Name: establishment of an electrophysiological platform for modeling als with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons
Uploaded: 2021-08-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons at JoVE

Dit manuscript werd ondersteund door het volgende: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH / NINDS (CWH), 2020 Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Career Development Award (CWH). 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). We bedanken Dr. Raha Dastgheyb en Dr. Norman Haughey voor het leveren van het MEA-platform en de data-analysesoftware die we hebben gebruikt om het beschreven elektrofysiologische platform te valideren. We willen Khalil Rust bedanken voor hun hulp bij protocoldemonstraties en filmen.

1. Celkweek media voorbereiding
<ol><li>Bereid de afzonderlijke celkweekmedia voor met behulp van de in tabel 1 vermelde samenstellingen.</li>
	<li>Meng en steriel filter de media in gefilterde flessen van 500 ml en bewaar beschermd tegen licht bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken.</li>
</ol>2. Onderhoud en passaging van niet-confluente door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC)
<ol><li>Ontdooi de keldermembraanmatrix (bewaard in aliquots bij -80 °C) in een ko...

<ol>
	<li>Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review:+Induced+pluripotent+stem+cells+and+the+search+for+new+cell-specific+ALS+therapeutic+targets.">Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets.</a> Neuroscience Letters. 755, 135911 (2021).</li><li>Taga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+spinal+cord+astrocytes+in+the+functional+maturation+of+motor+neurons+in+a+multi-electrode+array+system.">Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system.</a> Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).</li><li>Klapper, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+lineage+cells+are+essential+for+functional+neuronal+differentiation+and+synapse+maturation+in+human+iPSC-derived+neural+networks.">Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks.</a> Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+C9orf72+human+iPSC-derived+astrocytes+cause+non-cell+autonomous+motor+neuron+pathophysiology.">Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology.</a> Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).</li><li>Almad, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+43+in+astrocytes+contributes+to+motor+neuron+toxicity+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).</li><li>Wainger, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+membrane+hyperexcitability+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+patient-derived+motor+neurons.">Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons.</a> Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).</li><li>Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+astrocytes:+Specification+and+relevance+for+neurological+disorders.">Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders.</a> Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).</li><li>Imaizumi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+regional+identity+of+hPSC-derived+neurons+to+uncover+neuronal+subtype+specificity+of+neurological+disease+phenotypes.">Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).</li><li>Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+evaluation+of+convulsant+and+anticonvulsant+drugs+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cortical+neuronal+networks+using+an+MEA+system.">Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10416 (2018).</li><li>Haidet-Phillips, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+profiling+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+astrocyte+progenitors+following+spinal+cord+engraftment.">Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment.</a> Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).</li><li>Roybon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+spinal+cord+astrocytes+with+defined+mature+or+reactive+phenotypes.">Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes.</a> Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).</li><li>Shimojo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=simple+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells.">simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).</li><li>Chandrasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+2D+and+3D+neural+induction+methods+for+the+generation+of+neural+progenitor+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).</li><li>Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+transplantable+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+sonic+hedgehog+and+Wnt+signaling+determines+ventral+and+dorsal+telencephalic+neuron+types+from+human+embryonic+stem+cells.">Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells.</a> Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).</li><li>Liu, H., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+neuronal+and+glial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).</li><li>Borghese, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+notch+signaling+in+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+stem+cells+delays+G1/S+phase+transition+and+accelerates+neuronal+differentiation+in+vitro+and+in+vivo.">Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo.</a> Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cerebral+cortex+development+from+pluripotent+stem+cells+to+functional+excitatory+synapses.">Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses.</a> Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).</li></ol>

Tot op heden hebben hiPSC- en MEA-gebaseerde methoden voor elektrofysiologische opnames van astrocyten-neuron co-culturen een beperkte toepassing gevonden op het gebied van ALS6 en nog steeds niet in volledig menselijke platforms, in tegenstelling tot hun meer wijdverspreide gebruik voor in vitro modellering van epilepsie9. Dit platform heeft echter het potentieel om pathofysiologisch relevante vragen in ALS-onderzoek aan te pakken, zoals de mechanismen van neurona...

