Name: establishment of an electrophysiological platform for modeling als with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons
Uploaded: 2021-08-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons at JoVE

이 원고는 2019 MSCRFF 5119 (AT)에 의해 지원되었습니다. K08NS102526 NIH / NINDS (CWH), 2020 도리스 듀크 자선 재단 임상 과학자 경력 개발 상 (CWH). 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). 설명된 전기생리학적 플랫폼을 검증하는 데 활용한 MEA 플랫폼 및 데이터 분석 소프트웨어를 제공한 Raha Dastgheyb 박사와 Norman Haughey 박사에게 감사드립니다. 프로토콜 시연 및 촬영에 도움을 주신 Khalil Rust에게 감사드립니다.

1. 세포 배양 배지 준비
<ol><li>표 1에 언급된 조성물을 사용하여 개별 세포 배양 배지를 준비한다.</li>
	<li>여과된 500mL 병에 배지를 혼합 및 멸균 여과하고 4°C에서 최대 2주 동안 빛으로부터 보호하여 보관합니다.</li>
</ol>2. 비 합류 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)의 유지 및 계대 배양
<ol><li>기저막 매트릭스(-80°C에서 분취량으로 보관)를 2-8°C 냉장고에서 밤새 해동...

<ol>
	<li>Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review:+Induced+pluripotent+stem+cells+and+the+search+for+new+cell-specific+ALS+therapeutic+targets.">Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets.</a> Neuroscience Letters. 755, 135911 (2021).</li><li>Taga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+spinal+cord+astrocytes+in+the+functional+maturation+of+motor+neurons+in+a+multi-electrode+array+system.">Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system.</a> Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).</li><li>Klapper, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+lineage+cells+are+essential+for+functional+neuronal+differentiation+and+synapse+maturation+in+human+iPSC-derived+neural+networks.">Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks.</a> Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+C9orf72+human+iPSC-derived+astrocytes+cause+non-cell+autonomous+motor+neuron+pathophysiology.">Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology.</a> Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).</li><li>Almad, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+43+in+astrocytes+contributes+to+motor+neuron+toxicity+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).</li><li>Wainger, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+membrane+hyperexcitability+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+patient-derived+motor+neurons.">Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons.</a> Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).</li><li>Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+astrocytes:+Specification+and+relevance+for+neurological+disorders.">Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders.</a> Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).</li><li>Imaizumi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+regional+identity+of+hPSC-derived+neurons+to+uncover+neuronal+subtype+specificity+of+neurological+disease+phenotypes.">Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).</li><li>Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+evaluation+of+convulsant+and+anticonvulsant+drugs+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cortical+neuronal+networks+using+an+MEA+system.">Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10416 (2018).</li><li>Haidet-Phillips, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+profiling+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+astrocyte+progenitors+following+spinal+cord+engraftment.">Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment.</a> Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).</li><li>Roybon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+spinal+cord+astrocytes+with+defined+mature+or+reactive+phenotypes.">Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes.</a> Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).</li><li>Shimojo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=simple+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells.">simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).</li><li>Chandrasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+2D+and+3D+neural+induction+methods+for+the+generation+of+neural+progenitor+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).</li><li>Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+transplantable+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+sonic+hedgehog+and+Wnt+signaling+determines+ventral+and+dorsal+telencephalic+neuron+types+from+human+embryonic+stem+cells.">Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells.</a> Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).</li><li>Liu, H., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+neuronal+and+glial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).</li><li>Borghese, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+notch+signaling+in+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+stem+cells+delays+G1/S+phase+transition+and+accelerates+neuronal+differentiation+in+vitro+and+in+vivo.">Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo.</a> Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cerebral+cortex+development+from+pluripotent+stem+cells+to+functional+excitatory+synapses.">Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses.</a> Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).</li></ol>

현재까지, 성상 세포-뉴런 공동 배양의 전기생리학적 기록을 위한 hiPSC- 및 MEA-기반 방법은 간질9의 시험관 내 모델링에 대한 보다 광범위한 사용과 대조적으로, ALS6 분야에서 제한적인 적용을 발견하였으며, 여전히 완전한 인간 플랫폼에서는 그렇지 않다. 그러나 이 플랫폼은 신경 과흥분성의 메커니즘, 신경독성에 대한 성상세포의 기여 또는 질병 진행?...

