Name: establishment of an electrophysiological platform for modeling als with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons
Uploaded: 2021-08-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons at JoVE

この原稿は、2019 MSCRFF 5119(AT)によってサポートされました。K08NS102526 NIH / NINDS(CWH)、2020年ドリスデューク慈善財団臨床科学者キャリア開発賞(CWH)。1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM).記載された電気生理学的プラットフォームを検証するために利用したMEAプラットフォームとデータ分析ソフトウェアを提供してくれたRaha Dastgheyb博士とNorman Haughey博士に感謝します。プロトコルのデモンストレーションと撮影に協力してくれたKhalil Rustに感謝します。

1. 細胞培養培地の調製
<ol><li>表1に記載されている組成物を使用して個々の細胞培養培地を調製します。</li>
	<li>500 mLのろ過ボトルに培地を混合して滅菌ろ過し、光から保護して4°Cで最大2週間保管します。</li>
</ol>2. 非コンフルエントヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)の維持・継代
<ol><li>基底膜マトリックス(-80°Cでアリコートで保存)を2〜8°Cの冷蔵庫で一晩解凍し?...

<ol>
	<li>Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review:+Induced+pluripotent+stem+cells+and+the+search+for+new+cell-specific+ALS+therapeutic+targets.">Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets.</a> Neuroscience Letters. 755, 135911 (2021).</li><li>Taga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+spinal+cord+astrocytes+in+the+functional+maturation+of+motor+neurons+in+a+multi-electrode+array+system.">Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system.</a> Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).</li><li>Klapper, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+lineage+cells+are+essential+for+functional+neuronal+differentiation+and+synapse+maturation+in+human+iPSC-derived+neural+networks.">Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks.</a> Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+C9orf72+human+iPSC-derived+astrocytes+cause+non-cell+autonomous+motor+neuron+pathophysiology.">Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology.</a> Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).</li><li>Almad, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+43+in+astrocytes+contributes+to+motor+neuron+toxicity+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).</li><li>Wainger, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+membrane+hyperexcitability+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+patient-derived+motor+neurons.">Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons.</a> Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).</li><li>Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+astrocytes:+Specification+and+relevance+for+neurological+disorders.">Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders.</a> Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).</li><li>Imaizumi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+regional+identity+of+hPSC-derived+neurons+to+uncover+neuronal+subtype+specificity+of+neurological+disease+phenotypes.">Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).</li><li>Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+evaluation+of+convulsant+and+anticonvulsant+drugs+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cortical+neuronal+networks+using+an+MEA+system.">Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10416 (2018).</li><li>Haidet-Phillips, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+profiling+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+astrocyte+progenitors+following+spinal+cord+engraftment.">Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment.</a> Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).</li><li>Roybon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+spinal+cord+astrocytes+with+defined+mature+or+reactive+phenotypes.">Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes.</a> Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).</li><li>Shimojo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=simple+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells.">simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).</li><li>Chandrasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+2D+and+3D+neural+induction+methods+for+the+generation+of+neural+progenitor+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).</li><li>Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+transplantable+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+sonic+hedgehog+and+Wnt+signaling+determines+ventral+and+dorsal+telencephalic+neuron+types+from+human+embryonic+stem+cells.">Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells.</a> Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).</li><li>Liu, H., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+neuronal+and+glial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).</li><li>Borghese, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+notch+signaling+in+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+stem+cells+delays+G1/S+phase+transition+and+accelerates+neuronal+differentiation+in+vitro+and+in+vivo.">Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo.</a> Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cerebral+cortex+development+from+pluripotent+stem+cells+to+functional+excitatory+synapses.">Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses.</a> Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).</li></ol>

今日まで、星状細胞とニューロンの共培養の電気生理学的記録のためのhiPSCおよびMEAベースの方法は、てんかん9のin vitroモデリングのためのより広範な使用とは対照的に、ALS6の分野では限られた用途であり、完全なヒトプラットフォームではまだ適用されていません。しかし、このプラットフォームは、ニューロンの過興奮性のメカニズム、神経毒?...

