Name: establishment of an electrophysiological platform for modeling als with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons
Uploaded: 2021-08-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons at JoVE

Dette manuskriptet ble støttet av følgende: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH/NINDS (CWH), 2020 Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Career Development Award (CWH). 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). Vi takker Dr. Raha Dastgheyb og Dr. Norman Haughey for å gi MEA-plattformen og dataanalyseprogramvaren vi har brukt for å validere den beskrevne elektrofysiologiske plattformen. Vi vil takke Khalil Rust for deres hjelp med protokolldemonstrasjon og filming.

1. Forberedelse av cellekulturmedier
<ol><li>Forbered de enkelte cellekulturmediene ved hjelp av sammensetningene nevnt i tabell 1.</li>
	<li>Bland og steril filtrer mediet i 500 ml filtrerte flasker, og oppbevar beskyttet mot lys ved 4 °C i opptil 2 uker.</li>
</ol>2. Opprettholde og passere ikke-konfluerende humane induserte pluripotente stamceller (hiPSC)
<ol><li>Tine membranmatrisen i kjelleren (oppbevares i alikoter ved -80 °C) i et kjøleskap på 2-8 °C over natten.</...

<ol>
	<li>Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review:+Induced+pluripotent+stem+cells+and+the+search+for+new+cell-specific+ALS+therapeutic+targets.">Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets.</a> Neuroscience Letters. 755, 135911 (2021).</li><li>Taga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+spinal+cord+astrocytes+in+the+functional+maturation+of+motor+neurons+in+a+multi-electrode+array+system.">Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system.</a> Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).</li><li>Klapper, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+lineage+cells+are+essential+for+functional+neuronal+differentiation+and+synapse+maturation+in+human+iPSC-derived+neural+networks.">Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks.</a> Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+C9orf72+human+iPSC-derived+astrocytes+cause+non-cell+autonomous+motor+neuron+pathophysiology.">Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology.</a> Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).</li><li>Almad, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+43+in+astrocytes+contributes+to+motor+neuron+toxicity+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).</li><li>Wainger, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+membrane+hyperexcitability+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+patient-derived+motor+neurons.">Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons.</a> Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).</li><li>Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+astrocytes:+Specification+and+relevance+for+neurological+disorders.">Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders.</a> Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).</li><li>Imaizumi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+regional+identity+of+hPSC-derived+neurons+to+uncover+neuronal+subtype+specificity+of+neurological+disease+phenotypes.">Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).</li><li>Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+evaluation+of+convulsant+and+anticonvulsant+drugs+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cortical+neuronal+networks+using+an+MEA+system.">Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10416 (2018).</li><li>Haidet-Phillips, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+profiling+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+astrocyte+progenitors+following+spinal+cord+engraftment.">Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment.</a> Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).</li><li>Roybon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+spinal+cord+astrocytes+with+defined+mature+or+reactive+phenotypes.">Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes.</a> Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).</li><li>Shimojo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=simple+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells.">simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).</li><li>Chandrasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+2D+and+3D+neural+induction+methods+for+the+generation+of+neural+progenitor+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).</li><li>Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+transplantable+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+sonic+hedgehog+and+Wnt+signaling+determines+ventral+and+dorsal+telencephalic+neuron+types+from+human+embryonic+stem+cells.">Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells.</a> Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).</li><li>Liu, H., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+neuronal+and+glial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).</li><li>Borghese, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+notch+signaling+in+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+stem+cells+delays+G1/S+phase+transition+and+accelerates+neuronal+differentiation+in+vitro+and+in+vivo.">Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo.</a> Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cerebral+cortex+development+from+pluripotent+stem+cells+to+functional+excitatory+synapses.">Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses.</a> Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).</li></ol>

Hittil har hiPSC- og MEA-baserte metoder for elektrofysiologiske registreringer av astrocytt-nevron-kokulturer funnet begrenset anvendelse innen ALS6 og fortsatt ikke i fullt menneskelige plattformer, i motsetning til deres mer utbredte bruk for in vitro-modellering av epilepsi9. Denne plattformen har imidlertid potensial til å ta opp patofysiologisk relevante spørsmål i ALS-forskning, for eksempel mekanismene for nevronal hyperexcitability, astrocyttbidrag til ...