인간 만능줄기세포 유래 성상교세포(hiPSC-A) 및 뉴런(hiPSC-N)은 시험관 내에서 근위축성 측삭 경화증(ALS) 병태생리학을 모델링하기 위한 강력한 도구이며 약물발견 전략을 위한 번역 패러다임을 제공합니다1. 연구자들은 hiPSC-A와 hiPSC-N의 공동 배양이 두 세포 유형의 형태학적, 분자적, 전기생리학적 및 약리학적 성숙을 향상시켜 복잡한 뉴런 네트워크와 생체 내 대응물과 유사한 성상세포-뉴런 상호작용을 생성한다는 것을 입증했습니다2,3. 유사한 공동 배양 실험은 성상 세포 매개 신경 독성 4,5 및 신경 과흥분성6과 같은 ALS 병리학의 특징을 요약할 수 있습니다. 또한 분화 프로토콜의 발전으로 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)는 피질 및 척수 hiPSC-A 및 hiPSC-N 7,8을 포함한 지역 별 신경 아형으로 분화 될 수 있습니다. 이러한 전략은 ALS에서 피질 및 척추 운동 뉴런 병리를 모델링 할 수있는 잠재력을 제공 할뿐만 아니라 성상 세포 영향 모두에 대한 성상 세포 영향을 제공합니다. 그러나 이를 위해서는 이러한 효과를 결정하기 위한 재현 가능한 기능 분석이 필요합니다.
최근에는 다중 전극 어레이 (MEA) 기록이 뉴런-성상 세포 공동 배양의 전기 생리 학적 특성화에 특히 적합하다는 것이 밝혀졌습니다2. 단일 세포 전기생리학적 분석과 달리 이러한 고밀도 전극 어레이는 배양 조건을 방해하고 세포막의 무결성을 보존하지 않고 대규모 뉴런 집단의 세포외 전위를 수동적으로 기록합니다. 이러한 플랫폼은 시간이 지남에 따라 그리고 약리학적 조작에 대한 반응으로 배양물의 세포 및 네트워크 활동을 기록하는 데 특히 유용합니다. 마지막으로, 성상 세포의 존재가 배양 변수 인 경우 MEA 기록은 성상 세포-뉴런 양방향 상호 작용에 대한 기능적 통찰력을 제공 할 수 있습니다 2,9.
여기에 제시된 것은 hiPSC를 척수 hiPSC-A 및 hiPSC- 운동 뉴런 (MN)으로 분화하기위한 최적화 된 프로토콜입니다 이전에 검증 된2. 척수 hiPSC-A 분화 프로토콜은 각각 세포의 최대 80%, 50% 및 90%에서 S100 칼슘 결합 단백질 B(S100β), 신경교섬유소 산성 단백질(GFAP) 및 호메오박스 B4(HOXB4)에 대해 양성인 성상세포 배양을 일관되게 초래하여 성숙 신경교 및 척수 사양 2,10을 나타냅니다. . hiPSC-MN 분화 프로토콜은 콜린 아세틸 트랜스퍼 라제 (ChAT)에 대해 >90 % 양성인 뉴런을 생성하며, 이는 성숙한 알파 운동 뉴런 정체성2을 암시합니다. 또한, 이 프로토콜은 성상세포가 없거나 설치류 성상세포2가 있는 뉴런 배양과 비교할 때 Scholl 분석 및 면역형광 현미경에 의해 향상된 형태학적 복잡성을 갖는 뉴런을 생성하는 것으로 이전에 입증된 hiPSC-A/MN 공동 배양의 생성 기술을설명합니다. 이러한 설명은 척수 hiPSC-A 및 hiPSC-N에 특이적이지만, 독특한 이점은 성상 세포와 뉴런의 초기 독립 배양에 이어 이후 시점에서 공동 배양하는 단계가 다른 특정 영역뿐만 아니라 질병 특이 적 세포로부터의 뉴런-성상 세포 상호 작용의 효과를 연구하도록 번역 될 수 있다는 것입니다 7,8 . 마지막으로, 프로토콜은 MEA 플레이트에서 이러한 배양을 성장시키는 방법을 설명하여 공동 배양 조성물의 인자로서의 기능적 활성이 세포 조성 및 배양 조건을 조작하는 능력으로 시간이 지남에 따라 연구될 수 있도록 합니다.
이러한 프로토콜의 목표는 성상 세포-뉴런 상호 작용을 조사하고, 질병 특이적 변화를 조사하고, ALS 분야에서 치료 가능성이 있는 약물을 테스트하기 위한 기능 분석을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜의 가장 어려운 단계에 대한 비디오 지침이 제공됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm sterile culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 sterile culture flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Working concentration 110 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL 0.2 &#181;m CA Filter System</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well sterile culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericine B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td>Working concentration 2.0 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anionic detergent with protease enzyme - Terg-A-Zyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273287</td>
			<td>Working concentration 1% m/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid (ASAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 &#181;m filter, aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 &#181;g/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W)</td>
			<td>Axion</td>
			<td>OPT-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axion Edge MEA platform</td>
			<td>Axion</td>
			<td>Maestro Edge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane matrix - Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Details in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microscope (sterile under cell culture hood)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415510-1100-000</td>
			<td>Primo Vert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicuculline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>14340</td>
			<td>Working concentration10 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciliary neurotrophic factor (CNTF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-13</td>
			<td>Dissolve 100 &#181;g in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tanks and regulator for Axion Edge</td>
			<td>AirGas/Harris</td>
			<td>9296NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound E</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab142164</td>
			<td>Dissolve 250 &#181;g in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 &#181;M stock. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanquixaline&#160; (CNQX)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C239</td>
