Name: establishment of an electrophysiological platform for modeling als with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons
Uploaded: 2021-08-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons at JoVE

Este manuscrito fue respaldado por lo siguiente: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH/NINDS (CWH), 2020 Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Career Development Award (CWH). 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). Agradecemos al Dr. Raha Dastgheyb y al Dr. Norman Haughey por proporcionar la plataforma MEA y el software de análisis de datos que hemos utilizado para validar la plataforma electrofisiológica descrita. Nos gustaría agradecer a Khalil Rust por su ayuda con la demostración del protocolo y la filmación.

1. Preparación de medios de cultivo celular
<ol><li>Preparar los medios de cultivo celular individuales utilizando las composiciones mencionadas en la Tabla 1.</li>
	<li>Mezclar y filtrar estéril el medio en frascos filtrados de 500 ml, y almacenar protegido de la luz a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.</li>
</ol>2. Mantenimiento y paso de células madre pluripotentes inducidas humanas no confluentes (hiPSC)
<ol><li>Descongele la matriz de la membrana basal (almacenada ...

<ol>
	<li>Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review:+Induced+pluripotent+stem+cells+and+the+search+for+new+cell-specific+ALS+therapeutic+targets.">Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets.</a> Neuroscience Letters. 755, 135911 (2021).</li><li>Taga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+spinal+cord+astrocytes+in+the+functional+maturation+of+motor+neurons+in+a+multi-electrode+array+system.">Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system.</a> Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).</li><li>Klapper, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+lineage+cells+are+essential+for+functional+neuronal+differentiation+and+synapse+maturation+in+human+iPSC-derived+neural+networks.">Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks.</a> Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+C9orf72+human+iPSC-derived+astrocytes+cause+non-cell+autonomous+motor+neuron+pathophysiology.">Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology.</a> Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).</li><li>Almad, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+43+in+astrocytes+contributes+to+motor+neuron+toxicity+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).</li><li>Wainger, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+membrane+hyperexcitability+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+patient-derived+motor+neurons.">Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons.</a> Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).</li><li>Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+astrocytes:+Specification+and+relevance+for+neurological+disorders.">Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders.</a> Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).</li><li>Imaizumi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+regional+identity+of+hPSC-derived+neurons+to+uncover+neuronal+subtype+specificity+of+neurological+disease+phenotypes.">Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).</li><li>Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+evaluation+of+convulsant+and+anticonvulsant+drugs+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cortical+neuronal+networks+using+an+MEA+system.">Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10416 (2018).</li><li>Haidet-Phillips, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+profiling+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+astrocyte+progenitors+following+spinal+cord+engraftment.">Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment.</a> Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).</li><li>Roybon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+spinal+cord+astrocytes+with+defined+mature+or+reactive+phenotypes.">Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes.</a> Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).</li><li>Shimojo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=simple+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells.">simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).</li><li>Chandrasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+2D+and+3D+neural+induction+methods+for+the+generation+of+neural+progenitor+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).</li><li>Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+transplantable+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+sonic+hedgehog+and+Wnt+signaling+determines+ventral+and+dorsal+telencephalic+neuron+types+from+human+embryonic+stem+cells.">Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells.</a> Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).</li><li>Liu, H., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+neuronal+and+glial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).</li><li>Borghese, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+notch+signaling+in+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+stem+cells+delays+G1/S+phase+transition+and+accelerates+neuronal+differentiation+in+vitro+and+in+vivo.">Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo.</a> Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cerebral+cortex+development+from+pluripotent+stem+cells+to+functional+excitatory+synapses.">Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses.</a> Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).</li></ol>

Hasta la fecha, los métodos basados en hiPSC y MEA para registros electrofisiológicos de cocultivos astrocito-neurona han encontrado una aplicación limitada en el campo de ALS6 y aún no en plataformas completamente humanas, en contraste con su uso más generalizado para el modelado in vitro de la epilepsia9. Esta plataforma, sin embargo, tiene el potencial de abordar cuestiones fisiopatológicamente relevantes en la investigación de la ELA, como los mecanismos...

