Name: establishment of an electrophysiological platform for modeling als with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons
Uploaded: 2021-08-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons at JoVE

Dette manuskript blev understøttet af følgende: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH/NINDS (CWH), 2020 Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Career Development Award (CWH). 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). Vi takker Dr. Raha Dastgheyb og Dr. Norman Haughey for at levere MEA-platformen og dataanalysesoftwaren, som vi har brugt til at validere den beskrevne elektrofysiologiske platform. Vi vil gerne takke Khalil Rust for deres hjælp med protokoldemonstration og filmoptagelse.

1. Forberedelse af cellekulturmedier
<ol><li>De enkelte cellekulturmedier fremstilles ved hjælp af sammensætningerne nævnt i tabel 1.</li>
	<li>Bland og sterilfiltrer mediet i 500 ml filtrerede flasker, og opbevar beskyttet mod lys ved 4 °C i op til 2 uger.</li>
</ol>2. Vedligeholdelse og overførsel af ikke-sammenflydende humant inducerede pluripotente stamceller (hiPSC)
<ol><li>Optø kældermembranmatrixen (opbevaret i alikvoter ved -80 °C) i et køleskab på 2-8 °C na...

<ol>
	<li>Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review:+Induced+pluripotent+stem+cells+and+the+search+for+new+cell-specific+ALS+therapeutic+targets.">Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets.</a> Neuroscience Letters. 755, 135911 (2021).</li><li>Taga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+spinal+cord+astrocytes+in+the+functional+maturation+of+motor+neurons+in+a+multi-electrode+array+system.">Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system.</a> Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).</li><li>Klapper, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+lineage+cells+are+essential+for+functional+neuronal+differentiation+and+synapse+maturation+in+human+iPSC-derived+neural+networks.">Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks.</a> Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+C9orf72+human+iPSC-derived+astrocytes+cause+non-cell+autonomous+motor+neuron+pathophysiology.">Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology.</a> Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).</li><li>Almad, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+43+in+astrocytes+contributes+to+motor+neuron+toxicity+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).</li><li>Wainger, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+membrane+hyperexcitability+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+patient-derived+motor+neurons.">Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons.</a> Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).</li><li>Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+astrocytes:+Specification+and+relevance+for+neurological+disorders.">Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders.</a> Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).</li><li>Imaizumi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+regional+identity+of+hPSC-derived+neurons+to+uncover+neuronal+subtype+specificity+of+neurological+disease+phenotypes.">Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).</li><li>Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+evaluation+of+convulsant+and+anticonvulsant+drugs+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cortical+neuronal+networks+using+an+MEA+system.">Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10416 (2018).</li><li>Haidet-Phillips, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+profiling+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+astrocyte+progenitors+following+spinal+cord+engraftment.">Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment.</a> Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).</li><li>Roybon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+spinal+cord+astrocytes+with+defined+mature+or+reactive+phenotypes.">Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes.</a> Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).</li><li>Shimojo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=simple+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells.">simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).</li><li>Chandrasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+2D+and+3D+neural+induction+methods+for+the+generation+of+neural+progenitor+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).</li><li>Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+transplantable+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+sonic+hedgehog+and+Wnt+signaling+determines+ventral+and+dorsal+telencephalic+neuron+types+from+human+embryonic+stem+cells.">Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells.</a> Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).</li><li>Liu, H., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+neuronal+and+glial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).</li><li>Borghese, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+notch+signaling+in+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+stem+cells+delays+G1/S+phase+transition+and+accelerates+neuronal+differentiation+in+vitro+and+in+vivo.">Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo.</a> Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cerebral+cortex+development+from+pluripotent+stem+cells+to+functional+excitatory+synapses.">Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses.</a> Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).</li></ol>

Hidtil har hiPSC- og MEA-baserede metoder til elektrofysiologiske optagelser af astrocyt-neuron-cokulturer fundet begrænset anvendelse inden for ALS6 og stadig ikke i fuldt menneskelige platforme, i modsætning til deres mere udbredte anvendelse til in vitro-modellering af epilepsi9. Denne platform har imidlertid potentialet til at behandle patofysiologisk relevante spørgsmål i ALS-forskning, såsom mekanismerne for neuronal hyperexcitabilitet, astrocytbidrag ti...