Humane pluripotente stamcelleavledede astrocytter (hiPSC-A) og nevroner (hiPSC-N) er kraftige verktøy for modellering av patofysiologi for amyotrofisk lateral sklerose (ALS) in vitro og gir et translasjonsparadigme for narkotikaoppdagelsesstrategier1. Forskere har vist at samkulturen til hiPSC-A med hiPSC-N forbedrer morfologisk, molekylær, elektrofysiologisk og farmakologisk modning av begge celletyper, og genererer komplekse nevronnettverk og astrocyt-neuron-interaksjoner som ligner deres in vivo kolleger 2,3. Lignende kokultureksperimenter kan rekapitulere kjennetegn ved ALS-patobiologi som astrocytmediert nevrotoksisitet 4,5 og nevronal hypereksitabilitet6. I tillegg, med fremskritt i differensieringsprotokoller, kan humane induserte pluripotente stamceller (hiPSC) differensieres i regionalt spesifikke nevrale subtyper, inkludert kortikale og ryggmargs hiPSC-A og hiPSC-N 7,8. Disse strategiene gir potensial for modellering av kortikal og spinal motor neuron patologi i ALS samt astrocytisk innflytelse på begge. Dette krever imidlertid at det finnes en reproduserbar funksjonsanalyse for å bestemme disse effektene.
Nylig ble det vist at multi-elektrode array (MEA) opptak er spesielt egnet for elektrofysiologisk karakterisering av nevron-astrocytt kokulturer2. I motsetning til encellede elektrofysiologiske analyser, registrerer disse elektroderadene med høy tetthet passivt ekstracellulære feltpotensialer fra store populasjoner av nevroner uten å forstyrre kulturforhold og bevare cellemembranens integritet. Disse plattformene er spesielt nyttige for registrering av cellulær og nettverksaktivitet av kulturer over tid og som svar på farmakologisk manipulasjon. Til slutt, når tilstedeværelsen av astrocytter er en kulturvariabel, kan MEA-opptak gi funksjonell innsikt i astrocytt-neuron toveis interaksjoner 2,9.
Presentert her er en optimalisert protokoll for differensiering av hiPSC i ryggmargen hiPSC-A og hiPSC-motor neurons (MN) som tidligere har blitt validert2. Ryggmargens hiPSC-A differensieringsprotokoll resulterer konsekvent i astrocyttkulturer, som er positive for S100 kalsiumbindende protein B (S100β), glialfibrillært surt protein (GFAP) og Homeobox B4 (HOXB4) i henholdsvis opptil 80%, 50% og 90% av cellene, noe som indikerer en moden glial- og ryggmargsspesifikasjon 2,10 . HiPSC-MN-differensieringsprotokollen genererer nevroner som er >90% positive for kolinacetyltransferase (ChAT), noe som tyder på en moden alfa-motorneuronidentitet2. I tillegg beskriver protokollen teknikker for generering av hiPSC-A/MN-kokulturer som tidligere er vist å resultere i nevroner med økt morfologisk kompleksitet ved Scholl-analyse og immunfluorescerende mikroskopi sammenlignet med nevronkulturer uten astrocytter eller med gnagerastrocytter2. Selv om disse beskrivelsene er spesifikke for ryggmargs hiPSC-A og hiPSC-N, er en unik fordel at den første uavhengige kulturen av astrocytter og nevroner etterfulgt av trinn til samkultur på senere tidspunkter kan oversettes for å studere effekten av nevron-astrocyttinteraksjoner fra andre spesifikke regioner så vel som sykdomsspesifikke celler 7,8 . Til slutt beskriver protokollen hvordan man kan dyrke disse kulturene på MEA-plater slik at funksjonell aktivitet som en faktor for samkultursammensetning kan studeres over tid med evnen til å manipulere cellulær sammensetning samt kulturforhold.
Målet med disse protokollene er å gi en funksjonell analyse for å undersøke astrocytt-neuron interaksjoner, undersøke sykdomsspesifikke endringer, og teste legemidler med terapeutisk potensial innen ALS. Videoinstruksjoner er gitt for de mest utfordrende trinnene i denne protokollen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm sterile culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 sterile culture flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Working concentration 110 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL 0.2 &#181;m CA Filter System</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well sterile culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericine B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td>Working concentration 2.0 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anionic detergent with protease enzyme - Terg-A-Zyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273287</td>
			<td>Working concentration 1% m/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid (ASAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 &#181;m filter, aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 &#181;g/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W)</td>
			<td>Axion</td>
			<td>OPT-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axion Edge MEA platform</td>
			<td>Axion</td>
			<td>Maestro Edge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane matrix - Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Details in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microscope (sterile under cell culture hood)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415510-1100-000</td>
