Name: establishment of an electrophysiological platform for modeling als with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons
Uploaded: 2021-08-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons at JoVE

Questo manoscritto è stato supportato da quanto segue: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH / NINDS (CWH), 2020 Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Career Development Award (CWH). 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). Ringraziamo il Dr. Raha Dastgheyb e il Dr. Norman Haughey per aver fornito la piattaforma MEA e il software di analisi dei dati che abbiamo utilizzato per convalidare la piattaforma elettrofisiologica descritta. Vorremmo ringraziare Khalil Rust per la loro assistenza con la dimostrazione del protocollo e le riprese.

1. Preparazione dei terreni di coltura cellulare
<ol><li>Preparare i singoli terreni di coltura cellulare utilizzando le composizioni menzionate nella Tabella 1.</li>
	<li>Miscelare e sterilizzare il materiale filtrato in flaconi filtrati da 500 ml e conservare al riparo dalla luce a 4 °C per un massimo di 2 settimane.</li>
</ol>2. Mantenimento e passaggio delle cellule staminali pluripotenti indotte umane non confluenti (hiPSC)
<ol><li>Scongelare la matrice della membrana ba...

<ol>
	<li>Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review:+Induced+pluripotent+stem+cells+and+the+search+for+new+cell-specific+ALS+therapeutic+targets.">Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets.</a> Neuroscience Letters. 755, 135911 (2021).</li><li>Taga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+spinal+cord+astrocytes+in+the+functional+maturation+of+motor+neurons+in+a+multi-electrode+array+system.">Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system.</a> Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).</li><li>Klapper, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+lineage+cells+are+essential+for+functional+neuronal+differentiation+and+synapse+maturation+in+human+iPSC-derived+neural+networks.">Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks.</a> Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+C9orf72+human+iPSC-derived+astrocytes+cause+non-cell+autonomous+motor+neuron+pathophysiology.">Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology.</a> Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).</li><li>Almad, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+43+in+astrocytes+contributes+to+motor+neuron+toxicity+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).</li><li>Wainger, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+membrane+hyperexcitability+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+patient-derived+motor+neurons.">Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons.</a> Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).</li><li>Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+astrocytes:+Specification+and+relevance+for+neurological+disorders.">Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders.</a> Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).</li><li>Imaizumi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+regional+identity+of+hPSC-derived+neurons+to+uncover+neuronal+subtype+specificity+of+neurological+disease+phenotypes.">Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).</li><li>Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+evaluation+of+convulsant+and+anticonvulsant+drugs+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cortical+neuronal+networks+using+an+MEA+system.">Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10416 (2018).</li><li>Haidet-Phillips, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+profiling+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+astrocyte+progenitors+following+spinal+cord+engraftment.">Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment.</a> Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).</li><li>Roybon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+spinal+cord+astrocytes+with+defined+mature+or+reactive+phenotypes.">Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes.</a> Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).</li><li>Shimojo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=simple+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells.">simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).</li><li>Chandrasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+2D+and+3D+neural+induction+methods+for+the+generation+of+neural+progenitor+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).</li><li>Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+transplantable+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+sonic+hedgehog+and+Wnt+signaling+determines+ventral+and+dorsal+telencephalic+neuron+types+from+human+embryonic+stem+cells.">Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells.</a> Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).</li><li>Liu, H., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+neuronal+and+glial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).</li><li>Borghese, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+notch+signaling+in+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+stem+cells+delays+G1/S+phase+transition+and+accelerates+neuronal+differentiation+in+vitro+and+in+vivo.">Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo.</a> Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cerebral+cortex+development+from+pluripotent+stem+cells+to+functional+excitatory+synapses.">Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses.</a> Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).</li></ol>

Ad oggi, i metodi basati su hiPSC e MEA per le registrazioni elettrofisiologiche di co-colture astrocita-neurone hanno trovato un'applicazione limitata nel campo della SLA6 e ancora non in piattaforme completamente umane, in contrasto con il loro uso più diffuso per la modellazione in vitro dell'epilessia9. Questa piattaforma, tuttavia, ha il potenziale per affrontare questioni fisiopatologicamente rilevanti nella ricerca sulla SLA, come i meccanismi di ipereccita...