Humane pluripotente stamcelleafledte astrocytter (hiPSC-A) og neuroner (hiPSC-N) er kraftfulde værktøjer til modellering af amyotrofisk lateral sklerose (ALS) patofysiologi in vitro og giver et translationelt paradigme for lægemiddelopdagelsesstrategier1. Forskere har vist, at co-kulturen af hiPSC-A med hiPSC-N forbedrer den morfologiske, molekylære, elektrofysiologiske og farmakologiske modning af begge celletyper, hvilket genererer komplekse neuronale netværk og astrocyt-neuron-interaktioner, der ligner deres in vivo-modstykker 2,3. Lignende co-kultur eksperimenter kan rekapitulere kendetegn ved ALS patobiologi såsom astrocyt-medieret neurotoksicitet 4,5 og neuronal hyper-excitabilitet6. Derudover kan humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) med fremskridt inden for differentieringsprotokoller differentieres i regionalt specifikke neurale undertyper, herunder kortikale og rygmarvs-hiPSC-A og hiPSC-N 7,8. Disse strategier giver mulighed for modellering af kortikal og spinal motor neuron patologi i ALS samt den astrocytiske indflydelse på begge. Dette kræver imidlertid, at der er et reproducerbart funktionelt assay til bestemmelse af disse virkninger.
For nylig blev det vist, at multi-electrode array (MEA) optagelse er særligt velegnet til elektrofysiologisk karakterisering af neuron-astrocyt co-kulturer2. I modsætning til enkeltcellede elektrofysiologiske analyser registrerer disse elektrodearrayer med høj densitet passivt ekstracellulære feltpotentialer fra store populationer af neuroner uden at forstyrre dyrkningsforholdene og bevare cellemembranernes integritet. Disse platforme er særligt nyttige til registrering af kulturers cellulære og netværksaktivitet over tid og som reaktion på farmakologisk manipulation. Endelig, når tilstedeværelsen af astrocytter er en kulturvariabel, kan MEA-optagelser give funktionel indsigt i astrocyt-neuron tovejsinteraktioner 2,9.
Her præsenteres en optimeret protokol til differentiering af hiPSC i rygmarv hiPSC-A og hiPSC-motorneuroner (MN), der tidligere er valideret2. Rygmarven hiPSC-A-differentieringsprotokollen resulterer konsekvent i astrocytkulturer, som er positive for S100 calciumbindende protein B (S100β), glialfibrillært surt protein (GFAP) og Homeobox B4 (HOXB4) i op til henholdsvis 80%, 50% og 90% af cellerne, hvilket indikerer en modning af glia- og rygmarvsspecifikation 2,10 . HiPSC-MN-differentieringsprotokollen genererer neuroner, der er >90% positive for cholinacetyltransferase (ChAT), hvilket tyder på en moden alfa-motorisk neuronidentitet2. Derudover beskriver protokollen teknikker til generering af hiPSC-A / MN-cokulturer, der tidligere har vist sig at resultere i neuroner med forbedret morfologisk kompleksitet ved Scholl-analyse og immunofluorescerende mikroskopi sammenlignet med neuronale kulturer uden astrocytter eller med gnaverastrocytter2. Mens disse beskrivelser er specifikke for rygmarv hiPSC-A og hiPSC-N, er en unik fordel, at den oprindelige uafhængige kultur af astrocytter og neuroner efterfulgt af trin til co-kultur på senere tidspunkter kan oversættes til at studere virkningerne af neuron-astrocytinteraktioner fra andre specifikke regioner såvel som sygdomsspecifikke celler 7,8 . Endelig beskriver protokollen, hvordan man dyrker disse kulturer på MEA-plader, så funktionel aktivitet som en faktor for co-kultursammensætning kan studeres over tid med evnen til at manipulere cellulær sammensætning såvel som kulturbetingelser.
Målet med disse protokoller er at tilvejebringe et funktionelt assay til at undersøge astrocyt-neuron-interaktioner, undersøge sygdomsspecifikke ændringer og teste lægemidler med terapeutisk potentiale inden for ALS. Videoinstruktioner leveres til de mest udfordrende trin i denne protokol.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm sterile culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 sterile culture flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Working concentration 110 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL 0.2 &#181;m CA Filter System</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well sterile culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericine B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td>Working concentration 2.0 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anionic detergent with protease enzyme - Terg-A-Zyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273287</td>
			<td>Working concentration 1% m/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid (ASAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 &#181;m filter, aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 &#181;g/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W)</td>
			<td>Axion</td>
			<td>OPT-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axion Edge MEA platform</td>
			<td>Axion</td>
			<td>Maestro Edge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane matrix - Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Details in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microscope (sterile under cell culture hood)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415510-1100-000</td>