ヒト多能性幹細胞由来アストロサイト(hiPSC-A)およびニューロン(hiPSC-N)は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)の病態生理学をin vitroでモデル化するための強力なツールであり、創薬戦略のトランスレーショナルパラダイムを提供します1。研究者らは、hiPSC-AとhiPSC-Nの共培養が、両方の細胞タイプの形態学的、分子的、電気生理学的、および薬理学的成熟を促進し、複雑なニューロンネットワークと、in vivo対応物に似た星状細胞-ニューロン相互作用を生成することを実証しました2,3。同様の共培養実験は、星状細胞を介した神経毒性4,5やニューロンの過剰興奮性6などのALS病理生物学の特徴を再現することができます。さらに、分化プロトコルの進歩により、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)は、皮質および脊髄hiPSC-AおよびhiPSC-N 7,8を含む領域特異的な神経サブタイプに分化することができます。これらの戦略は、ALSにおける皮質および脊髄運動ニューロンの病理、ならびに両方に対する星状細胞の影響をモデル化する可能性を提供します。しかしながら、これには、これらの効果を決定するための再現可能な機能アッセイが存在することが必要である。
最近、多電極アレイ(MEA)記録がニューロン-アストロサイト共培養の電気生理学的特性評価に特に適していることが示されました2。シングルセル電気生理学的分析とは対照的に、これらの高密度電極アレイは、培養条件を破壊したり、細胞膜の完全性を維持したりすることなく、ニューロンの大規模な集団からの細胞外野電位を受動的に記録します。これらのプラットフォームは、経時的および薬理学的操作に応答して培養物の細胞およびネットワーク活性を記録するのに特に有用である。最後に、アストロサイトの存在が培養変数である場合、MEA記録はアストロサイト-ニューロンの双方向相互作用に関する機能的な洞察を提供することができます2,9。
ここで紹介するのは、以前に検証されたhiPSCを脊髄hiPSC-AおよびhiPSC運動ニューロン(MN)に分化させるための最適化されたプロトコルです2。脊髄hiPSC-A分化プロトコルは一貫して星状細胞培養をもたらし、S100カルシウム結合タンパク質B(S100β)、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、およびホメオボックスB4(HOXB4)に対して陽性であり、それぞれ最大80%、50%、および90%の細胞で陽性であり、成熟グリアおよび脊髄の仕様を示しています2,10.hiPSC-MN分化プロトコルは、コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)に対して>90%陽性のニューロンを生成し、成熟したα運動ニューロンの同一性を示唆しています2。さらに、このプロトコルでは、アストロサイトなしまたはげっ歯類のアストロサイトを使用したニューロン培養と比較した場合、ショール分析および免疫蛍光顕微鏡によって形態学的複雑さが増したニューロンをもたらすことが以前に実証されたhiPSC-A/MN共培養の生成技術について説明しています2。これらの説明は脊髄hiPSC-AおよびhiPSC-Nに固有ですが、ユニークな利点は、星状細胞とニューロンの最初の独立した培養とそれに続く後の時点での共培養のステップを翻訳して、他の特定の領域および疾患特異的細胞からのニューロン-アストロサイト相互作用の影響を研究できることです7,8.最後に、プロトコルは、細胞組成および培養条件を操作する能力を有する共培養組成物の因子としての機能的活性を経時的に研究できるように、MEAプレート上でこれらの培養物を増殖させる方法を記載している。
これらのプロトコルの目標は、星状細胞とニューロンの相互作用を調査し、疾患特異的な変化を調べ、ALSの分野で治療の可能性を秘めた薬物をテストするための機能アッセイを提供することです。このプロトコルの最も困難なステップについて、ビデオの説明が提供されています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm sterile culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 sterile culture flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Working concentration 110 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL 0.2 &#181;m CA Filter System</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well sterile culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericine B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td>Working concentration 2.0 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anionic detergent with protease enzyme - Terg-A-Zyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273287</td>
			<td>Working concentration 1% m/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid (ASAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 &#181;m filter, aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 &#181;g/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W)</td>
			<td>Axion</td>
			<td>OPT-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axion Edge MEA platform</td>
			<td>Axion</td>
			<td>Maestro Edge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane matrix - Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Details in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microscope (sterile under cell culture hood)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415510-1100-000</td>
			<td>Primo Vert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicuculline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>14340</td>
			<td>Working concentration10 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciliary neurotrophic factor (CNTF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-13</td>
			<td>Dissolve 100 &#181;g in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tanks and regulator for Axion Edge</td>
			<td>AirGas/Harris</td>
			<td>9296NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound E</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab142164</td>
			<td>Dissolve 250 &#181;g in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 &#181;M stock. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanquixaline&#160; (CNQX)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C239</td>
			<td>Working concentration 50 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydrokainic acid (DHK)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>111</td>
			<td>Working concentration 50 &#956;M and 300 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>113300</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>Combine 10 mL of Essential 8 (10x)&#160; supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Dissolve 100 &#181;g in 1mL of PBS to 100 &#181;g/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Election Microscopy Sciences</td>
			<td>63510-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Millipore-sigma</td>
			<td>H3149-100KU</td>
			<td>Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 &#181;L tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 &#181;g/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity controlled Cell culture incubator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>370</td>
			<td>set to 37 &#186;C, 5 % CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-like growth factor 1 (IGF-1)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>291-G1-200</td>
			<td>Dissolve 200 &#181;g in 2 mL of PBS to 100 &#181;g/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 &#181;g/mL stock and store at -80 &#186;C. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 10 &#181;g/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kainc acid</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab144490</td>
			<td>Working concentration 5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10828</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 &#181;g/mL (coating), 1 &#181;g/mL (cell media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td>Dissolve 2 mg of LDN into 500 &#181;L of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 &#186;C. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 &#181;M working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25030</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA glass plates</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td>60MEA200/30iR-Ti-gr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipet P200</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>PJ22224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td>Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 &#181;L tubes. (working concentration 100 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Working concentration100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (PMN)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>540223</td>
			<td>Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 &#181;g in 1 mL of PBS to 100 &#181;g/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 &#181;L/tube and freeze at -80 &#186;C. Take 200 &#181;L of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 &#181;L/tube&#160;and store at -80 &#186;C. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK-I nhibitor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>1293823</td>
			<td>Dissolve 5 mg in 1480 &#181;L of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4317</td>
			<td>Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell culture hoods</td>
			<td>Baker Company</td>
			<td>SG-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement B - B27 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Working concentration 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement N - N2 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top cell culture centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75004261</td>
			<td>Sorvall Legend X1R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoplastic&#160;film - Parafilm</td>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue dissociation protease - Dispase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522-1G</td>
			<td>Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 &#186;C. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>2530054</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>2332</td>
			<td>Isotemp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of an electrophysiological platform for modeling als with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons

ヒト多能性幹細胞由来のアストロサイト(hiPSC-A)およびニューロン(hiPSC-N)は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)の病態生理学 をin vitroでモデル化するための強力なツールを提供します。多電極アレイ(MEA)記録は、ニューロンの大規模な集団からの電界ポテンシャルを記録し、時間の経過に伴うネットワーク活動を分析するための手段です。脊髄星状細胞の表現型を促進する技術を用いて分化したhiPSC-Aの存在は、hiPSC-Aなしまたはげっ歯類の星状細胞の存在下で培養されたものと比較して、領域特異的な脊髄hiPSC-運動ニューロン(MN)の成熟および電気生理学的活性を改善することが以前に実証されました。ここで説明するのは、脊髄hiPSC-AをhiPSC-MNと共培養し、MEA記録を用いて電気生理学的活性を記録する方法である。ここで説明する分化プロトコルは、脊髄に地域特異的な星状細胞およびニューロンに特異的であるが、共培養プラットフォームは、皮質hiPSC-AおよびhiPSC-Nを含む他の運命に特異的な技術で分化した星状細胞およびニューロンに適用することができる。これらのプロトコルは、グリアとニューロンの相互作用について知らせるための電気生理学的アッセイを提供し、ALSの治療の可能性を秘めた薬物をテストするためのプラットフォームを提供することを目的としています。

hiPSC-MNおよび脊髄hiPSC-Aを生成するための脊髄パターニングプロトコルを 図1に概説します。このプロトコルでは、hiPS細胞は非コンフルエントなコロニーとして維持され、継代されます(図2A)。神経新生は、LDN193189およびSB431542の添加による二重SMAD阻害によって開始され(神経誘導)、それぞれ骨形成タンパク質(BMP)およびトランスフォーミング成長因?...

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Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons

ヒト誘導多能性由来のアストロサイトとニューロンおよびそれらの共培養を電気生理学的記録のために脊髄に分化させる方法を記載する。

領域特異的ヒト多能性幹細胞由来アストロサイトおよびニューロンを用いたALSモデリングのための電気生理学的基盤の確立

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) ...