Menselijke pluripotente stamcel-afgeleide astrocyten (hiPSC-A) en neuronen (hiPSC-N) zijn krachtige hulpmiddelen voor het modelleren van Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS) pathofysiologie in vitro en bieden een translationeel paradigma voor strategieën voor het ontdekken van geneesmiddelen1. Onderzoekers hebben aangetoond dat de co-cultuur van hiPSC-A met hiPSC-N de morfologische, moleculaire, elektrofysiologische en farmacologische rijping van beide celtypen verbetert, waardoor complexe neuronale netwerken en astrocyten-neuroninteracties worden gegenereerd die lijken op hun in vivo tegenhangers 2,3. Vergelijkbare co-kweekexperimenten kunnen kenmerken van ALS-pathobiologie samenvatten, zoals astrocytengemedieerde neurotoxiciteit 4,5 en neuronale hyper-exciteerbaarheid6. Bovendien, met vooruitgang in differentiatieprotocollen, kunnen door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) worden gedifferentieerd in regionaal specifieke neurale subtypen, waaronder corticale en ruggenmerg hiPSC-A en hiPSC-N 7,8. Deze strategieën bieden het potentieel voor het modelleren van corticale en spinale motorneuronpathologie bij ALS, evenals de astrocytische invloed op beide. Dit vereist echter dat er een reproduceerbare functionele test is om deze effecten te bepalen.
Onlangs werd aangetoond dat multi-elektrode array (MEA) opname bijzonder geschikt is voor de elektrofysiologische karakterisering van neuron-astrocyten co-culturen2. In tegenstelling tot eencellige elektrofysiologische analyses, registreren deze elektrode-arrays met hoge dichtheid passief extracellulaire veldpotentialen van grote populaties neuronen zonder de kweekomstandigheden te verstoren en de integriteit van celmembranen te behouden. Deze platforms zijn vooral nuttig voor het registreren van de cellulaire en netwerkactiviteit van culturen in de loop van de tijd en als reactie op farmacologische manipulatie. Ten slotte, wanneer de aanwezigheid van astrocyten een cultuurvariabele is, kunnen MEA-opnames functionele inzichten bieden in bidirectionele interacties tussen astrocyten en neuronen 2,9.
Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor de differentiatie van hiPSC in ruggenmerg hiPSC-A en hiPSC-motorneuronen (MN) dat eerder is gevalideerd2. Het hiPSC-A-differentiatieprotocol van het ruggenmerg resulteert consequent in astrocytenculturen, die positief zijn voor S100 calciumbindend eiwit B (S100β), gliaal fibrillair zuur eiwit (GFAP) en Homeobox B4 (HOXB4) in respectievelijk maximaal 80%, 50% en 90% van de cellen, wat wijst op een rijpende gliale en ruggenmergspecificatie 2,10 . Het hiPSC-MN differentiatieprotocol genereert neuronen die >90% positief zijn voor choline-acetyltransferase (ChAT), wat wijst op een volwassen alfa-motorneuronidentiteit2. Daarnaast beschrijft het protocol technieken voor het genereren van hiPSC-A/MN co-culturen waarvan eerder is aangetoond dat ze resulteren in neuronen met verbeterde morfologische complexiteit door Scholl-analyse en immunofluorescente microscopie in vergelijking met neuronale culturen zonder astrocyten of met knaagdierastrocyten2. Hoewel deze beschrijvingen specifiek zijn voor het ruggenmerg hiPSC-A en hiPSC-N, is een uniek voordeel dat de initiële onafhankelijke cultuur van astrocyten en neuronen gevolgd door stappen om op latere tijdstippen te co-kweken, kan worden vertaald om de effecten van neuron-astrocyteninteracties uit andere specifieke regio's en ziektespecifieke cellen te bestuderen 7,8 . Ten slotte beschrijft het protocol hoe deze culturen op MEA-platen kunnen worden gekweekt, zodat functionele activiteit als een factor van co-cultuursamenstelling in de loop van de tijd kan worden bestudeerd met het vermogen om de cellulaire samenstelling en kweekomstandigheden te manipuleren.
Het doel van deze protocollen is om een functionele test te bieden om astrocyten-neuron interacties te onderzoeken, ziektespecifieke veranderingen te onderzoeken en geneesmiddelen met therapeutisch potentieel op het gebied van ALS te testen. Video-instructies zijn voorzien voor de meest uitdagende stappen van dit protocol.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm sterile culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 sterile culture flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Working concentration 110 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL 0.2 &#181;m CA Filter System</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well sterile culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericine B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td>Working concentration 2.0 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anionic detergent with protease enzyme - Terg-A-Zyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273287</td>
			<td>Working concentration 1% m/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid (ASAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 &#181;m filter, aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 &#181;g/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W)</td>
			<td>Axion</td>
			<td>OPT-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axion Edge MEA platform</td>
			<td>Axion</td>
