ascendantes. Ces vaisseaux sont enveloppés par des cellules murales, telles que les péricytes gainants, qui expriment l’actine musculaire alpha lisse, et se trouvent dans les quatre premières branches des artères pénétrantes. Nous utilisons des souris transgéniques Acta2-RCaMP 1.07 pour visualiser les transitoires de calcium dans ces cellules, grâce à l’expression de l’indicateur de calcium génétiquement codé RCaMP.Le calcium joue un rôle important dans la contraction de ces cellules et le contrôle du flux sanguin. Les péricytes capillaires se trouvent plus en aval dans le réseau vasculaire et peuvent être marqués dans d’autres modèles transgéniques. Cependant, nous nous concentrons sur l’ensemencement des péricytes dans cette méthode.Nos souris ont été implantées chirurgicalement avec une fenêtre crânienne chronique qui permet d’accéder au système vasculaire cérébral pour l’imagerie. Ici, nous décrivons les étapes de préparation nécessaires et l’injection de la veine caudale suivies des deux méthodes d’imagerie photonique et d’analyse nécessaires pour acquérir des données sur le calcium péricyte et des informations sur le flux sanguin chez les animaux anesthésiés. Les éléments suivants sont requis pour une injection de cathéter veineux de queue: seringues à insuline, un morceau de tube PE10 de 15 centimètres, aiguilles de calibre 30, gaze, solution saline, pinces, colorant dextran de fluorescéine verte, pince et ciseaux.Nous avons également une aiguille avec une anesthésie à la kétamine xylazine que nous allons injecter avant l’imagerie car elle est meilleure que l’isoflurane pour les mesures du débit sanguin. À l’aide de la pince, cassez une aiguille de calibre 30 du moyeu. Insérez soigneusement l’aiguille dans l’extrémité du morceau de tube PE10 attaché à une seringue remplie de solution saline.Il s’agit du cathéter pour injection. Anesthésier une souris avec de l’isoflurane et appliquer le gel I-Lube. Placez un champ de gants avec de l’eau tiède sur la queue pour dilater la veine latérale.Après avoir nettoyé la queue avec de l’éthanol, insérez l’aiguille dans la veine et injectez doucement une solution saline à travers le cathéter pour vous assurer que l’aiguille est placée correctement. Allumez la seringue sur le cathéter pour une seringue remplie de colorant fluorescéine dextran. Injectez lentement le colorant pour vous assurer qu’aucune bulle ne pénètre dans le tube.Remplacez la seringue dextran par la seringue saline et rincez le tube jusqu’à ce qu’il ne reste plus de colorant dans le tube. Retirez l’aiguille et appuyez avec de la gaze. Injecter une anesthésie à la kétamine xylazine pour l’imagerie.Avec la tête de souris fixée sur un coussin chauffant, nettoyez la fenêtre crânienne avec des applicateurs dentaires. Appliquez du gel à ultrasons sur la fenêtre et faites la mise au point à travers l’objectif du microscope à deux photons. Pour l’imagerie à deux photons, nous utilisons un microscope avec laser saphir en titane réglable pour les fluorescents, l’excitation et les tubes photomultiplicateurs pour la détection des émissions.Dans le logiciel du microscope, réglez la longueur d’onde à 990 nanomètres pour exciter à la fois le RCaMP et la fluorescéine dextran. Ensuite, réglez la puissance du laser en ajustant la tension de la cellule pockel et la sensibilité du détecteur PMT. Le balayage en direct avec ces paramètres et une résolution plus élevée, les cellules murales RCaMP positives et le plasma sanguin marqué par fluorescence peuvent être vus.L’acquisition d’une pile de profondeur est recommandée pour localiser correctement les péricytes dans le réseau vasculaire. Lorsque vous êtes focalé en haut du tissu près des vaisseaux PO, définissez-le comme point zéro et haut de la pile de la série Zed, puis concentrez-vous vers le bas dans le tissu à la profondeur souhaitée et définissez-le comme le bas de la pile. La puissance du laser doit être ajustée pour augmenter à mesure que le microscope se déplace plus profondément dans la pile.En ouvrant la série Zed dans un logiciel de traitement d’image, fusionnez les deux canaux en tant qu’images colorées et parcourez la pile à la recherche de péricytes et de vaisseaux sanguins d’intérêt. Sélectionnez les régions d’intérêt qui contiennent des péricytes et enregistrez les positions pour aider à localiser à nouveau ces points lors de futures séances d’imagerie. Pour collecter et déplacer un événement de calcium péricyte, augmentez la fréquence