今日紹介する技術は、内因性の神経因子と周囲の星状細胞の影響の結果としての脊髄ニューロン活動の分析を可能にします。この技術は、脊髄特異的なヒトニューロンとヒトアストロサイトの両方を確実に生成し、再現性のためにスケーリングできる機能的出力測定値を使用します。本研究では、孤発性または遺伝性疾患の患者のニューロンを用いて、筋萎縮性側索硬化症などの脊髄ニューロン特異的疾患を調査することができます。まず、ヒトiPSプレートを調べて、コロニーの中心に白い領域が散在するように十分に密度の高いコロニーがないか調べます。次に、セルのパッケージングを開始するには、プレートの下部外面にマーカーを使用してグリッド線を描画し、プレート全体を正確にカバーできるようにします。培養液中で倍率10倍の位相差顕微鏡を使用し、200マイクロリットルのピペットチップで手動でこすり落とすことで分化したコロニーを剥離します。次に、プレートをPBSで2回すすぎます。次に、摂氏37度に予熱した5ミリリットルの組織解離プロテアーゼを加えます。プレートからコロニーを持ち上げる前に、コロニーの端が切り上げ始めるまで摂氏37度で細胞を4〜7分間インキュベートします。解離プロテアーゼを注意深く吸引し、コロニーを脱落させずにプレートをPBSで2回穏やかにすすぎます。培養プレートに5ミリリットルの予熱したヒトiPS細胞培地を加えます。次に、上から下に前後に動かして、5ミリリットルのピペットの先端でプレート全体を引っ掻き、コロニーをより小さな細胞凝集体に分割しながら持ち上げます。ヒトiPS細胞の神経前駆細胞への分化に。ヒトiPS細胞が単層を形成し、90%コンフルエントになったら、原稿に記載されているように分化を開始します。12日目に、トリプシン処理後、細胞が懸濁状態でない場合は、1000マイクロリットルのピペットチップから神経誘導培地を細胞上に円運動で吐出して細胞を機械的に剥離し、表面全体を覆う。神経前駆細胞培養物が凍結されている場合は、それらを解凍する。原稿に記載されている培地交換とPBSリンスの後、0.02マイクロモルのシトシンアラビノシドを含む運動ニューロン分化培地で培地を交換し、グリアコミット前駆細胞が有糸分裂後運動ニューロン前駆細胞の下で単一の増殖扁平細胞として出現したときに、摂氏37度と5%二酸化炭素で48時間細胞をインキュベートします。 セルクラスターに集約されます。その後、原稿に示されているように培地交換を行った。めっき当日またはそれ以前に、最初にPLOを水またはPBSで希釈することにより、24ウェルMEAプレートのコーティングを開始します。次に、各ウェルに15〜20マイクロリットルのPLOを加えてウェルの中央に液滴を形成し、ピペットチップで電極を損傷しないように電極領域を覆います。井戸を囲む区画に水を加え、十分な湿度を確保します。そして、PLOを摂氏37度で1〜2時間インキュベートします。次にプラスチック製のマイクロピペットチップを用いて、電極に触れずにできるだけ多くのPLOを吸引する。次に、井戸を250マイクロリットルの水で3回洗浄します。ピペットチップを使用して、できるだけ多くの水を取り除き、蓋を外した状態で表面を乾かします。次に、各電極アレイを覆うために15〜20マイクロリットルの希釈ラミニンを追加します。湿度コンパートメントに水を加えて蓋を交換した後、摂氏37度で最低2時間から一晩インキュベートします。プレーティング当日、運動ニューロンとアストロサイト培養物をPBSで1回すすいだ後、0.05%トリプシンを加え、摂氏37度で約5分間インキュベートして細胞を持ち上げます。トリプシン阻害剤を含む15ミリリットルの円錐管に細胞を収集します。そして、プレートを培地またはベースで洗浄して、すべての細胞が確実に収集されるようにします。遠心分離によって細胞をペレット化します。次いで、1000マイクロリットルのピペットを用いて、運動ニューロンおよびアストロサイトを20マイクロモルのROCK阻害剤を含む共培養培地で再懸濁し、1ミリリットルの単一細胞懸濁液を生成する。血球計算盤を使用して、運動ニューロンと星状細胞を数えます。そして数えながら、細胞懸濁液を保管し、摂氏4度の発泡スチロールラックに入れます。両方の細胞懸濁液1ミリリットルを300倍Gで5分間遠心分離する。所望の体積を計算し、ペレットを再懸濁する。必要量のニューロンとアストロサイト懸濁液を等しい比率で混ぜ合わせ、2回ピペッティングして穏やかに混合して完全に混ぜ合わせます。次に、プレートの各ウェルからラミニンを除去し、10マイクロリットルの最終合わせ細胞懸濁液を各ウェルに移し、電極アレイを覆う小さな液滴を形成します。プレートを乱されていない細胞液滴で摂氏37度で20〜30分間インキュベートし、プレートに最初の付着物を形成します。次に、ROCK阻害剤を含む250マイクロリットルの温かい共培養培地を各ウェルの壁にピペットで置き、各ウェルの反対側の壁に同じ容量のピペットを置き、プレートを摂氏37度で24〜36時間インキュベートします。