			<td>Maestro Edge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane matrix - Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Details in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microscope (sterile under cell culture hood)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415510-1100-000</td>
			<td>Primo Vert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicuculline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>14340</td>
			<td>Working concentration10 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciliary neurotrophic factor (CNTF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-13</td>
			<td>Dissolve 100 &#181;g in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tanks and regulator for Axion Edge</td>
			<td>AirGas/Harris</td>
			<td>9296NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound E</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab142164</td>
			<td>Dissolve 250 &#181;g in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 &#181;M stock. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanquixaline&#160; (CNQX)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C239</td>
			<td>Working concentration 50 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydrokainic acid (DHK)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>111</td>
			<td>Working concentration 50 &#956;M and 300 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>113300</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>Combine 10 mL of Essential 8 (10x)&#160; supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Dissolve 100 &#181;g in 1mL of PBS to 100 &#181;g/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Election Microscopy Sciences</td>
			<td>63510-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Millipore-sigma</td>
			<td>H3149-100KU</td>
			<td>Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 &#181;L tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 &#181;g/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity controlled Cell culture incubator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>370</td>
			<td>set to 37 &#186;C, 5 % CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-like growth factor 1 (IGF-1)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>291-G1-200</td>
			<td>Dissolve 200 &#181;g in 2 mL of PBS to 100 &#181;g/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 &#181;g/mL stock and store at -80 &#186;C. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 10 &#181;g/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kainc acid</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab144490</td>
			<td>Working concentration 5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10828</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 &#181;g/mL (coating), 1 &#181;g/mL (cell media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td>Dissolve 2 mg of LDN into 500 &#181;L of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 &#186;C. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 &#181;M working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25030</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA glass plates</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td>60MEA200/30iR-Ti-gr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipet P200</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>PJ22224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td>Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 &#181;L tubes. (working concentration 100 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Working concentration100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (PMN)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>540223</td>
			<td>Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 &#181;g in 1 mL of PBS to 100 &#181;g/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 &#181;L/tube and freeze at -80 &#186;C. Take 200 &#181;L of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 &#181;L/tube&#160;and store at -80 &#186;C. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK-I nhibitor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>1293823</td>
			<td>Dissolve 5 mg in 1480 &#181;L of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4317</td>
			<td>Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell culture hoods</td>
			<td>Baker Company</td>
			<td>SG-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement B - B27 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Working concentration 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement N - N2 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top cell culture centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75004261</td>
			<td>Sorvall Legend X1R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoplastic&#160;film - Parafilm</td>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue dissociation protease - Dispase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522-1G</td>
			<td>Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 &#186;C. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>2530054</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>2332</td>
			<td>Isotemp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of an electrophysiological platform for modeling als with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons

Menselijke pluripotente stamcel-afgeleide astrocyten (hiPSC-A) en neuronen (hiPSC-N) bieden een krachtig hulpmiddel voor het modelleren van Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS) pathofysiologie in vitro. Multi-electrode array (MEA) opnames zijn een middel om elektrische veldpotentialen van grote populaties neuronen vast te leggen en netwerkactiviteit in de loop van de tijd te analyseren. Eerder werd aangetoond dat de aanwezigheid van hiPSC-A die worden gedifferentieerd met behulp van technieken om een ruggenmerg astrocytenfenotype te bevorderen, de rijping en elektrofysiologische activiteit van regionaal specifieke hiPSC-motorneuronen (MN) van het ruggenmerg verbeterde in vergelijking met die gekweekt zonder hiPSC-A of in de aanwezigheid van knaagdierastrocyten. Hier beschreven is een methode om ruggenmerg hiPSC-A te co-kweken met hiPSC-MN en elektrofysiologische activiteit te registreren met behulp van MEA-opnames. Hoewel de hier beschreven differentiatieprotocollen specifiek zijn voor astrocyten en neuronen die regionaal specifiek zijn voor het ruggenmerg, kan het co-kweekplatform worden toegepast op astrocyten en neuronen die zijn gedifferentieerd met technieken die specifiek zijn voor andere lotgevallen, waaronder corticale hiPSC-A en hiPSC-N. Deze protocollen hebben tot doel een elektrofysiologische test te bieden om te informeren over interacties tussen glia en neuronen en een platform te bieden voor het testen van geneesmiddelen met therapeutisch potentieel bij ALS.