			<td>Working concentration 50 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydrokainic acid (DHK)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>111</td>
			<td>Working concentration 50 &#956;M and 300 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>113300</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>Combine 10 mL of Essential 8 (10x)&#160; supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Dissolve 100 &#181;g in 1mL of PBS to 100 &#181;g/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Election Microscopy Sciences</td>
			<td>63510-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Millipore-sigma</td>
			<td>H3149-100KU</td>
			<td>Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 &#181;L tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 &#181;g/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity controlled Cell culture incubator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>370</td>
			<td>set to 37 &#186;C, 5 % CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-like growth factor 1 (IGF-1)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>291-G1-200</td>
			<td>Dissolve 200 &#181;g in 2 mL of PBS to 100 &#181;g/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 &#181;g/mL stock and store at -80 &#186;C. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 10 &#181;g/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kainc acid</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab144490</td>
			<td>Working concentration 5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10828</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 &#181;g/mL (coating), 1 &#181;g/mL (cell media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td>Dissolve 2 mg of LDN into 500 &#181;L of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 &#186;C. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 &#181;M working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25030</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA glass plates</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td>60MEA200/30iR-Ti-gr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipet P200</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>PJ22224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td>Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 &#181;L tubes. (working concentration 100 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Working concentration100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (PMN)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>540223</td>
			<td>Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 &#181;g in 1 mL of PBS to 100 &#181;g/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 &#181;L/tube and freeze at -80 &#186;C. Take 200 &#181;L of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 &#181;L/tube&#160;and store at -80 &#186;C. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK-I nhibitor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>1293823</td>
			<td>Dissolve 5 mg in 1480 &#181;L of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4317</td>
			<td>Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell culture hoods</td>
			<td>Baker Company</td>
			<td>SG-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement B - B27 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Working concentration 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement N - N2 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top cell culture centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75004261</td>
			<td>Sorvall Legend X1R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoplastic&#160;film - Parafilm</td>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue dissociation protease - Dispase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522-1G</td>
			<td>Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 &#186;C. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>2530054</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>2332</td>
			<td>Isotemp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of an electrophysiological platform for modeling als with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons

인간 만능 줄기세포 유래 성상세포(hiPSC-A) 및 뉴런(hiPSC-N)은 시험관 내에서 근위축성 측삭 경화증(ALS) 병태생리학을 모델링하기 위한 강력한 도구를 제공합니다. 다중 전극 어레이(MEA) 기록은 대규모 뉴런 집단의 전기장 전위를 기록하고 시간 경과에 따른 네트워크 활동을 분석하는 수단입니다. 척수 성상 세포 표현형을 촉진하는 기술을 사용하여 분화되는 hiPSC-A의 존재가 hiPSC-A없이 배양되거나 설치류 성상 세포가있는 상태에서 배양 된 것과 비교할 때 국소 특이 적 척수 hiPSC- 운동 뉴런 (MN)의 성숙 및 전기 생리 학적 활성을 향상 시킨다는 것이 이전에 입증되었습니다. 여기에 설명된 것은 척수 hiPSC-A를 hiPSC-MN과 공동 배양하고 MEA 기록을 사용하여 전기생리학적 활성을 기록하는 방법입니다. 여기에 설명된 분화 프로토콜은 척수에 지역적으로 특이적인 성상세포 및 뉴런에 특화된 반면, 공동 배양 플랫폼은 피질 hiPSC-A 및 hiPSC-N을 포함한 다른 운명에 특정한 기술로 분화된 성상세포 및 뉴런에 적용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 신경교-뉴런 상호 작용에 대해 알리고 ALS에서 치료 가능성이 있는 약물을 테스트하기 위한 플랫폼을 제공하기 위한 전기생리학적 분석을 제공하는 것을 목표로 합니다.