Gli astrociti derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hiPSC-A) e i neuroni (hiPSC-N) sono potenti strumenti per modellare la fisiopatologia della sclerosi laterale amiotrofica (SLA) in vitro e forniscono un paradigma traslazionale per le strategie di scoperta di farmaci1. I ricercatori hanno dimostrato che la co-coltura di hiPSC-A con hiPSC-N migliora la maturazione morfologica, molecolare, elettrofisiologica e farmacologica di entrambi i tipi di cellule, generando complesse reti neuronali e interazioni astrocita-neurone che assomigliano alle loro controparti in vivo 2,3. Simili esperimenti di co-coltura possono ricapitolare i segni distintivi della patobiologia della SLA come la neurotossicità mediata dagli astrociti 4,5 e l'ipereccitabilità neuronale6. Inoltre, con i progressi nei protocolli di differenziazione, le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) possono essere differenziate in sottotipi neurali specifici a livello regionale, tra cui hiPSC-A e hiPSC-N 7,8 del midollo spinale e corticale. Queste strategie forniscono il potenziale per modellare la patologia del motoneurone corticale e spinale nella SLA, nonché l'influenza astrocitaria su entrambi. Tuttavia, ciò richiede che esista un saggio funzionale riproducibile per determinare questi effetti.
Recentemente è stato dimostrato che la registrazione multi-electrode array (MEA) è particolarmente adatta per la caratterizzazione elettrofisiologica di co-colture neurone-astrocitario2. A differenza delle analisi elettrofisiologiche a singola cellula, questi array di elettrodi ad alta densità registrano passivamente i potenziali di campo extracellulare da grandi popolazioni di neuroni senza interrompere le condizioni di coltura e preservare l'integrità delle membrane cellulari. Queste piattaforme sono particolarmente utili per registrare l'attività cellulare e di rete delle colture nel tempo e in risposta alla manipolazione farmacologica. Infine, quando la presenza di astrociti è una variabile di coltura, le registrazioni MEA possono fornire informazioni funzionali sulle interazioni bidirezionali astrocita-neurone 2,9.
Presentato qui è un protocollo ottimizzato per la differenziazione di hiPSC in hiPSC-A del midollo spinale e hiPSC-motoneuroni (MN) che è stato precedentemente convalidato2. Il protocollo di differenziazione hiPSC-A del midollo spinale produce costantemente colture di astrociti, che sono positive per la proteina B legante il calcio S100 (S100β), la proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e l'omeobox B4 (HOXB4) fino all'80%, 50% e 90% delle cellule, rispettivamente, indicando una specifica della maturazione gliale e del midollo spinale 2,10 . Il protocollo di differenziazione hiPSC-MN genera neuroni che sono positivi al >90% per la colina acetiltransferasi (ChAT), suggerendo un'identità matura del neurone alfa-motorio2. Inoltre, il protocollo descrive le tecniche per la generazione di co-colture hiPSC-A/MN precedentemente dimostrate per produrre neuroni con maggiore complessità morfologica mediante analisi Scholl e microscopia immunofluorescente rispetto a colture neuronali senza astrociti o con astrociti roditori2. Mentre queste descrizioni sono specifiche per il midollo spinale hiPSC-A e hiPSC-N, un vantaggio unico è che la coltura indipendente iniziale di astrociti e neuroni seguita da passaggi di co-coltura in momenti successivi può essere tradotta per studiare gli effetti delle interazioni neurone-astrocita da altre regioni specifiche e cellule specifiche della malattia 7,8 . Infine, il protocollo descrive come coltivare queste colture su piastre MEA in modo che l'attività funzionale come fattore di composizione della co-coltura possa essere studiata nel tempo con la capacità di manipolare la composizione cellulare e le condizioni di coltura.
L'obiettivo di questi protocolli è quello di fornire un saggio funzionale per studiare le interazioni astrocita-neurone, esaminare i cambiamenti specifici della malattia e testare farmaci con potenziale terapeutico nel campo della SLA. Vengono fornite istruzioni video per i passaggi più impegnativi di questo protocollo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm sterile culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 sterile culture flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Working concentration 110 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL 0.2 &#181;m CA Filter System</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well sterile culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericine B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td>Working concentration 2.0 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anionic detergent with protease enzyme - Terg-A-Zyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273287</td>
			<td>Working concentration 1% m/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid (ASAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 &#181;m filter, aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 &#181;g/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W)</td>
			<td>Axion</td>
			<td>OPT-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axion Edge MEA platform</td>
			<td>Axion</td>
			<td>Maestro Edge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane matrix - Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Details in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microscope (sterile under cell culture hood)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415510-1100-000</td>
			<td>Primo Vert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicuculline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>14340</td>
			<td>Working concentration10 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciliary neurotrophic factor (CNTF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-13</td>
			<td>Dissolve 100 &#181;g in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tanks and regulator for Axion Edge</td>
			<td>AirGas/Harris</td>
			<td>9296NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound E</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab142164</td>
			<td>Dissolve 250 &#181;g in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 &#181;M stock. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanquixaline&#160; (CNQX)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C239</td>
			<td>Working concentration 50 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydrokainic acid (DHK)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>111</td>
			<td>Working concentration 50 &#956;M and 300 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>113300</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>Combine 10 mL of Essential 8 (10x)&#160; supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Dissolve 100 &#181;g in 1mL of PBS to 100 &#181;g/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Election Microscopy Sciences</td>
			<td>63510-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Millipore-sigma</td>
			<td>H3149-100KU</td>
			<td>Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 &#181;L tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 &#181;g/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity controlled Cell culture incubator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>370</td>
			<td>set to 37 &#186;C, 5 % CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-like growth factor 1 (IGF-1)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>291-G1-200</td>
			<td>Dissolve 200 &#181;g in 2 mL of PBS to 100 &#181;g/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 &#181;g/mL stock and store at -80 &#186;C. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 10 &#181;g/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kainc acid</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab144490</td>
			<td>Working concentration 5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10828</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 &#181;g/mL (coating), 1 &#181;g/mL (cell media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td>Dissolve 2 mg of LDN into 500 &#181;L of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 &#186;C. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 &#181;M working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25030</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA glass plates</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td>60MEA200/30iR-Ti-gr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipet P200</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>PJ22224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td>Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 &#181;L tubes. (working concentration 100 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Working concentration100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (PMN)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>540223</td>
			<td>Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 &#181;g in 1 mL of PBS to 100 &#181;g/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 &#181;L/tube and freeze at -80 &#186;C. Take 200 &#181;L of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 &#181;L/tube&#160;and store at -80 &#186;C. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK-I nhibitor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>1293823</td>
			<td>Dissolve 5 mg in 1480 &#181;L of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4317</td>
			<td>Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell culture hoods</td>
			<td>Baker Company</td>
			<td>SG-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement B - B27 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Working concentration 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement N - N2 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top cell culture centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75004261</td>
			<td>Sorvall Legend X1R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoplastic&#160;film - Parafilm</td>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue dissociation protease - Dispase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522-1G</td>
			<td>Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 &#186;C. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>2530054</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>2332</td>
			<td>Isotemp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of an electrophysiological platform for modeling als with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons

Gli astrociti derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hiPSC-A) e i neuroni (hiPSC-N) forniscono un potente strumento per modellare la fisiopatologia della sclerosi laterale amiotrofica (SLA) in vitro. Le registrazioni multi-electrode array (MEA) sono un mezzo per registrare i potenziali di campo elettrico da grandi popolazioni di neuroni e analizzare l'attività della rete nel tempo. È stato precedentemente dimostrato che la presenza di hiPSC-A che sono differenziati utilizzando tecniche per promuovere un fenotipo astrocitario del midollo spinale ha migliorato la maturazione e l'attività elettrofisiologica dei motoneuroni (MN) del midollo spinale specifici a livello regionale rispetto a quelli coltivati senza hiPSC-A o in presenza di astrociti roditori. Qui è descritto un metodo per co-coltivare il midollo spinale hiPSC-A con hiPSC-MN e registrare l'attività elettrofisiologica utilizzando registrazioni MEA. Mentre i protocolli di differenziazione qui descritti sono particolari per astrociti e neuroni che sono specifici a livello regionale per il midollo spinale, la piattaforma di co-coltura può essere applicata ad astrociti e neuroni differenziati con tecniche specifiche per altri destini, tra cui hiPSC-A corticale e hiPSC-N. Questi protocolli mirano a fornire un saggio elettrofisiologico per informare sulle interazioni glia-neurone e fornire una piattaforma per testare farmaci con potenziale terapeutico nella SLA.