Het ruggenmergpatroonprotocol voor het genereren van hiPSC-MN en ruggenmerg hiPSC-A is beschreven in figuur 1. In dit protocol worden hiPSC's onderhouden en doorgegeven als niet-confluente kolonies (figuur 2A). Neurogenese wordt geïnitieerd (neurale inductie) door dubbele SMAD-remming door de toevoeging van LDN193189 en SB431542, waarbij respectievelijk het botmorfogenetische eiwit (BMP) en de transformerende groeifactor-bèta (TGF-β) -routes worden geïnactiv...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons at JoVE

Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons

We beschrijven een methode voor het differentiëren van door het ruggenmerg geïnduceerde pluripotent-afgeleide astrocyten en neuronen en hun co-cultuur voor elektrofysiologische registratie.

Oprichting van een elektrofysiologisch platform voor het modelleren van ALS met regionaal specifieke menselijke pluripotente stamcel-afgeleide astrocyten en neuronen

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) ...

De techniek die we vandaag presenteren, maakt de analyse van de activiteit van ruggenmergneuronen mogelijk als gevolg van intrinsieke neuronale factor en de invloed van omringende astrocyten. Deze techniek genereert op betrouwbare wijze zowel menselijke neuronen als menselijke astrocyten die specifiek zijn voor het ruggenmerg en maakt gebruik van een functionele outputmaat die kan worden geschaald voor reproduceerbaarheid. De techniek die we presenteren maakt het mogelijk om spinale neuronen specifieke ziekten zoals amyotrofische laterale sclerose te onderzoeken, met behulp van neuronen van patiënten met sporadische of genetische ziekte.Onderzoek om te beginnen de menselijke iPSC-platen op voldoende dichte kolonies, zodat het centrum van de kolonies verspreide witte gebieden vertoont. Om vervolgens te beginnen met het verpakken van de cellen, tekent u rasterlijnen op het onderste buitenoppervlak van de platen met een marker om een nauwkeurige dekking van de hele plaat te vergemakkelijken. Gebruik een fasecontrastmicroscoop van 10x vergroting in een cultuur om gedifferentieerde kolonies los te maken door handmatig te schrapen met een pipetpunt van 200 microliter.Spoel vervolgens de platen twee keer af met PBS. En voeg vervolgens vijf milliliter weefseldissociatieprotease toe, voorverwarmd bij 37 graden Celsius. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius gedurende vier tot zeven minuten totdat de randen van de kolonies naar boven beginnen te ronden, voordat je kolonies van de plaat optilt.Zuig de dissociatieprotease voorzichtig op en spoel de plaat twee keer voorzichtig af met PBS zonder de kolonies te ontwrichten. Voeg vijf milliliter voorverwarmd menselijk iPSC-medium toe aan de kweekplaat. Kras vervolgens de hele plaat met een punt van een pipet van vijf milliliter met behulp van een heen en weer beweging van boven naar beneden en til de kolonies op terwijl ze worden opgesplitst in kleinere celaggregaten.Voor differentiatie van menselijke iPSC in neurale voorlopercellen. Zodra menselijke iPSC een monolaag vormt en 90% confluent wordt, begint u met differentiatie zoals beschreven in het manuscript. Op de 12e dag, na trypsinebehandeling, als de cellen niet in suspensie zijn, worden cellen mechanisch losgemaakt door neuraal inductiemedium uit een 1000 microliter pipetpunt op de cellen te werpen met een cirkelvormige beweging om het hele oppervlak te bedekken.Als de neurale voorlopercelculturen bevroren waren, ontdooi ze dan. Na mediumuitwisseling en PBS-spoeling zoals beschreven in het manuscript, verander het medium met een motorneurondifferentiatiemedium dat 0,02 micromolaire cytosine arabinoside bevat en incubeer vervolgens de cellen gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide wanneer glial committed voorlopers verschijnen als enkele prolifererende platte cellen onder post-mitotische motorneuronvoorlopercellen, geaggregeerd in celclusters. Later, uitgevoerd medium uitwisseling zoals aangegeven in het manuscript.Begin op de dag van het plateren of ervoor met het coaten van de 24 MEA-platen door plo eerst in water of PBS te verdunnen. Voeg vervolgens 15 tot 20 microliter PLO toe aan elke put en vorm een druppel in het midden van de put, die het elektrodegebied bedekt en ervoor zorgt dat elektroden niet worden beschadigd met de pipetpunt. Voeg water toe aan de compartimenten rondom putten en zorg voor voldoende vochtigheid.En incubeer PLO bij 37 graden Celsius gedurende één tot twee uur. Gebruik vervolgens een plastic micropipetpunt om zoveel mogelijk PLO te zuigen zonder de elektroden aan te raken. Was vervolgens de put drie keer met 250 microliter water.Verwijder met een pipetpunt zoveel mogelijk water en laat het oppervlak drogen met het deksel verwijderd. Voeg vervolgens 15 tot 20 microliter verdund laminine toe om elke elektrode-array te bedekken. Na het toevoegen van water aan de vochtigheidscompartimenten en het vervangen van het deksel, incubeer je bij 37 graden Celsius gedurende minimaal twee uur tot een nacht.Voeg op de dag van plating, na het eenmaal spoelen van de motorneuronen en astrocytenculturen met PBS, 0,05% trypsine toe en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende ongeveer vijf minuten om cellen op te tillen. Verzamel cellen in een conische buis van 15 milliliter die trypsineremmer bevat. En was platen met medium of basis om ervoor te zorgen dat alle cellen worden verzameld.Pellet de cellen door middel van centrificatie. En dan met behulp van een pipet van 1000 microliter, resuspend motorneuronen en astrocyten met een co-kweekmedium dat 20 micromolaire ROCK-remmer bevat om één milliliter van een eencellige suspensie te genereren. Tel met behulp van een hemocytometer de motorneuronen en astrocyten.En tijdens het tellen, hield