			<td>Primo Vert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicuculline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>14340</td>
			<td>Working concentration10 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciliary neurotrophic factor (CNTF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-13</td>
			<td>Dissolve 100 &#181;g in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tanks and regulator for Axion Edge</td>
			<td>AirGas/Harris</td>
			<td>9296NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound E</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab142164</td>
			<td>Dissolve 250 &#181;g in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 &#181;M stock. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanquixaline&#160; (CNQX)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C239</td>
			<td>Working concentration 50 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydrokainic acid (DHK)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>111</td>
			<td>Working concentration 50 &#956;M and 300 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>113300</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>Combine 10 mL of Essential 8 (10x)&#160; supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Dissolve 100 &#181;g in 1mL of PBS to 100 &#181;g/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Election Microscopy Sciences</td>
			<td>63510-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Millipore-sigma</td>
			<td>H3149-100KU</td>
			<td>Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 &#181;L tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 &#181;g/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity controlled Cell culture incubator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>370</td>
			<td>set to 37 &#186;C, 5 % CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-like growth factor 1 (IGF-1)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>291-G1-200</td>
			<td>Dissolve 200 &#181;g in 2 mL of PBS to 100 &#181;g/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 &#181;g/mL stock and store at -80 &#186;C. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 10 &#181;g/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kainc acid</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab144490</td>
			<td>Working concentration 5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10828</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 &#181;g/mL (coating), 1 &#181;g/mL (cell media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td>Dissolve 2 mg of LDN into 500 &#181;L of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 &#186;C. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 &#181;M working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25030</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA glass plates</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td>60MEA200/30iR-Ti-gr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipet P200</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>PJ22224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td>Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 &#181;L tubes. (working concentration 100 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Working concentration100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (PMN)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>540223</td>
			<td>Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 &#181;g in 1 mL of PBS to 100 &#181;g/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 &#181;L/tube and freeze at -80 &#186;C. Take 200 &#181;L of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 &#181;L/tube&#160;and store at -80 &#186;C. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK-I nhibitor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>1293823</td>
			<td>Dissolve 5 mg in 1480 &#181;L of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4317</td>
			<td>Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell culture hoods</td>
			<td>Baker Company</td>
			<td>SG-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement B - B27 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Working concentration 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement N - N2 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top cell culture centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75004261</td>
			<td>Sorvall Legend X1R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoplastic&#160;film - Parafilm</td>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue dissociation protease - Dispase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522-1G</td>
			<td>Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 &#186;C. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>2530054</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>2332</td>
			<td>Isotemp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of an electrophysiological platform for modeling als with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons

Humane pluripotente stamcelleavledede astrocytter (hiPSC-A) og nevroner (hiPSC-N) gir et kraftig verktøy for modellering av patofysiologi for amyotrofisk lateral sklerose (ALS) in vitro. Multi-electrode array (MEA) opptak er et middel til å registrere elektriske feltpotensialer fra store populasjoner av nevroner og analysere nettverksaktivitet over tid. Det ble tidligere demonstrert at tilstedeværelsen av hiPSC-A som er differensiert ved hjelp av teknikker for å fremme en ryggmargsastrocytfenotype, forbedret modning og elektrofysiologisk aktivitet av regionalt spesifikke ryggmargshiPSC-motorneuroner (MN) sammenlignet med de som ble dyrket uten hiPSC-A eller i nærvær av gnagerastrocytter. Beskrevet her er en metode for å samdyrke ryggmargs hiPSC-A med hiPSC-MN og registrere elektrofysiologisk aktivitet ved hjelp av MEA-opptak. Mens differensieringsprotokollene beskrevet her er spesielle for astrocytter og nevroner som er regionalt spesifikke for ryggmargen, kan samkultureringsplattformen brukes på astrocytter og nevroner differensiert med teknikker som er spesifikke for andre skjebner, inkludert kortikal hiPSC-A og hiPSC-N. Disse protokollene tar sikte på å gi en elektrofysiologisk analyse for å informere om glia-neuron interaksjoner og gi en plattform for testing av legemidler med terapeutisk potensial i ALS.