hiPSC-MN 및 척수 hiPSC-A의 생성을 위한 척수 패터닝 프로토콜은 그림 1에 요약되어 있습니다. 이 프로토콜에서 hiPSC는 비 합류 콜로니로 유지되고 계대됩니다 (그림 2A). 신경 발생은 LDN193189 및 SB431542의 첨가에 의한 이중 SMAD 억제를 통해 개시 (신경 유도)되며, 각각 골 형태 형성 단백질 (BMP) 및 형질 전환 성장 인자 베타 (TGF-β) 경로를 비활성화합니다. 이 단...

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Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons

우리는 척수 인간 유도 만능 유래 성상 세포와 뉴런을 구별하는 방법과 전기 생리 학적 기록을위한 이들의 공동 배양을 설명합니다.

지역별 인간 만능줄기세포 유래 성상세포 및 뉴런을 이용한 ALS 모델링을 위한 전기생리학적 플랫폼 구축

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) ...

오늘 우리가 제시하는 기술은 내재적 신경 요인과 주변 성상 세포의 영향으로 인한 척수 뉴런 활동의 분석을 허용합니다. 이 기술은 척수에 특정한 인간 뉴런과 인간 성상 세포를 모두 안정적으로 생성하고 재현성을 위해 확장 할 수있는 기능적 출력 측정을 사용합니다. 우리가 제시하는 기술은 산발적 또는 유전 질환 환자의 뉴런을 사용하여 근 위축성 측삭 경화증과 같은 척수 뉴런 특정 질병을 조사 할 수있게합니다.우선, 콜로니의 중앙에 흩어져있는 흰색 영역이 표시되도록 충분히 조밀 한 콜로니에 대한 인간 iPSC 플레이트를 검사하십시오. 그런 다음 셀 포장을 시작하려면 마커로 플레이트의 하단 외부 표면에 격자 선을 그려 전체 플레이트를 정확하게 덮을 수 있습니다. 배양 후드에서 10배 배율의 위상차 현미경을 사용하여 200마이크로리터 피펫 팁으로 수동으로 긁어 분화된 콜로니를 분리합니다.다음으로 플레이트를 PBS로 두 번 헹굽니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 예열 된 5 밀리리터의 조직 해리 프로테아제를 첨가하십시오. 플레이트에서 콜로니를 들어 올리기 전에 콜로니의 가장자리가 둥글게 시작될 때까지 섭씨 37도에서 4-7 분 동안 세포를 배양합니다.해리 프로테아제를 조심스럽게 흡인하고 콜로니를 제거하지 않고 PBS로 플레이트를 두 번 부드럽게 헹굽니다. 5 밀리리터의 사전 예열 된 인간 iPSC 배지를 배양 플레이트에 첨가하십시오. 그런 다음 위에서 아래로 앞뒤로 움직여 5 밀리리터 피펫 끝으로 전체 플레이트를 긁고 콜로니를 들어 올리면서 더 작은 세포 응집체로 분해합니다.인간 iPSC를 신경 전구 세포로 분화합니다. 인간 iPSC가 단층을 형성하고 90% 합류하면 원고에 설명된 대로 분화를 시작합니다. 12일째, 트립신 처리 후, 세포가 현탁 상태에 있지 않은 경우, 1000 마이크로리터 피펫 팁에서 신경 유도 배지를 세포 전체에 원을 그리며 분출하여 전체 표면을 덮음으로써 기계적으로 세포를 분리합니다.신경 전구 세포 배양 물이 동결되면 해동하십시오. 원고에 기재된 배지 교환 및 PBS 헹굼 후, 배지를 0.02 마이크로몰 시토신 아라비노사이드를 함유하는 운동 뉴런 분화 배지로 변경한 다음, 신경교세포 커밋 전구세포가 유사분열 후 운동 뉴런 전구체 하에서 단일 증식 편평한 세포로 나타날 때 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 48시간 동안 세포를 배양하고, 셀 클러스터에서 집계됩니다. 나중에 원고에 표시된대로 중간 교환을 수행했습니다.도금 당일 또는 그 전, 먼저 PLO를 물 또는 PBS에 희석하여 24웰 MEA 플레이트의 코팅을 시작합니다. 그런 다음 각 웰에 15-20 마이크로 리터의 PLO를 추가하여 웰 중앙에 액적을 형성하고 전극 영역을 덮어 피펫 팁으로 전극이 손상되지 않도록합니다. 우물 주변의 구획에 물을 추가하여 충분한 습도를 확보하십시오.그리고 PLO를 섭씨 37도에서 1 내지 2시간 동안 배양한다. 그런 다음 플라스틱 마이크로 피펫 팁을 사용하여 전극을 만지지 않고 가능한 한 많은 PLO를 흡인합니다. 다음으로 250 마이크로 리터의 물로 우물을 세 번 씻으십시오.피펫 팁을 사용하여 가능한 한 많은 물을 제거하고 뚜껑을 제거한 상태에서 표면을 건조시킵니다. 다음으로, 15 내지 20 마이크로리터의 희석된 라미닌을 첨가하여 각각의 전극 어레이를 덮는다. 습도 구획에 물을 추가하고 뚜껑을 교체 한 후 섭씨 37도에서 최소 2 시간에서 밤새 배양하십시오.도말 당일, 운동뉴런과 성상세포 배양액을 PBS로 한 번 헹군 후 0.05%트립신을 첨가하고 섭씨 37도에서 약 5분간 배양하여 세포를 들어 올립니다. 트립신 억제제가 들어있는 15 밀리리터 원추형 튜브에 세포를 모으십시오. 그리고 모든 세포가 수집되도록 매체 또는 베이스로 플레이트를 세척합니다.중심화에 의해 세포를 펠릿 다운합니다. 그런 다음 1000 마이크로리터 피펫을 사용하여 20마이크로몰의 ROCK 억제제가 포함된 공동 배양 배지로 운동 뉴런과 성상세포를 재현탁하여 1밀리리터의 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 혈구계를 사용하여 운동 뉴런과 성상 세포를 세십시오.그리고 세는 동안, 세포 현탁액을 유지하고 섭씨 4도의 스티로폼 랙에 넣었다. 두 세포 현탁액 1 밀리리터를 300 배 G에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 원하는 부피를 계산하고 펠릿을 다시 현탁하십시오.필요한 양의 뉴런과 성상 세포 현탁액을 같은 비율로 결합하고 피펫팅으로 부드럽게 두 번 혼합하여 완전히 결합합니다. 