de cel suspensies en plaats ze in een piepschuimen rek op vier graden Celsius. Centrifugeer één milliliter van beide celsuspensies bij 300 maal G gedurende vijf minuten. Bereken het gewenste volume en resuspendeer de pellets.Combineer het vereiste volume neuron- en astrocytensuspensies in gelijke verhoudingen en meng voorzichtig door twee keer te pipetteren om grondig te combineren. Verwijder vervolgens laminine uit elke put van de plaat en breng 10 microliter van de uiteindelijke gecombineerde celsuspensie over naar elke put, waarbij een kleine druppel wordt gevormd die de elektrode-array bedekt. Incubeer de platen met een ongestoorde celdruppel bij 37 graden Celsius gedurende 20 tot 30 minuten om de eerste bevestigingen op de platen te vormen.Pipetteer vervolgens 250 microliter warme co-kweekmedia met ROCK-remmer op de wand van elke put en pipetteer hetzelfde volume op de tegenoverliggende wand van elke put en incubeer de plaat bij 37 graden Celsius gedurende 24 tot 36 uur. De volgende dag onderzoekt u de platen op puin of dode cellen. En vervang indien nodig het medium door een vers co-kweekmedium dat ROCK-remmer bevat.Voer anders twee keer per week halve mediumuitwisselingen uit met behulp van een co-kweekmedium zonder een ROCK-remmer vanaf co-kweekdag twee. Om de opname uit te voeren, begint u zo snel mogelijk na co-kweekdag één door de temperatuur in te stellen op 37 graden Celsius en koolstofdioxide op 5%Breng vervolgens platen over naar het opnameapparaat en balanceer gedurende ten minste vijf minuten voordat u opneemt. Registreer de basislijnactiviteit om de andere dag of wekelijks gedurende één tot 15 minuten, afhankelijk van het experimentele ontwerp.Om de voorbijgaande elektrofysiologische effecten van verbindingen gericht op neuronen of astrocyten te onderzoeken, verwijdert u het plaatdeksel, maar houdt u het machinedeksel gesloten en registreert u de basisactiviteit gedurende minimaal één minuut. Open het deksel van de machine handmatig zonder de elektrofysiologische opname te stoppen en wissel 25 microliter medium uit met het juiste geneesmiddelvoertuig. Sluit vervolgens het deksel handmatig en neem indien nodig extra minuten op.Test op dezelfde manier het medicijn van belang. In dit protocol werden hiPSC's gehandhaafd en doorgegeven als niet-confluente kolonies. Neurogenese werd geïnitieerd door dubbele SMAD-remming door BMP- en TGF-bètaroutes te inactiveren.De resulterende neuro-epitheelstamcellen deelden en genereerden een meerlagig epitheel. De vroege blootstelling aan neuronale groeifactoren en een gliogene ciliaire neurotrofe factor genereerde een gemengde populatie van voorlopercellen. Neuronen ontstonden spontaan uit deze gemengde populatie.De gliogene schakelaar induceerde astrocytendifferentiatie door activering van de JAK-STAT-route. De ruggenmergidentiteit van met notchremmers behandelde en gedifferentieerde motorneuroncellen werd ondersteund door hoge choline-acetyltransferase-expressieniveaus. Op de 90e dag na de in vitro kweek vertoonden menselijke iPSC-astrocyten een rijpend fenotype zoals aangegeven door S100-bèta en GFAP-expressie, terwijl hun regionale identiteit van het ruggenmerg eerder werd ondersteund door expressie van haviken.Co-gekweekte cellen herschikten spontaan met astrocyten die een voedingslaag aan de onderkant creëerden en neuronen die netwerken aan de bovenkant verbinden. Neuronen geaggregeerd in grote celclusters wanneer ze alleen worden gekweekt, terwijl de co-cultuur van menselijke iPSC-motorneuronen met menselijke iPSC-astrocyten resulteerde in gelijkmatig verdeelde monolagen. Menselijke iPSC-astrocyten verbeterden de elektrofysiologische rijping van menselijke iPSC-motorneuronen, zoals blijkt uit hogere graden van spiking en bursting-activiteit in de co-culturen.Onze ervaring is dat de stamcelkweek en vroege NPC-differentiatie het moeilijkst en gevoeligst zijn voor technische fouten. In dit stadium mogen de technieken niet worden uitgevoerd met consistentie en nauwkeurigheid met weinig marge voor het oplossen van problemen. De hier beschreven co-kweektechnieken kunnen ook in andere celtypespecifieke modellen worden gebruikt.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Efficiënte Afleiding van de Mens Neuronale voorouders en neuronen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

De Specificatie van Telencephalic glutamaat neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Geregisseerd Dopaminerge Neuron Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Zika Virus infectie van de ontwikkelende hersenen In Vitro met behulp van stamcel modellering afgeleid cerebrale Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Methode voor hoge snelheid Stretch letsel van mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige neuronen in een 96-Wells-indeling

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Compartimenlise ring van menselijke stamcel-afgeleide neuronen in voorgemonteerde kunststof Microfluïdische chips

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Na differentiatie Herbeplating van menselijke pluripotente stamcel afkomstige neuronen voor het screenen van hoge inhoud van Neuritogenese en Synapse rijping

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) in functionele spinale en craniale motor neuronen met behulp van PiggyBac vectoren

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Migratie, Chemo-Attraction, en Co-Culture Assays voor menselijke stamcel-afgeleide endotheelcellen en GABAergic Neuronen

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analyseren van mitochondrial transport en morfologie in de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen in erfelijke Spastische dwarslaesie

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...