Ryggmargsmønsterprotokollen for generering av hiPSC-MN og ryggmargshiPSC-A er skissert i figur 1. I denne protokollen opprettholdes og passeres hiPSCer som ikke-sammenflytende kolonier (figur 2A). Neurogenese initieres (nevral induksjon) gjennom dobbel SMAD-hemming ved tillegg av LDN193189 og SB431542, som inaktiverer henholdsvis benmorfogenetisk protein (BMP) og transformerende vekstfaktor-beta (TGF-β) veier. En monolagsbasert metode brukes til dette trinnet ...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons at JoVE

Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons

Vi beskriver en metode for å differensiere ryggmargsmenneskeskapte pluripotente astrocytter og nevroner og deres samkultur for elektrofysiologisk registrering.

Etablering av en elektrofysiologisk plattform for modellering av ALS med regionalt spesifikke humane pluripotente stamcelleavledede astrocytter og nevroner

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) ...

Teknikken vi presenterer i dag tillater analyse av ryggmargsnevronaktivitet som følge av inneboende nevronfaktor og påvirkning av omkringliggende astrocytter. Denne teknikken genererer pålitelig både menneskelige nevroner og humane astrocytter som er ryggmargsspesifikke og bruker et funksjonelt utgangsmål som kan skaleres for reproduserbarhet. Teknikken vi presenterer gjør det mulig å undersøke ryggmargsneuronerspesifikke sykdommer som amyotrofisk lateral sklerose, ved hjelp av nevroner fra pasienter med enten sporadisk eller genetisk sykdom.Til å begynne med, undersøk de menneskelige iPSC-platene for tilstrekkelig tette kolonier slik at sentrum av koloniene viser spredte hvite områder. For å begynne å pakke cellene, tegner du rutenettlinjer på den nederste ytre overflaten av platene med en markør for å lette nøyaktig dekning av hele platen. Bruk et fasekontrastmikroskop med 10x forstørrelse i en kulturhette for å løsne differensierte kolonier ved å skrape manuelt med en 200 mikroliter pipettespiss.Skyll deretter platene to ganger med PBS. Og tilsett deretter fem milliliter vevsdissosiasjonsprotease forvarmet ved 37 grader Celsius. Inkuber cellene ved 37 grader Celsius i fire til syv minutter til kantene på koloniene begynner å runde opp, før du løfter kolonier fra platen.Aspirer forsiktig dissosiasjonsproteasen og skyll platen forsiktig to ganger med PBS uten å løsne koloniene. Tilsett fem milliliter forvarmet humant iPSC-medium på kulturplaten. Skrap deretter hele platen med en spiss av en fem milliliters pipette ved hjelp av en frem og tilbake bevegelse fra topp til bunn og løft koloniene mens du bryter dem opp i mindre celleaggregater.For differensiering av human iPSC i nevrale stamceller. Når menneskelig iPSC danner et monolag og blir 90% sammenflytende, start differensiering som beskrevet i manuskriptet. På den 12. dagen, etter trypsinbehandling, hvis cellene ikke er i suspensjon, løsner celler mekanisk ved å kaste ut nevrale induksjonsmedium fra en 1000 mikroliter pipettespiss på cellene med en sirkulær bevegelse for å dekke hele overflaten.Hvis nevrale stamcellekulturer ble frosset, tine dem. Etter middelsutveksling og PBS-skylling som beskrevet i manuskriptet, skift medium med et motornevrondifferensieringsmedium inneholdende 0,02 mikromolar cytosinarabinosid, inkuber deretter cellene i 48 timer ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid når gliaengasjerte forfedre fremstår som enkeltprolifererende flate celler under postmitotiske motorneuronprogenitorer, aggregert i celleklynger. Senere utførte medium utveksling som angitt i manuskriptet.På dagen for plating eller før, begynn å belegge de 24 brønnplatene MEA ved først å fortynne PLO i vann eller PBS. Deretter tilsettes 15 til 20 mikroliter PLO til hver brønn som danner en dråpe på midten av brønnen, som dekker elektrodeområdet, og sikrer ikke å skade elektroder med pipettespissen. Tilsett vann i rommene rundt brønner, og sørg for tilstrekkelig fuktighet.Og inkuber PLO ved 37 grader Celsius i en til to timer. Bruk deretter en mikropipettespiss av plast til å aspirere så mye PLO som mulig uten å berøre elektrodene. Deretter vaskes brønnen med 250 mikroliter vann tre ganger.Bruk en pipettespiss til å fjerne så mye vann som mulig og la overflaten tørke med lokket fjernet. Deretter tilsettes 15 til 20 mikroliter fortynnet laminin for å dekke hver elektroderekke. Etter å ha tilsatt vann i fuktighetsrommene og skiftet lokket, rug ved 37 grader Celsius i minst to timer frem til over natten.På dagen for plating, etter skylling av motorneuronene og astrocytkulturer en gang med PBS, tilsett 0,05% trypsin og inkuber ved 37 grader Celsius i omtrent fem minutter for å løfte celler. Samle celler i et 15 milliliter konisk rør som inneholder trypsinhemmer. Og vask plater med medium eller base for å sikre at alle cellene samles inn.Pellet ned cellene ved sentrifisering. Og deretter ved hjelp av en 1000 mikroliter pipette, resuspendere motorneuroner og astrocytter med et kokulturmedium som inneholder 20 mikromolar ROCK-inhibitor for å generere en milliliter av en enkeltcellesuspensjon. Bruk et hemocytometer til å telle motorneuronene og astrocytter.Og mens du teller, holdt cellesuspensjonene og plasser dem i et isoporstativ ved fire grader Celsius. Sentrifuge en milliliter av begge cellesuspensjonene ved 