그런 다음 플레이트의 각 웰에서 라미닌을 제거하고 10 마이크로 리터의 최종 결합 셀 현탁액을 각 웰로 옮겨 전극 어레이를 덮는 작은 액적을 형성합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 방해받지 않은 세포 방울과 함께 20 내지 30분 동안 배양하여 플레이트 상에 초기 부착물을 형성한다.이어서 ROCK 억제제를 함유하는 250 마이크로리터의 따뜻한 공동 배양 배지를 각 웰의 벽에 내려놓고 각 웰의 반대쪽 벽에 동일한 부피를 피펫팅하고 플레이트를 섭씨 37도에서 24 내지 36시간 동안 인큐베이션한다. 다음날, 판에 파편이나 죽은 세포가 있는지 검사하십시오. 필요한 경우, 배지를 ROCK 억제제를 함유하는 새로운 공동 배양 배지로 교환한다.그렇지 않으면 공동 배양 둘째 날부터 ROCK 억제제가 없는 공동 배양 배지를 사용하여 일주일에 두 번 반배지 교환을 수행합니다. 녹음을 수행하려면 공동 배양 첫날 온도를 섭씨 37도, 이산화탄소를 5%로 설정하여 가능한 한 빨리 시작한 다음 플레이트를 녹음기로 옮기고 녹음하기 전에 최소 5분 동안 평형을 이룹니다. 실험 설계에 따라 격일로 또는 매주 1-15분에 걸쳐 기준 활동을 기록합니다.뉴런이나 성상 세포를 표적으로 하는 화합물의 일시적인 전기생리학적 효과를 조사하려면 플레이트 뚜껑을 제거하되 기계 뚜껑을 닫은 상태로 유지하고 최소 1분 동안 기준 활동을 기록하십시오. 전기 생리 학적 기록을 중단하지 않고 수동으로 기계 뚜껑을 열고 25 마이크로 리터의 배지를 적절한 약물 운반체와 교환하십시오. 그런 다음 수동으로 뚜껑을 닫고 필요한 경우 추가 분 동안 녹음하십시오.마찬가지로 관심있는 약물을 테스트하십시오. 이 프로토콜에서 hiPSC는 비 합류 콜로니로 유지되고 계대되었습니다. 신경 발생은 BMP 및 TGF- 베타 경로를 비활성화함으로써 이중 SMAD 억제를 통해 시작되었습니다.그 결과 신경 상피 줄기 세포가 분열되어 다층 상피가 생성되었다. 신경 성장 인자와 신경신성 섬모 신경영양 인자에 대한 조기 노출은 전구 세포의 혼합 집단을 생성했습니다. 뉴런은이 혼합 된 집단에서 자발적으로 나타났습니다.교신성 스위치는 JAK-STAT 경로의 활성화를 통해 성상세포 분화를 유도했습니다. 노치 억제제 처리 및 분화된 운동 뉴런 세포의 척수 동일성은 높은 콜린 아세틸트랜스퍼라제 발현 수준에 의해 뒷받침되었습니다. 시험관 내 배양 후 90일째에 인간 iPSC 성상교세포는 S100 베타 및 GFAP 발현으로 표시된 성숙한 표현형을 나타냈으며, 척수 영역 정체성은 이전에 매의 발현에 의해 뒷받침되었습니다.공동 배양 된 세포는 성상 세포와 함께 자발적으로 재배열되어 하단에 공급 층을 생성하고 상단에 네트워크를 연결하는 뉴런을 만듭니다. 뉴런은 단독으로 배양할 때 큰 세포 클러스터로 응집되는 반면, 인간 iPSC 운동 뉴런과 인간 iPSC 성상세포의 공동 배양은 단층이 고르게 분포된 결과를 낳았습니다. 인간 iPSC 성상 세포는 공동 배양에서 더 높은 수준의 스파이크 및 파열 활동으로 나타난 바와 같이 인간 iPSC 운동 뉴런의 전기 생리 학적 성숙을 향상 시켰습니다.우리의 경험에 따르면 줄기 세포 배양과 초기 NPC 분화는 기술적 오류에 가장 어렵고 민감합니다. 이 단계에서는 문제 해결을 위한 여유가 거의 없이 일관되고 정확하게 기술을 수행해서는 안 됩니다. 여기에 설명된 공동배양 기술은 다른 세포 유형 특이적 모델에서도 사용될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

연구

신경과학

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

인간 만능의 줄기 세포에서 Telencephalic Glutamatergic 뉴런의 사양

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

인간의 다 능성 줄기 세포에서 도파민 신경 세포의 분화를 감독

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

대뇌 Organoids 파생 Zika 바이러스 감염 개발 인간의 두뇌에는 생체 외에서 줄기 세포를 사용 하 여 모델링

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

인간의 고속 스트레치 부상에 대 한 방법 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 96 잘 형식

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

사전 조립된 플라스틱 미세유체 칩 내에서 인간 줄기 세포 유래 뉴런의 구획화

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

신형성 및 시냅스 성숙의 고함량 스크리닝을 위한 인간 다능성 줄기 세포 유래 뉴런의 분화 후 리포팅

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

PiggyBac 벡터를 사용 하 여 기능적 척추 및 두개골 모터 뉴런으로의 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 전환

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

인간 줄기 세포 유래 내피 세포 및 GABAergic 뉴런에 대한 이동, 화학 적 매력 및 공동 배양 어세포

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

유전 경직 성 하반신 마비에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런에서 미토콘드리아 수송 및 형태 분석

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...