Los astrocitos y neuronas derivados de células madre pluripotentes humanas (hiPSC-A) y las neuronas (hiPSC-N) son herramientas poderosas para modelar la fisiopatología de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) in vitro y proporcionan un paradigma traslacional para las estrategias de descubrimiento de fármacos1. Los investigadores han demostrado que el cocultivo de hiPSC-A con hiPSC-N mejora la maduración morfológica, molecular, electrofisiológica y farmacológica de ambos tipos celulares, generando redes neuronales complejas e interacciones astrocito-neurona que se asemejan a sus contrapartes in vivo 2,3. Experimentos similares de cocultivo pueden recapitular las características distintivas de la patobiología de la ELA, como la neurotoxicidad mediada por astrocitos 4,5 y la hiperexcitabilidad neuronal6. Además, con los avances en los protocolos de diferenciación, las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) se pueden diferenciar en subtipos neuronales específicos de la región, incluidos hiPSC-A cortical y de médula espinal e hiPSC-N 7,8. Estas estrategias proporcionan el potencial para modelar la patología de las neuronas motoras corticales y espinales en la ELA, así como la influencia astrocítica en ambas. Sin embargo, esto requiere que haya un ensayo funcional reproducible para determinar estos efectos.
Recientemente se demostró que el registro de matriz de electrodos múltiples (MEA) es particularmente adecuado para la caracterización electrofisiológica de cocultivos neuronales-astrocitos2. A diferencia de los análisis electrofisiológicos unicelulares, estas matrices de electrodos de alta densidad registran pasivamente los potenciales de campo extracelular de grandes poblaciones de neuronas sin interrumpir las condiciones de cultivo y preservar la integridad de las membranas celulares. Estas plataformas son particularmente útiles para registrar la actividad celular y de red de los cultivos a lo largo del tiempo y en respuesta a la manipulación farmacológica. Finalmente, cuando la presencia de astrocitos es una variable de cultivo, los registros de MEA pueden proporcionar información funcional sobre las interacciones bidireccionales astrocito-neurona 2,9.
Aquí se presenta un protocolo optimizado para la diferenciación de hiPSC en hiPSC-A de la médula espinal y hiPSC-neuronas motoras (MN) que ha sido previamente validado2. El protocolo de diferenciación hiPSC-A de la médula espinal da como resultado consistentemente cultivos de astrocitos, que son positivos para la proteína B de unión al calcio S100 (S100β), la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) y Homeobox B4 (HOXB4) en hasta el 80%, 50% y 90% de las células, respectivamente, lo que indica una especificación glial y de la médula espinal madura 2,10 . El protocolo de diferenciación hiPSC-MN genera neuronas que son >90% positivas para la colina acetiltransferasa (ChAT), lo que sugiere una identidad madura de neurona alfa-motora2. Además, el protocolo describe técnicas para la generación de cocultivos hiPSC-A/MN previamente demostrados para dar lugar a neuronas con mayor complejidad morfológica por análisis de Scholl y microscopía inmunofluorescente en comparación con cultivos neuronales sin astrocitos o con astrocitos de roedores2. Si bien estas descripciones son específicas de la médula espinal hiPSC-A y hiPSC-N, una ventaja única es que el cultivo independiente inicial de astrocitos y neuronas seguido de pasos para el cocultivo en puntos de tiempo posteriores se puede traducir para estudiar los efectos de las interacciones neurona-astrocito de otras regiones específicas, así como de células específicas de la enfermedad 7,8 . Finalmente, el protocolo describe cómo cultivar estos cultivos en placas MEA para que la actividad funcional como factor de composición de cocultivo pueda estudiarse a lo largo del tiempo con la capacidad de manipular la composición celular y las condiciones de cultivo.
El objetivo de estos protocolos es proporcionar un ensayo funcional para investigar las interacciones astrocito-neurona, examinar los cambios específicos de la enfermedad y probar medicamentos con potencial terapéutico en el campo de la ELA. Se proporcionan instrucciones en video para los pasos más desafiantes de este protocolo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm sterile culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 sterile culture flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Working concentration 110 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL 0.2 &#181;m CA Filter System</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well sterile culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericine B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td>Working concentration 2.0 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anionic detergent with protease enzyme - Terg-A-Zyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273287</td>
			<td>Working concentration 1% m/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid (ASAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 &#181;m filter, aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 &#181;g/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W)</td>
			<td>Axion</td>
			<td>OPT-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axion Edge MEA platform</td>
			<td>Axion</td>