300 ganger G i fem minutter. Beregn ønsket volum og resuspender pellets.Kombiner det nødvendige volumet av nevron- og astrocyttsuspensjoner i like forhold, og bland forsiktig ved å pipettere to ganger for å kombinere grundig. Fjern deretter laminin fra hver brønn på platen og overfør 10 mikroliter av den endelige kombinerte cellesuspensjonen til hver brønn, og danner en liten dråpe som dekker elektrodeoppstillingen. Inkuber platene med en uforstyrret celledråpe ved 37 grader Celsius i 20 til 30 minutter for å danne første vedlegg på platene.Deretter pipetterer 250 mikroliter varmt kokulturmedium inneholdende ROCK-inhibitor ned på veggen av hver brønn og pipetter samme volum på motsatt vegg av hver brønn og inkuberer platen ved 37 grader Celsius i 24 til 36 timer. Neste dag, undersøk platene for rusk eller døde celler. Og om nødvendig, bytt ut mediet med et ferskt samkulturmedium som inneholder ROCK-hemmer.Ellers utfører du halvt medium utveksling to ganger i uken ved hjelp av et samkulturmedium uten en ROCK-hemmer som starter på samkultur dag to. For å utføre opptak, start så snart som mulig etter samkultur dag én ved å sette temperaturen til 37 grader Celsius og karbondioksid på 5%Overfør deretter plater til opptaksmaskinen og likevekt i minst fem minutter før opptak. Registrer baseline aktivitet annenhver dag eller ukentlig over ett til 15 minutter, avhengig av eksperimentell design.For å undersøke forbigående elektrofysiologiske effekter av forbindelser rettet mot enten nevroner eller astrocytter, fjern platelokket, men hold maskinlokket lukket og registrer baselineaktivitet i minst ett minutt. Åpne maskinlokket manuelt uten å stoppe det elektrofysiologiske opptaket og bytt ut 25 mikroliter medium med riktig legemiddelbil. Lukk deretter lokket manuelt og ta opp i flere minutter om nødvendig.På samme måte kan du teste stoffet av interesse. I denne protokollen ble hiPSCer opprettholdt og passert som ikke-sammenflytende kolonier. Nevrogenese ble initiert gjennom dobbel SMAD-hemming ved å inaktivere BMP- og TGF-beta-veier.De resulterende nevroepitelstamceller delte seg og genererte et flerlags epitel. Den tidlige eksponeringen for nevronale vekstfaktorer og en gliogen ciliær nevrotrofisk faktor genererte en blandet populasjon av stamceller. Nevroner oppsto spontant fra denne blandede populasjonen.Den gliogene bryteren induserte astrocytdifferensiering gjennom aktivering av JAK-STAT-banen. Ryggmargsidentiteten til hakkhemmerbehandlede og differensierte motornevronceller ble støttet av høye kolinacetyltransferaseekspresjonsnivåer. På den 90. dagen etter in vitro-kultur viste humane iPSC-astrocytter moden fenotype som indikert av S100 beta- og GFAP-uttrykk, mens deres regionale ryggmargsidentitet ble støttet av uttrykk for hauker før.Samdyrkede celler omarrangeres spontant med astrocytter som skaper et fôringslag nederst og nevroner som forbinder nettverk øverst. Nevroner aggregert i store celleklynger når de ble dyrket alene, mens samkulturen av humane iPSC-motorneuroner med humane iPSC-astrocytter resulterte i jevnt fordelte monolag. Humane iPSC-astrocytter forbedret den elektrofysiologiske modningen av humane iPSC-motorneuroner, som vist ved høyere grader av spiking og sprengningsaktivitet i samkulturene.Vår erfaring er at stamcellekultur og tidlig NPC-differensiering er de vanskeligste og mest følsomme for tekniske feil. På dette stadiet må teknikkene ikke utføres med konsistens og nøyaktighet med liten margin for feilsøking. Samkulturteknikkene beskrevet her kan også brukes i andre celletypespesifikke modeller.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Utledning av Human nevrale stamceller og nevroner fra pluripotent humane embryonale stamceller med lite molekyl Induksjon

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Spesifikasjonen av Telencephalic glutamatergic Neurons fra menneskelige pluripotente stamceller

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Regissert dopaminerge Neuron Differensiering fra Menneskelig Pluripotent stamceller

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellering Zika virusinfeksjon på utvikle menneskelige hjerne In Vitro bruke stilk cellen avledet Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Metode for høyhastighets strekk skade av menneskelige indusert Pluripotent Stamcelle-avledet Neurons i 96-brønnen Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Compartmentalization av Human Stem Cell-avledet neurons innen pre-monterte plast Mikrovæskebasert chips

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Post-differensiering Replating av Human pluripotent Stem Cell-avledet neurons for High-Content screening av Neuritogenesis og synapse modning

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Konvertering av Human indusert pluripotent Stem Cells (iPSCs) i funksjonell spinal og skallen motor neurons bruke PiggyBac vektorer

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Migrasjon, kjemo-attraksjon og co-kultur analyser for menneskelige stamcelle-avledet endotelceller og GABAergic Nevroner

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analysere mitokondrietransport og morfologi i humant indusert pluripotente stamcelleavledede nevroner i arvelig spastisk paraplegi

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...