			<td>Primo Vert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicuculline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>14340</td>
			<td>Working concentration10 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciliary neurotrophic factor (CNTF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-13</td>
			<td>Dissolve 100 &#181;g in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tanks and regulator for Axion Edge</td>
			<td>AirGas/Harris</td>
			<td>9296NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound E</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab142164</td>
			<td>Dissolve 250 &#181;g in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 &#181;M stock. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanquixaline&#160; (CNQX)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C239</td>
			<td>Working concentration 50 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydrokainic acid (DHK)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>111</td>
			<td>Working concentration 50 &#956;M and 300 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>113300</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>Combine 10 mL of Essential 8 (10x)&#160; supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Dissolve 100 &#181;g in 1mL of PBS to 100 &#181;g/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Election Microscopy Sciences</td>
			<td>63510-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Millipore-sigma</td>
			<td>H3149-100KU</td>
			<td>Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 &#181;L tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 &#181;g/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity controlled Cell culture incubator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>370</td>
			<td>set to 37 &#186;C, 5 % CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-like growth factor 1 (IGF-1)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>291-G1-200</td>
			<td>Dissolve 200 &#181;g in 2 mL of PBS to 100 &#181;g/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 &#181;g/mL stock and store at -80 &#186;C. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 10 &#181;g/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kainc acid</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab144490</td>
			<td>Working concentration 5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10828</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 &#181;g/mL (coating), 1 &#181;g/mL (cell media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td>Dissolve 2 mg of LDN into 500 &#181;L of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 &#186;C. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 &#181;M working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25030</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA glass plates</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td>60MEA200/30iR-Ti-gr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipet P200</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>PJ22224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td>Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 &#181;L tubes. (working concentration 100 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Working concentration100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (PMN)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>540223</td>
			<td>Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 &#181;g in 1 mL of PBS to 100 &#181;g/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 &#181;L/tube and freeze at -80 &#186;C. Take 200 &#181;L of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 &#181;L/tube&#160;and store at -80 &#186;C. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK-I nhibitor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>1293823</td>
			<td>Dissolve 5 mg in 1480 &#181;L of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4317</td>
			<td>Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell culture hoods</td>
			<td>Baker Company</td>
			<td>SG-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement B - B27 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Working concentration 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement N - N2 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top cell culture centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75004261</td>
			<td>Sorvall Legend X1R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoplastic&#160;film - Parafilm</td>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue dissociation protease - Dispase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522-1G</td>
			<td>Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 &#186;C. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>2530054</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>2332</td>
			<td>Isotemp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of an electrophysiological platform for modeling als with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons

Humane pluripotente stamcelleafledte astrocytter (hiPSC-A) og neuroner (hiPSC-N) giver et kraftfuldt værktøj til modellering af amyotrofisk lateral sklerose (ALS) patofysiologi in vitro. Multi-electrode array (MEA) optagelser er et middel til at registrere elektriske feltpotentialer fra store populationer af neuroner og analysere netværksaktivitet over tid. Det blev tidligere påvist, at tilstedeværelsen af hiPSC-A, der differentieres ved hjælp af teknikker til fremme af en rygmarvsastrocytfænotype, forbedrede modning og elektrofysiologisk aktivitet af regionalt specifikke rygmarvshiPSC-motorneuroner (MN) sammenlignet med dem, der dyrkes uden hiPSC-A eller i nærvær af gnaverastrocytter. Her beskrives en metode til samdyrkning af rygmarvs-hiPSC-A med hiPSC-MN og registrering af elektrofysiologisk aktivitet ved hjælp af MEA-optagelser. Mens differentieringsprotokollerne beskrevet her er specifikke for astrocytter og neuroner, der er regionalt specifikke for rygmarven, kan co-culturing platformen anvendes på astrocytter og neuroner differentieret med teknikker, der er specifikke for andre skæbner, herunder kortikal hiPSC-A og hiPSC-N. Disse protokoller sigter mod at tilvejebringe et elektrofysiologisk assay for at informere om glia-neuroninteraktioner og give en platform til test af lægemidler med terapeutisk potentiale i ALS.