翌日、プレートに破片や死んだ細胞がないか調べます。そして必要に応じて、ROCK阻害剤を含む新鮮な共培養培地と培地を交換します。それ以外の場合は、共培養2日目からROCK阻害剤を含まない共培養培地を使用して、週に2回ハーフ培地交換を行います。記録を行うには、共培養初日からできるだけ早く温度を摂氏37度に設定し、二酸化炭素を5%に設定してからプレートを記録機に移し、少なくとも5分間平衡化してから記録します。実験デザインに応じて、ベースラインアクティビティを隔日または毎週1〜15分記録します。ニューロンまたはアストロサイトを標的とする化合物の一時的な電気生理学的影響を調べるには、プレートの蓋を取り外しますが、機械の蓋を閉じたままにして、ベースライン活動を最低1分間記録します。電気生理学的記録を停止せずに機械の蓋を手動で開き、25マイクロリットルの培地を適切な薬剤ビヒクルと交換します。次に、蓋を手動で閉じ、必要に応じてさらに数分間記録します。同様に、目的の薬をテストします。このプロトコルでは、hiPS細胞は非コンフルエントなコロニーとして維持および継代されました。神経新生は、BMPおよびTGF-β経路を不活性化することによる二重SMAD阻害によって開始された。得られた神経上皮幹細胞が分裂し、多層上皮を生成した。神経細胞成長因子とグリオジェニック毛様体神経栄養因子への早期曝露は、前駆細胞の混合集団を生成した。ニューロンは、この混合集団から自発的に出現した。グリオジェニックスイッチは、JAK-STAT経路の活性化を通じて星状細胞の分化を誘導しました。ノッチ阻害剤で処理され分化した運動ニューロン細胞の脊髄同一性は、高いコリンアセチルトランスフェラーゼ発現レベルによって支持された。in vitro培養後90日目に、ヒトiPS細胞アストロサイトはS100ベータおよびGFAP発現によって示される成熟表現型を示し、それらの脊髄局所同一性は以前のタカの発現によって支持された。共培養された細胞は、アストロサイトが下部に摂食層を形成し、上部にネットワークを接続するニューロンと自発的に再配列しました。ニューロンは、単独で培養すると大きな細胞クラスターに凝集し、ヒトiPS運動ニューロンとヒトiPS細胞アストロサイトの共培養では、単層が均一に分布しました。ヒトiPS細胞アストロサイトは、共培養におけるより高い程度のスパイクおよびバースト活性によって示されるように、ヒトiPS細胞運動ニューロンの電気生理学的成熟を増強した。私たちの経験では、幹細胞培養と早期NPC分化は最も困難であり、技術的エラーに敏感です。この段階では、トラブルシューティングの余地がほとんどなく、一貫性と精度で手法を実行してはなりません。ここで説明する共培養技術は、他の細胞型特異的モデルでも同様に使用することができる。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞から終脳のグルタミン酸作動性ニューロンの仕様

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞からドーパミン作動性ニューロンの分化を監督

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

脳オルガノイドを派生開発人間の脳の培養幹細胞を使用してジカ ウイルス感染症をモデル化

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

人間の高速ストレッチ損傷法による 96 ウェル形式で多能性幹細胞由来神経細胞

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

組み立て済みプラスチックマイクロ流体チップ内のヒト幹細胞由来ニューロンの区分化

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

ニューウトジェネシスとシナプス成熟の高含有量スクリーニングに対するヒト多能性幹細胞由来ニューロンの分化後再形成

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

PiggyBac ベクターを用いたヒト誘導多能性幹細胞 (iPSCs) の機能的脊髄および頭蓋運動ニューロンへの変換

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

ヒト幹細胞由来内皮細胞およびGABAergicニューロンの移動、化学誘引、共培養アッセイ

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

遺伝性痙性対麻痺におけるヒト人工多能性幹細胞由来ニューロンにおけるミトコンドリア輸送と形態学の解析

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...