Il protocollo di pattern del midollo spinale per la generazione di hiPSC-MN e hiPSC-A del midollo spinale è delineato nella Figura 1. In questo protocollo, le hiPSC sono mantenute e fatte passare come colonie non confluenti (Figura 2A). La neurogenesi viene iniziata (induzione neurale) attraverso la doppia inibizione della SMAD con l'aggiunta di LDN193189 e SB431542, inattivando rispettivamente la proteina morfogenetica ossea (BMP) e le vie del fattore di cresc...

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Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons

Descriviamo un metodo per differenziare astrociti e neuroni di derivazione pluripotente indotta dal midollo spinale e la loro co-coltura per la registrazione elettrofisiologica.

Creazione di una piattaforma elettrofisiologica per la modellazione della SLA con astrociti e neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti umane specifiche a livello regionale

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) ...

La tecnica che presentiamo oggi consente l'analisi dell'attività dei neuroni del midollo spinale come risultato del fattore neuronale intrinseco e dell'influenza degli astrociti circostanti. Questa tecnica genera in modo affidabile sia i neuroni umani che gli astrociti umani che sono specifici del midollo spinale e utilizza una misura di output funzionale che può essere scalata per la riproducibilità. La tecnica che presentiamo consente di studiare malattie specifiche dei neuroni del midollo spinale come la sclerosi laterale amiotrofica, utilizzando neuroni di pazienti con malattie sporadiche o genetiche.Per cominciare, esaminare le placche iPSC umane per colonie sufficientemente dense in modo tale che il centro delle colonie mostri aree bianche sparse. Quindi, per iniziare a confezionare le celle, disegna linee della griglia sulla superficie esterna inferiore delle piastre con un pennarello per facilitare una copertura accurata dell'intera piastra. Utilizzare un microscopio a contrasto di fase con ingrandimento 10x in una cappa di coltura per staccare le colonie differenziate raschiando manualmente con una punta di pipetta da 200 microlitri.Quindi, sciacquare le piastre due volte con PBS. E poi aggiungere cinque millilitri di proteasi di dissociazione tissutale preriscaldata a 37 gradi Celsius. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per quattro-sette minuti fino a quando i bordi delle colonie iniziano ad arrotondarsi, prima di sollevare le colonie dalla piastra.Aspirare con cura la proteasi di dissociazione e sciacquare delicatamente la piastra due volte con PBS senza rimuovere le colonie. Aggiungere cinque millilitri di terreno iPSC umano preriscaldato alla piastra di coltura. Quindi grattare l'intera piastra con una punta di una pipetta da cinque millilitri usando un movimento avanti e indietro dall'alto verso il basso e sollevare le colonie mentre le si rompe in aggregati cellulari più piccoli.Per la differenziazione di iPSC umane in cellule progenitrici neurali. Una volta che l'iPSC umana forma un monostrato e diventa confluente al 90%, inizia la differenziazione come descritto nel manoscritto. Il 12 ° giorno, dopo il trattamento con tripsina, se le cellule non sono in sospensione, le cellule si staccano meccanicamente espellendo il mezzo di induzione neurale da una punta di pipetta da 1000 microlitri sulle cellule con un movimento circolare per coprire l'intera superficie.Se le colture cellulari progenitrici neurali sono state congelate, scongelarle. Dopo lo scambio del mezzo e il risciacquo PBS come descritto nel manoscritto, cambiare il mezzo con un mezzo di differenziazione dei motoneuroni contenente 0,02 micromolari citosina arabinoside, quindi incubare le cellule per 48 ore a 37 gradi Celsius e 5% anidride carbonica quando i progenitori gliali impegnati emergono come singole cellule piatte proliferanti sotto progenitori post mitotici del motoneurone, aggregati in cluster di cellule. Successivamente, eseguito lo scambio di mezzo come indicato nel manoscritto.Il giorno della