Rygmarvsmønsterprotokollen til generering af hiPSC-MN og rygmarvs-hiPSC-A er skitseret i figur 1. I denne protokol vedligeholdes og passeres hiPSC'er som ikke-sammenflydende kolonier (figur 2A). Neurogenese initieres (neural induktion) gennem dobbelt SMAD-hæmning ved tilsætning af LDN193189 og SB431542, der inaktiverer henholdsvis knoglemorfogenetisk protein (BMP) og de transformerende vækstfaktor-beta (TGF-β) veje. En monolagsbaseret metode anvendes til de...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons at JoVE

Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons

Vi beskriver en metode til differentiering af rygmarvsinducerede pluripotent-afledte astrocytter og neuroner og deres samkultur til elektrofysiologisk registrering.

Etablering af en elektrofysiologisk platform til modellering af ALS med regionalt specifikke humane pluripotente stamcelleafledte astrocytter og neuroner

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) ...

Den teknik, vi præsenterer i dag, giver mulighed for analyse af rygmarvsneuronaktivitet som følge af iboende neuronal faktor og indflydelsen fra omgivende astrocytter. Denne teknik genererer pålideligt både menneskelige neuroner og menneskelige astrocytter, der er rygmarvsspecifikke og bruger et funktionelt outputmål, der kan skaleres til reproducerbarhed. Den teknik, vi præsenterer, gør det muligt at undersøge rygmarvsneuroner specifikke sygdomme såsom amyotrofisk lateral sklerose ved hjælp af neuroner fra patienter med enten sporadisk eller genetisk sygdom.Til at begynde med skal du undersøge de menneskelige iPSC-plader for tilstrækkeligt tætte kolonier, således at koloniernes centrum viser spredte hvide områder. For at begynde at pakke cellerne skal du tegne gitterlinjer på pladernes nederste ydre overflade med en markør for at lette nøjagtig dækning af hele pladen. Brug et fasekontrastmikroskop med 10x forstørrelse i en kulturhætte til at løsne differentierede kolonier ved manuelt at skrabe med en 200 mikroliter pipettespids.Skyl derefter pladerne to gange med PBS. Og tilsæt derefter fem ml vævsdissociationsprotease forvarmet ved 37 grader Celsius. Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius i fire til syv minutter, indtil koloniernes kanter begynder at runde op, inden kolonierne løftes fra pladen.Aspirer forsigtigt dissociationsproteasen og skyl forsigtigt pladen to gange med PBS uden at løsne kolonierne. Tilsæt fem ml forvarmet humant iPSC-medium til kulturpladen. Skrab derefter hele pladen med en spids af en fem milliliter pipette ved hjælp af en frem og tilbage bevægelse fra top til bund og løft kolonierne, mens du bryder dem op i mindre celleaggregater.Til differentiering af human iPSC i neurale stamceller. Når menneskelig iPSC danner et monolag og bliver 90% sammenflydende, skal du starte differentiering som beskrevet i manuskriptet. På den 12. dag, efter trypsinbehandling, hvis cellerne ikke er i suspension, løsnes cellerne mekanisk ved at skubbe neuralt induktionsmedium ud af en 1000 mikroliter pipettespids på cellerne med en cirkulær bevægelse for at dække hele overfladen.Hvis de neurale stamcellekulturer blev frosset, optø dem. Efter medium udveksling og PBS-skylning som beskrevet i manuskriptet ændres substratet med et motorneurondifferentieringsmedium indeholdende 0,02 mikromolært cytosinarabinosid, og derefter inkuberes cellerne i 48 timer ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid, når glial-engagerede forfædre fremkommer som enkeltprolifererende flade celler under postmitotiske motorneuronforfædre, aggregeret i celleklynger. Senere udført medium udveksling som angivet i manuskriptet.På pletteringsdagen eller før skal du begynde at belægge de 24 brønd MEA-plader ved først at fortynde PLO i vand eller PBS. Derefter tilsættes 15 til 20 mikroliter PLO til hver brønd, der danner en dråbe på midten af brønden, der dækker elektrodeområdet og sikrer, at elektroderne ikke beskadiges med pipettespidsen. Tilsæt vand til rummene omkring brønde, hvilket sikrer tilstrækkelig fugtighed.Og inkuber PLO ved 37 grader Celsius i en til to timer. Brug derefter en plastik mikropipettespids til at aspirere så meget PLO som muligt uden at røre elektroderne. Vask derefter brønden med 250 mikroliter vand tre gange.Fjern så meget vand som muligt med en pipettespids, og lad overfladen tørre med låget fjernet. Derefter tilsættes 15 til 20 mikroliter fortyndet laminin for at dække hvert elektrodearray. Efter tilsætning af vand til fugtighedsrummet og udskiftning af låget, inkuberes ved 37 grader Celsius i mindst to timer op til natten over.På pletteringsdagen, efter skylning af motorneuroner og astrocytkulturer en gang med PBS, tilsættes 0,05% trypsin og inkuberes ved 37 grader Celsius i ca. fem minutter for at løfte celler. Saml celler i et 15 ml konisk rør indeholdende trypsinhæmmer. Og vask plader med medium eller base for at sikre, at alle cellerne opsamles.Pellet ned cellerne ved centrificering. Og derefter ved hjælp af en 1000 mikroliter pipette, resuspenderes motorneuroner og astrocytter med et co-kulturmedium indeholdende 20 mikromolær ROCK-hæmmer for at generere en milliliter af en enkeltcellesuspension. Brug et hæmocytometer til at tælle motorneuronerne og astrocytterne.Og mens du tæller, holdt cellesuspensionerne og placerede dem i et styrofoamstativ ved fire grader Celsius. Der centrifugeres en milliliter af begge cellesuspensioner ved 300 gange G i fem minutter. Beregn