			<td>Maestro Edge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane matrix - Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Details in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microscope (sterile under cell culture hood)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415510-1100-000</td>
			<td>Primo Vert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicuculline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>14340</td>
			<td>Working concentration10 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciliary neurotrophic factor (CNTF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-13</td>
			<td>Dissolve 100 &#181;g in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tanks and regulator for Axion Edge</td>
			<td>AirGas/Harris</td>
			<td>9296NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound E</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab142164</td>
			<td>Dissolve 250 &#181;g in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 &#181;M stock. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanquixaline&#160; (CNQX)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C239</td>
			<td>Working concentration 50 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydrokainic acid (DHK)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>111</td>
			<td>Working concentration 50 &#956;M and 300 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>113300</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>Combine 10 mL of Essential 8 (10x)&#160; supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Dissolve 100 &#181;g in 1mL of PBS to 100 &#181;g/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Election Microscopy Sciences</td>
			<td>63510-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Millipore-sigma</td>
			<td>H3149-100KU</td>
			<td>Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 &#181;L tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 &#181;g/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity controlled Cell culture incubator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>370</td>
			<td>set to 37 &#186;C, 5 % CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-like growth factor 1 (IGF-1)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>291-G1-200</td>
			<td>Dissolve 200 &#181;g in 2 mL of PBS to 100 &#181;g/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 &#181;g/mL stock and store at -80 &#186;C. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 10 &#181;g/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kainc acid</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab144490</td>
			<td>Working concentration 5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10828</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 &#181;g/mL (coating), 1 &#181;g/mL (cell media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td>Dissolve 2 mg of LDN into 500 &#181;L of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 &#186;C. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 &#181;M working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25030</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA glass plates</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td>60MEA200/30iR-Ti-gr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipet P200</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>PJ22224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td>Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 &#181;L tubes. (working concentration 100 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Working concentration100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (PMN)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>540223</td>
			<td>Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 &#181;g in 1 mL of PBS to 100 &#181;g/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 &#181;L/tube and freeze at -80 &#186;C. Take 200 &#181;L of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 &#181;L/tube&#160;and store at -80 &#186;C. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK-I nhibitor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>1293823</td>
			<td>Dissolve 5 mg in 1480 &#181;L of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4317</td>
			<td>Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell culture hoods</td>
			<td>Baker Company</td>
			<td>SG-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement B - B27 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Working concentration 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement N - N2 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top cell culture centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75004261</td>
			<td>Sorvall Legend X1R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoplastic&#160;film - Parafilm</td>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue dissociation protease - Dispase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522-1G</td>
			<td>Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 &#186;C. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>2530054</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>2332</td>
			<td>Isotemp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of an electrophysiological platform for modeling als with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons

Los astrocitos y neuronas derivados de células madre pluripotentes humanas (hiPSC-A) y las neuronas (hiPSC-N) proporcionan una herramienta poderosa para modelar la fisiopatología de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) in vitro. Las grabaciones de matriz de electrodos múltiples (MEA) son un medio para registrar potenciales de campo eléctrico de grandes poblaciones de neuronas y analizar la actividad de la red a lo largo del tiempo. Se demostró previamente que la presencia de hiPSC-A que se diferencian utilizando técnicas para promover un fenotipo de astrocito de la médula espinal mejoró la maduración y la actividad electrofisiológica de las neuronas motoras (MN) hiPSC de la médula espinal específicas regionalmente en comparación con las cultivadas sin hiPSC-A o en presencia de astrocitos de roedores. Aquí se describe un método para cocultivar hiPSC-A de la médula espinal con hiPSC-MN y registrar la actividad electrofisiológica utilizando grabaciones MEA. Si bien los protocolos de diferenciación descritos aquí son particulares para los astrocitos y las neuronas que son regionalmente específicos de la médula espinal, la plataforma de cocultivo se puede aplicar a astrocitos y neuronas diferenciadas con técnicas específicas para otros destinos, incluidos hiPSC-A cortical e hiPSC-N. Estos protocolos tienen como objetivo proporcionar un ensayo electrofisiológico para informar sobre las interacciones glia-neurona y proporcionar una plataforma para probar medicamentos con potencial terapéutico en la ELA.