placcatura o prima, iniziare a rivestire le lastre MEA a 24 pozzetti diluendo prima PLO in acqua o PBS. Quindi aggiungere da 15 a 20 microlitri di PLO a ciascun pozzetto formando una goccia al centro del pozzetto, coprendo l'area dell'elettrodo assicurandosi di non danneggiare gli elettrodi con la punta della pipetta. Aggiungere acqua ai compartimenti che circondano i pozzi, garantendo un'umidità sufficiente.E incubare l'OLP a 37 gradi Celsius per una o due ore. Quindi, utilizzando una punta di micro pipetta di plastica, aspirare il più possibile PLO senza toccare gli elettrodi. Quindi, lavare il pozzo con 250 microlitri di acqua tre volte.Utilizzando una punta per pipetta, rimuovere quanta più acqua possibile e lasciare asciugare la superficie rimuovendo il coperchio. Quindi, aggiungere da 15 a 20 microlitri di laminina diluita per coprire ciascun array di elettrodi. Dopo aver aggiunto acqua ai compartimenti di umidità e sostituito il coperchio, incubare a 37 gradi Celsius per un minimo di due ore fino a tutta la notte.Il giorno della placcatura, dopo aver sciacquato i motoneuroni e le colture di astrociti una volta con PBS, aggiungere lo 0,05% di tripsina e incubare a 37 gradi Celsius per circa cinque minuti per sollevare le cellule. Raccogliere le cellule in un tubo conico da 15 millilitri contenente inibitore della tripsina. E lavare le piastre con mezzo o base per garantire che tutte le celle siano raccolte.Pellet lungo le cellule per centrificazione. E poi usando una pipetta da 1000 microlitri, risospendere i motoneuroni e gli astrociti con un mezzo di co-coltura contenente 20 micromolari di inibitore ROCK per generare un millilitro di una sospensione di una singola cellula. Utilizzando un emocitometro, contare i motoneuroni e gli astrociti.E mentre contava, teneva le sospensioni delle celle e le metteva in una griglia di polistirolo a quattro gradi Celsius. Centrifugare un millilitro di entrambe le sospensioni cellulari a 300 volte G per cinque minuti. Calcola il volume desiderato e risospendi il pellet.Combinare il volume richiesto di sospensioni di neuroni e astrociti in proporzioni uguali e mescolare delicatamente pipettando due volte per combinare accuratamente. Quindi rimuovere la laminina da ciascun pozzetto della piastra e trasferire 10 microlitri della sospensione cellulare combinata finale a ciascun pozzetto, formando una piccola goccia che copre l'array di elettrodi. Incubare le piastre con una goccia di cellula indisturbata a 37 gradi Celsius per 20-30 minuti per formare attacchi iniziali sulle piastre.Quindi pipettare 250 microlitri di terreni di co-coltura caldi contenenti inibitore ROCK sulla parete di ciascun pozzetto e pipettare lo stesso volume sulla parete opposta di ciascun pozzetto e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 24-36 ore. Il giorno dopo, esamina le piastre per detriti o cellule morte. E, se necessario, scambiare il terreno con un terreno di coltura fresco contenente inibitore ROCK.Altrimenti, eseguire scambi di mezzo mezzo due volte alla settimana utilizzando un terreno di co-coltura senza un inibitore ROCK a partire dal secondo giorno di co-coltura. Per eseguire la registrazione, iniziare il prima possibile dopo il primo giorno di co-coltura impostando la temperatura a 37 gradi Celsius e l'anidride carbonica al 5%, quindi trasferire le piastre alla macchina di registrazione ed equilibrare per almeno cinque minuti prima della registrazione. Registra l'attività di base a giorni alterni o settimanalmente da uno a 15 minuti a seconda del disegno sperimentale.Per studiare gli effetti elettrofisiologici transitori dei composti che colpiscono i neuroni o gli astrociti, rimuovere il coperchio della piastra ma tenere chiuso il coperchio della macchina e registrare l'attività basale per almeno un minuto. Aprire manualmente il coperchio della macchina senza interrompere la registrazione elettrofisiologica e scambiare 25 microlitri di mezzo con il veicolo farmacologico appropriato. Quindi chiudere manualmente il coperchio e registrare per ulteriori