d’images d’acquisition à plus de 10 images par seconde.Définissez la durée de l’imagerie sur 60 secondes et mettez à jour le chemin d’enregistrement avec un nom de fichier unique. Zoomez optiquement sur le vaisseau pour tenir compte de la résolution inférieure et pour avoir une vue plus rapprochée du péricyte. Acquérir la série T.Pour mesurer le diamètre des vaisseaux sanguins et la vitesse des globules rouges, sélectionnez le balayage linéaire pour commencer un balayage unidimensionnel au microscope. Définissez d’abord la durée de l’analyse en millisecondes. Tracez ensuite une ligne qui coupe en deux le navire d’intérêt et se déplace parallèlement le long du navire.Cela générera un kymographe du diamètre du vaisseau à gauche et des stries des globules rouges se déplaçant à travers le vaisseau à droite. Consultez le tableau des matériaux pour obtenir la liste complète des programmes et des packages utilisés dans ce protocole. Sélectionnez d’abord les régions d’intérêt à la main dans un logiciel de traitement d’image.Chargez le fichier de la série T, prenez la moyenne de la pile et créez une image colorée. Sélectionnez l’outil polygone et tracez le contour des structures péricytaires en gainage visibles telles que le soma et les processus. Donnez à chaque région d’intérêt un nom unique et enregistrez-les dans un dossier zip qui peut être chargé ultérieurement dans le logiciel de programmation.Ouvrez le logiciel de programmation et assurez-vous que les dossiers des packages de traitement d’image se trouvent sur le chemin. Importez la série calcium T dans le logiciel de programmation et définissez ce qui se trouve sur chaque canal. Dans ce cas, il s’agit d’un signal cellulaire sur le canal un et du plasma sanguin sur le canal deux.Tracez les données sous forme de film dans le logiciel de programmation pour faciliter la visualisation. Pour éliminer les fluorescents verts de la fluorescéine dextran qui saigne dans le canal rouge RCaMP, décomfondez les canaux dans le package de traitement d’image. Sélectionnez d’abord une région qui ne contient que du fluorophore 1, RCaMP dans ce cas.Deuxièmement, sélectionnez une région qui ne contient que du fluorophore 2, de la fluorescéine dans le plasma. Enfin, sélectionnez une zone d’arrière-plan qui n’a pas de fluorophore. Cela génère une matrice de contribution spectrale, qui est appliquée à chaque pixel de chaque canal.Il améliore considérablement la localisation du signal RCaMP, ce qui améliorera la détection des événements calciques dans ces structures. Il existe plusieurs façons d’analyser les données d’imagerie calcique dans les packages de traitement d’image. Exécutez d’abord l’analyse de signalisation cellulaire sur le film de calcium non mélangé et chargez les régions d’intérêt à partir du dossier zip qui ont été sélectionnées à la main dans les péricytes plus tôt.Définissez le facteur d’échelle sur un car les régions n’ont pas besoin d’être redimensionnées. Après le traitement, générez des tracés de chaque ROY et des traces de calcium normalisées de différentes couleurs. Si le code ne détecte pas la majorité des événements calciques dans les traces individuelles, modifiez les paramètres intégrés dans la zone d’optimisation, par exemple en diminuant le seuil pour les données filtrées de passe courte à trois fois l’écart-type de la période de référence, qui est les 30 premières images de la série T.Afin de détecter et de classer les signaux, la trace de calcium normalisée est filtrée en passe longue et passe-bande, ce qui permet de lisser les données pour l’amplitude et avec des estimations, mais aussi de déterminer si les signaux sont des pics simples, des pics multiples ou des plateaux. Produisez les données sous forme de fichier CSV pour une analyse statistique plus approfondie. Exécutez l’analyse de signalisation cellulaire une deuxième fois sur le film de calcium non mélangé et sélectionnez l’identification automatisée de la région d’intérêt en fonction de l’activité et du changement des fluorescents en trois dimensions, X, Y et le temps.Tracez les résultats du processus pour afficher les régions d’intérêt identifiées de différentes couleurs. Si l’algorithme ne détecte pas les ROYs qui sont clairement visibles à l’œil nu dans le film, modifiez les paramètres intégrés, tels que l’augmentation du filtre gaussien qui lisse les données dans le temps et la diminution du seuil de recherche de ROYs à trois fois l’écart type de la ligne de base. Tracez les