det ønskede volumen og resuspender pellets.Kombiner det krævede volumen neuron- og astrocytsuspensioner i lige store forhold, og bland forsigtigt ved pipettering to gange for at kombinere grundigt. Fjern derefter laminin fra hver brønd på pladen og overfør 10 mikroliter af den endelige kombinerede cellesuspension til hver brønd og danner en lille dråbe, der dækker elektrodearrayet. Inkuber pladerne med en uforstyrret celledråbe ved 37 grader Celsius i 20 til 30 minutter for at danne indledende vedhæftede filer på pladerne.Derefter pipetteres 250 mikroliter varmt samkulturmedie indeholdende ROCK-hæmmer ned på væggen i hvert hul og pipetteres det samme volumen på den modsatte væg af hver brønd og inkuberer pladen ved 37 grader Celsius i 24 til 36 timer. Den næste dag skal du undersøge pladerne for snavs eller døde celler. Og om nødvendigt udskiftes mediet med et frisk co-kulturmedium indeholdende ROCK-hæmmer.Ellers skal du udføre halvmellemstore udvekslinger to gange om ugen ved hjælp af et co-kulturmedium uden en ROCK-hæmmer, der starter på co-kultur dag to. For at udføre optagelse skal du starte så hurtigt som muligt efter co-kultur dag et ved at indstille temperaturen til 37 grader Celsius og kuldioxid til 5%Overfør derefter pladerne til optagemaskinen og ekvilibrer i mindst fem minutter før optagelse. Optag baseline-aktivitet hver anden dag eller ugentligt over et til 15 minutter afhængigt af det eksperimentelle design.For at undersøge de forbigående elektrofysiologiske virkninger af forbindelser, der er rettet mod enten neuroner eller astrocytter, skal du fjerne pladelåget, men holde maskinens låg lukket og registrere baselineaktivitet i mindst et minut. Åbn maskinlåget manuelt uden at stoppe den elektrofysiologiske optagelse, og udskift 25 mikroliter medium med det relevante lægemiddelkøretøj. Luk derefter låget manuelt, og optag om nødvendigt i yderligere minutter.På samme måde skal du teste stoffet af interesse. I denne protokol blev hiPSC'er opretholdt og passeret som ikke-sammenflydende kolonier. Neurogenese blev initieret gennem dobbelt MAD-hæmning ved at inaktivere BMP- og TGF-beta-veje.De resulterende neuroepitelstamceller delte sig og genererede et flerlags epitel. Den tidlige eksponering for neuronale vækstfaktorer og en gliogen ciliær neurotrofisk faktor genererede en blandet population af stamceller. Neuroner opstod spontant fra denne blandede befolkning.Den gliogene switch inducerede astrocytdifferentiering gennem aktivering af JAK-STAT-vejen. Rygmarvsidentiteten af hakinhibitorbehandlede og differentierede motorneuronceller blev understøttet af høje cholinacetyltransferaseekspressionsniveauer. På den 90. dag efter in vitro-kultur viste humane iPSC-astrocytter modningsfænotype som angivet ved S100 beta- og GFAP-ekspression, mens deres rygmarvsregionale identitet tidligere blev understøttet af udtryk for høge.Co-dyrkede celler omarrangeret spontant med astrocytter, der skaber et fodringslag i bunden og neuroner, der forbinder netværk øverst. Neuroner aggregeret i store celleklynger, når de dyrkes alene, mens co-kulturen af humane iPSC-motorneuroner med humane iPSC-astrocytter resulterede i jævnt fordelte monolag. Humane iPSC-astrocytter forbedrede den elektrofysiologiske modning af humane iPSC-motorneuroner, som vist ved højere grader af spiking og sprængningsaktivitet i co-kulturerne.Det er vores erfaring, at stamcellekulturen og den tidlige NPC-differentiering er de sværeste og mest følsomme over for tekniske fejl. På dette stadium må teknikkerne ikke udføres med konsistens og nøjagtighed med ringe margen til fejlfinding. De samkulturteknikker, der er beskrevet her, kan også bruges i andre celletypespecifikke modeller.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv derivering af humane Neuronal progenitorer og neuroner fra Pluripotente humane embryonale stamceller med småmolekyle Induktion

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Specifikationen af ​​Telencephalic glutamaterge neuroner fra humane pluripotente stamceller

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Instrueret Dopaminerg Neuron Differentiering fra menneskelige pluripotente stamceller

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellering Zika Virus infektion i udviklingslandene menneskelige hjerne In Vitro ved hjælp af stamceller afledt Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Metode for høj hastighed Stretch skade af menneskelig induceret pluripotente stamceller-afledt neuroner i en 96-brønds Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Opdeling af humane stamcelle-afledte neuroner inden for præ-monterede plastik Microfluidic chips

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Post-differentiering Replating af humane pluripotente stamcelle-afledte neuroner for højt indhold screening af Neuritogenesis og synapse modning

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Omdannelse af humane induceret pluripotente stamceller (iPSCs) til funktionel spinal og kraniel motor neuroner brug PiggyBac vektorer

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Migration, Chemo-Attraction, og Co-Kultur Assays for Human Stem Cell-Afledt endotelceller og GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analyse mitokondriel transport og morfologi i Human Induceret pluripotente stamceller-afledte neuroner i arvelige spastiske paraplegi

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...