El protocolo de patrones de la médula espinal para la generación de hiPSC-MN y hiPSC-A de la médula espinal se describe en la Figura 1. En este protocolo, las hiPSC se mantienen y pasan como colonias no confluentes (Figura 2A). La neurogénesis se inicia (inducción neural) a través de la inhibición dual de SMAD mediante la adición de LDN193189 y SB431542, inactivando las vías de la proteína morfogenética ósea (BMP) y del factor de crecimiento transfor...

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Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons

Describimos un método para diferenciar astrocitos y neuronas derivados pluripotentes inducidos por humanos de la médula espinal y su cocultivo para el registro electrofisiológico.

Establecimiento de una plataforma electrofisiológica para modelar la ELA con astrocitos y neuronas derivados de células madre pluripotentes humanas específicas de la región

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) ...

La técnica que presentamos hoy permite el análisis de la actividad neuronal de la médula espinal como resultado del factor neuronal intrínseco y la influencia de los astrocitos circundantes. Esta técnica genera de manera confiable tanto neuronas humanas como astrocitos humanos que son específicos de la médula espinal y utiliza una medida de salida funcional que se puede escalar para la reproducibilidad. La técnica que presentamos permite investigar enfermedades específicas de las neuronas de la médula espinal, como la esclerosis lateral amiotrófica, utilizando neuronas de pacientes con enfermedad esporádica o genética.Para empezar, examine las placas iPSC humanas en busca de colonias suficientemente densas de modo que el centro de las colonias muestre áreas blancas dispersas. Luego, para comenzar a empaquetar las celdas, dibuje líneas de cuadrícula en la superficie exterior inferior de las placas con un marcador para facilitar la cobertura precisa de toda la placa. Utilice un microscopio de contraste de fase de aumento de 10x en una campana de cultivo para separar colonias diferenciadas raspando manualmente con una punta de pipeta de 200 microlitros.A continuación, enjuague las placas dos veces con PBS. Y luego agregue cinco mililitros de proteasa de disociación tisular precalentada a 37 grados centígrados. Incubar las células a 37 grados centígrados durante cuatro a siete minutos hasta que los bordes de las colonias comiencen a redondearse, antes de levantar las colonias de la placa.Aspire cuidadosamente la proteasa de disociación y enjuague suavemente la placa dos veces con PBS sin desalojar las colonias. Agregue cinco mililitros de medio iPSC humano precalentado a la placa de cultivo. Luego rasque toda la placa con una punta de una pipeta de cinco mililitros con un movimiento de ida y vuelta de arriba a abajo y levante las colonias mientras las divide en agregados de celdas más pequeñas.Para la diferenciación de iPSC humanas en células progenitoras neurales. Una vez que la iPSC humana forma una monocapa y se convierte en 90% confluente, comience la diferenciación como se describe en el manuscrito. En el día 12, después del tratamiento con tripsina, si las células no están en suspensión, las células se desprenden mecánicamente expulsando el medio de inducción neural de una punta de pipeta de 1000 microlitros sobre las células con un movimiento circular para cubrir toda la superficie.Si los cultivos de células progenitoras neurales se congelaron, descongérelas. Después del intercambio del medio y el enjuague de PBS como se describe en el manuscrito, cambie el medio con un medio de diferenciación de neuronas motoras que contenga 0.02 arabinósido de citosina micromolar y luego incube las células durante 48 horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono cuando los progenitores comprometidos gliales emergen como células planas que proliferan bajo progenitores de neuronas motoras postmitóticas, agregados en grupos de células. Posteriormente, realizó el intercambio de medios como se indica en el manuscrito.El día del recubrimiento o antes, comience a cubrir las placas MEA de 24 pozos diluyendo primero PLO en agua o PBS. Luego agregue de 15 a 20 microlitros de PLO a cada pocillo formando una gota en el centro del pozo, cubriendo el área del electrodo asegurando que no se dañen los electrodos con la punta de la pipeta. Agregue agua a los compartimentos que rodean los pozos, asegurando suficiente humedad.E incubar PLO a 37 grados centígrados durante una o dos horas. Luego, usando una punta de micropipeta de plástico, aspire la mayor cantidad de PLO posible sin tocar los electrodos. A continuación, lave el pozo con 250 microlitros de agua tres veces.Con la punta de una pipeta, retire la mayor cantidad de agua posible y deje que la superficie se seque con la tapa retirada. A continuación, agregue de 15 a 20 microlitros de laminina diluida para cubrir cada matriz de electrodos. Después de agregar agua a los compartimentos de humedad y reemplazar la tapa, incubar a 37 grados centígrados durante un mínimo de dos horas hasta toda la noche.El día del recubrimiento, después de enjuagar las neuronas motoras y los cultivos de astrocitos una vez con PBS, agregue 0.05% de tripsina e incube a 37 grados centígrados durante unos cinco minutos para levantar las células. Recolectar células en un tubo cónico de 15 mililitros que contiene inhibidor de tripsina. Y lave las placas con medio o base para asegurarse de que todas las celdas se recogen.Granular las células por centrificación. Y luego, utilizando una pipeta de 1000 microlitros, resuspender las neuronas motoras y los astrocitos con un medio de cocultivo que contiene 20 micromolares de inhibidor de ROCK para generar un mililitro de una suspensión de una sola célula. Usando un hemocitómetro, cuente las neuronas motoras y los astrocitos.Y mientras contaba, mantenía las suspensiones celulares y las colocaba en una rejilla de espuma de poliestireno a cuatro grados centígrados. Centrifugar un mililitro de ambas suspensiones celulares a 300 veces G durante cinco minutos. Calcular el volumen deseado y resuspender los pellets.Combine