ROYs comme un film pour une visualisation plus poussée.Produisez les données sous forme de fichier CSV pour une analyse statistique plus approfondie. Importez le fichier de données kymograph à balayage linéaire dans le logiciel de programmation et définissez ce qui se trouve sur chaque canal. Exécutez la fonction d’analyse de diamètre sur le balayage linéaire, qui ouvre une boîte pour sélectionner la zone qui correspond au diamètre dans le kymographe.Dessinez une boîte à l’extérieur des limites des fluorescents du kymographe, qui correspond au diamètre du récipient. Traiter cette classe de données afin de mesurer la pleine largeur à des demi-maxima pour le diamètre du récipient et de générer un tracé. Ensuite, exécutez le taux de vitesse sur l’analyse de transformation et dessinez une boîte à l’intérieur de la bordure des fluorescents du kymographe.Traitez cette classe de données afin de calculer la vitesse, le flux et la densité linéaire des globules rouges. Produisez les résultats du flux sanguin sous forme de fichier CSV pour une analyse plus approfondie. La sélection des structures cellulaires à la main permet de détecter les fluctuations du calcium dans ces régions, y compris différents types de pics de signal, tels que les pics simples et les pics multiples, une fois que les traces de calcium normalisées sont filtrées passe-bas et passe-bande.De plus, les régions d’intérêt sont identifiées en regroupant les pixels actifs où l’intensité des fluorescents change au fil du temps à l’aide d’algorithmes de traitement d’image. Cela peut être appliqué à n’importe quel signal cellulaire dynamique en ajustant le temps, le seuil et les paramètres spatiaux pour englober la taille et la forme attendues du signal. La diminution du seuil d’identification du signal trouve plus de régions d’intérêt.Des kymographes hémodynamiques clairs sont analysés pour mesurer le diamètre et la vitesse des globules rouges dans les vaisseaux sanguins près des péricytes ensgayants. Le diamètre est calculé à partir de la pleine largeur à la moitié maximale des fluorescents. La vitesse des globules rouges est approximative à partir des stries faites à partir de globules rouges non étiquetés, où l’angle est entré dans une transformation du radon pour calculer la vitesse.Les kymographes de mauvaise qualité, où il y a une saturation fluorescente, un mauvais rapport signal /bruit ou un mouvement du champ d’imagerie, créent des tracés peu fiables avec des points d’erreur, indiqués sous forme de croix rouges, où les données ne peuvent pas être déterminées. La qualité des données acquises est essentielle pour un bon résultat et suivre les étapes décrites dans ce protocole garantit de bons résultats. Dans cette vidéo, nous décrivons la procédure d’imagerie calcique combinée des péricytes en gainant le cerveau et les mesures du débit sanguin par microscopie à deux photons.Ces techniques sont utiles pour répondre aux questions sur la physiologie cellulaire murale et la localisation dans le réseau vasculaire du cerveau, mais elles peuvent être adaptées pour étudier les transitoires de calcium dans n’importe quel type de cellule du cerveau ou d’un autre système organique.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Utilisation de neuro-imagerie fonctionnelle par ultrasons rupture de la barrière hémato-encéphalique et le manganèse-IRM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Recherche

Neurosciences

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

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En imagerie calcique in vivo des neurones en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

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In Vivo cérébrale fonctionnelle approche d&#39;imagerie à base de calcium Bioluminescent Indicateur GFP-aequorine

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Bioluminescence imagerie de la neuro-inflammation chez des souris transgéniques Après périphériques Ensemencement de l&#39;alpha-synucléine Fibrilles

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

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Imagerie biphotonique Calcium en Dendrites neuronales dans des tranches de cerveau

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Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

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Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

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