minuti, se necessario.Allo stesso modo, testare il farmaco di interesse. In questo protocollo, le hiPSC sono state mantenute e fatte passare come colonie non confluenti. La neurogenesi è stata iniziata attraverso la doppia inibizione della SMAD inattivando le vie BMP e TGF-beta.Le cellule staminali neuroepiteliali risultanti si sono divise e hanno generato un epitelio multistrato. L'esposizione precoce ai fattori di crescita neuronali e a un fattore neurotrofico ciliare gliogenico ha generato una popolazione mista di cellule progenitrici. I neuroni sono emersi spontaneamente da questa popolazione mista.Lo switch gliogenico ha indotto la differenziazione degli astrociti attraverso l'attivazione della via JAK-STAT. L'identità del midollo spinale delle cellule del motoneurone trattate con inibitori di notch e differenziate è stata supportata da alti livelli di espressione della colina acetiltransferasi. Il 90° giorno dopo la coltura in vitro, gli astrociti iPSC umani hanno mostrato un fenotipo maturo come indicato dall'espressione di S100 beta e GFAP, mentre la loro identità regionale del midollo spinale era supportata dall'espressione di falchi in precedenza.Le cellule co-coltivate si sono riorganizzate spontaneamente con gli astrociti creando uno strato di alimentazione nella parte inferiore e neuroni che collegano le reti nella parte superiore. I neuroni si sono aggregati in grandi gruppi di cellule quando coltivati da soli, mentre la co-coltura di motoneuroni iPSC umani con astrociti iPSC umani ha portato a monostrati uniformemente distribuiti. Gli astrociti iPSC umani hanno migliorato la maturazione elettrofisiologica dei motoneuroni iPSC umani, come dimostrato da gradi più elevati di attività di spiking e bursting nelle co-colture.Nella nostra esperienza, la coltura di cellule staminali e la differenziazione precoce degli NPC sono le più difficili e sensibili agli errori tecnici. In questa fase, le tecniche non devono essere eseguite con coerenza e accuratezza con poco margine per la risoluzione dei problemi. Le tecniche di co-coltura qui descritte possono essere utilizzate anche in altri modelli specifici di tipo cellulare.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivazione efficiente di progenitori neuronali umane e Neuroni pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Ricerca

Neuroscienze

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

La specifica di telencefalici neuroni glutamatergici di cellule staminali umane pluripotenti

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Regia neuroni dopaminergici differenziazione da cellule staminali pluripotenti umane

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellazione di infezione del Virus di Zika dello sviluppo del cervello umano In Vitro utilizzando cellule staminali derivate Organoids cerebrale

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Metodo per il pregiudizio elasticizzato ad alta velocità dell'essere umano ha indotto i neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti in un formato a 96 pozzetti

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Compartimentazione dei neuroni derivati da cellule staminali umane all'interno di chip microfluidici in plastica pre-assemblati

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Replatazione post-differenziazione dei neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti umane per lo screening ad alto contenuto di neuritogenesi e maturazione delle sinapsi

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (IPSC) in neuroni motore spinale e cranico funzionale utilizzando vettori PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Migrazione, chemio-attrazione, e analisi co-cultura per le cellule endoteliali derivate da cellule staminali umane e neuroni GABAergic

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analisi del trasporto mitocondriale e della morfologia nei neuroni derivati dalle cellule staminali indotte dall'uomo in paraplegia ereditaria

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...