el volumen requerido de suspensiones de neuronas y astrocitos en proporciones iguales, y mezcle suavemente pipeteando dos veces para combinar bien. Luego retire la laminina de cada pocillo de la placa y transfiera 10 microlitros de la suspensión celular combinada final a cada pozo, formando una pequeña gota que cubre la matriz de electrodos. Incubar las placas con una gota celular inalterada a 37 grados centígrados durante 20 a 30 minutos para formar uniones iniciales en las placas.Luego pipetear 250 microlitros de medios de cocultivo calientes que contienen inhibidor de ROCK hacia abajo en la pared de cada pocillo y pipetear el mismo volumen en la pared opuesta de cada pocillo e incubar la placa a 37 grados centígrados durante 24 a 36 horas. Al día siguiente, examine las placas en busca de escombros o células muertas. Y si es necesario, intercambie el medio con un medio de cocultivo fresco que contenga inhibidor de ROCK.De lo contrario, realice intercambios de medio medio dos veces por semana utilizando un medio de cocultivo sin un inhibidor de ROCK a partir del segundo día de cocultivo. Para realizar la grabación, comience tan pronto como sea posible después del primer día de cocultivo ajustando la temperatura a 37 grados centígrados y el dióxido de carbono al 5%, luego transfiera las placas a la máquina grabadora y equilibre durante al menos cinco minutos antes de grabar. Registre la actividad de referencia cada dos días o semanalmente durante uno a 15 minutos, dependiendo del diseño experimental.Para investigar los efectos electrofisiológicos transitorios de los compuestos dirigidos a las neuronas o los astrocitos, retire la tapa de la placa pero mantenga la tapa de la máquina cerrada y registre la actividad basal durante un mínimo de un minuto. Abra manualmente la tapa de la máquina sin detener el registro electrofisiológico e intercambie 25 microlitros de medio con el vehículo farmacológico apropiado. Luego cierre la tapa manualmente y registre durante minutos adicionales si es necesario.Del mismo modo, pruebe el medicamento de interés. En este protocolo, las hiPSC se mantuvieron y pasaron como colonias no confluentes. La neurogénesis se inició a través de la inhibición dual de SMAD mediante la inactivación de las vías BMP y TGF-beta.Las células madre neuroepiteliales resultantes se dividieron y generaron un epitelio de múltiples capas. La exposición temprana a factores de crecimiento neuronal y un factor neurotrófico ciliar gliogénico generó una población mixta de células progenitoras. Las neuronas surgieron espontáneamente de esta población mixta.El interruptor gliogénico indujo la diferenciación de astrocitos a través de la activación de la vía JAK-STAT. La identidad de la médula espinal de las células de la neurona motora tratadas con inhibidores de muesca y diferenciadas fue apoyada por altos niveles de expresión de colina acetiltransferasa. En el día 90 después del cultivo in vitro, los astrocitos iPSC humanos mostraron un fenotipo de maduración según lo indicado por la expresión de S100 beta y GFAP, mientras que su identidad regional de la médula espinal fue respaldada por la expresión de halcones antes.Las células cocultivadas se reorganizaron espontáneamente con astrocitos creando una capa de alimentación en la parte inferior y neuronas que conectan redes en la parte superior. Las neuronas se agregaron en grandes grupos de células cuando se cultivaron solas, mientras que el cocultivo de neuronas motoras iPSC humanas con astrocitos iPSC humanos dio como resultado monocapas distribuidas uniformemente. Los astrocitos iPSC humanos mejoraron la maduración electrofisiológica de las neuronas motoras iPSC humanas, como lo demuestran los grados más altos de actividad de picos y ráfagas en los cocultivos.En nuestra experiencia, el cultivo de células madre y la diferenciación temprana de NPC son los más difíciles y sensibles a los errores técnicos. En esta etapa, las técnicas no deben realizarse con consistencia y precisión con poco margen para la resolución de problemas. Las técnicas de cocultivo descritas aquí también se pueden usar en otros modelos específicos de tipo celular.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivación eficiente de los Derechos Humanos progenitores neuronales y neuronas de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Investigación

Neurociencias

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

La especificación de telencefálicas neuronas glutamatérgicas a partir de células madre pluripotentes

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dirigida dopaminérgica Neurona La diferenciación de las células madre pluripotentes humanas

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelado de la infección del Virus Zika del desarrollo cerebro humano In Vitro usando células madre derivado Cerebral organitas

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Método para la lesión de estiramiento de alta velocidad de humanos inducida por las neuronas derivadas de células madre pluripotentes en formato de 96 pocillos

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Compartmentalización de las neuronas derivadas de células madre humanas dentro de chips microfluídicos plásticos preensamblados

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Replacado posterior a la diferenciación de las neuronas derivadas de células madre pluripotentes humanas para la detección de alto contenido de la neuritogénesis y la maduración de la sinapsis

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversión de células madre pluripotentes inducidas por humanos (IPSC) en neuronas motoras craneales y espinales funcionales usando vectores PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Migración, Chemo-Atracción, y Co-Cultura Ensayos para Células Endoteliales Derivadas de Células Madre Humanas y Neuronas GABAérgicas

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Análisis del transporte mitocondrial y la morfología en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre en paraplejia espástica hereditaria

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...