Name: establishment of an electrophysiological platform for modeling als with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons
Uploaded: 2021-08-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons at JoVE

Detta manuskript stöddes av följande: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH/NINDS (CWH), 2020 Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Career Development Award (CWH). 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). Vi tackar Dr. Raha Dastgheyb och Dr. Norman Haughey för att ha tillhandahållit MEA-plattformen och dataanalysprogramvaran som vi har använt för att validera den beskrivna elektrofysiologiska plattformen. Vi vill tacka Khalil Rust för deras hjälp med protokolldemonstration och filmning.

1. Förberedelse av cellodlingsmedia
<ol><li>Bered de enskilda cellodlingsmedierna med de kompositioner som anges i tabell 1.</li>
	<li>Blanda och sterilfiltrera mediet i 500 ml filtrerade flaskor och förvara skyddat från ljus vid 4 °C i upp till 2 veckor.</li>
</ol>2. Underhåll och överföring av icke-konfluenta humant inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC)
<ol><li>Tina basalmembranmatrisen (förvaras i alikvoter vid -80 °C) i ett kylskåp på 2–8 °C över natten...

<ol>
	<li>Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review:+Induced+pluripotent+stem+cells+and+the+search+for+new+cell-specific+ALS+therapeutic+targets.">Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets.</a> Neuroscience Letters. 755, 135911 (2021).</li><li>Taga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+spinal+cord+astrocytes+in+the+functional+maturation+of+motor+neurons+in+a+multi-electrode+array+system.">Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system.</a> Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).</li><li>Klapper, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+lineage+cells+are+essential+for+functional+neuronal+differentiation+and+synapse+maturation+in+human+iPSC-derived+neural+networks.">Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks.</a> Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+C9orf72+human+iPSC-derived+astrocytes+cause+non-cell+autonomous+motor+neuron+pathophysiology.">Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology.</a> Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).</li><li>Almad, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+43+in+astrocytes+contributes+to+motor+neuron+toxicity+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).</li><li>Wainger, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+membrane+hyperexcitability+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+patient-derived+motor+neurons.">Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons.</a> Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).</li><li>Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+astrocytes:+Specification+and+relevance+for+neurological+disorders.">Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders.</a> Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).</li><li>Imaizumi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+regional+identity+of+hPSC-derived+neurons+to+uncover+neuronal+subtype+specificity+of+neurological+disease+phenotypes.">Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).</li><li>Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+evaluation+of+convulsant+and+anticonvulsant+drugs+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cortical+neuronal+networks+using+an+MEA+system.">Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10416 (2018).</li><li>Haidet-Phillips, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+profiling+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+astrocyte+progenitors+following+spinal+cord+engraftment.">Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment.</a> Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).</li><li>Roybon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+spinal+cord+astrocytes+with+defined+mature+or+reactive+phenotypes.">Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes.</a> Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).</li><li>Shimojo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=simple+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells.">simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).</li><li>Chandrasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+2D+and+3D+neural+induction+methods+for+the+generation+of+neural+progenitor+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).</li><li>Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+transplantable+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+sonic+hedgehog+and+Wnt+signaling+determines+ventral+and+dorsal+telencephalic+neuron+types+from+human+embryonic+stem+cells.">Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells.</a> Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).</li><li>Liu, H., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+neuronal+and+glial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).</li><li>Borghese, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+notch+signaling+in+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+stem+cells+delays+G1/S+phase+transition+and+accelerates+neuronal+differentiation+in+vitro+and+in+vivo.">Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo.</a> Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cerebral+cortex+development+from+pluripotent+stem+cells+to+functional+excitatory+synapses.">Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses.</a> Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).</li></ol>

Hittills har hiPSC- och MEA-baserade metoder för elektrofysiologiska registreringar av astrocyt-neuron-samkulturer funnit begränsad tillämpning inom ALS6-området och fortfarande inte i helt mänskliga plattformar, i motsats till deras mer utbredda användning för in vitro-modellering av epilepsi9. Denna plattform har dock potential att ta itu med patofysiologiskt relevanta frågor i ALS-forskning, såsom mekanismerna för neuronal hyperexcitabilitet, astrocytb...

Humana pluripotenta stamcellshärledda astrocyter (hiPSC-A) och neuroner (hiPSC-N) är kraftfulla verktyg för modellering av patofysiologi för amyotrofisk lateral skleros (ALS) in vitro och ger ett translationellt paradigm för strategier för läkemedelsupptäckt1. Forskare har visat att samkulturen av hiPSC-A med hiPSC-N förbättrar den morfologiska, molekylära, elektrofysiologiska och farmakologiska mognaden av båda celltyperna, vilket genererar komplexa neuronala nätverk och astrocyt-neuroninteraktioner som liknar deras in vivo-motsvarigheter 2,3. Liknande samodlingsexperiment kan rekapitulera kännetecken för ALS-patobiologi såsom astrocytmedierad neurotoxicitet 4,5 och neuronal hyperexcitabilitet6. Dessutom, med framsteg i differentieringsprotokoll, kan humant inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) differentieras till regionalt specifika neurala subtyper, inklusive kortikala och ryggmärgs hiPSC-A och hiPSC-N 7,8. Dessa strategier ger potential för modellering av kortikal och spinal motorneuronpatologi vid ALS såväl som det astrocytiska inflytandet på båda. Detta kräver dock att det finns en reproducerbar funktionell analys för att bestämma dessa effekter.
Nyligen visades att multielektrodmatris (MEA) inspelning är särskilt lämplig för elektrofysiologisk karakterisering av neuron-astrocyt-samkulturer2. I motsats till encelliga elektrofysiologiska analyser registrerar dessa elektroduppsättningar med hög densitet passivt extracellulära fältpotentialer från stora populationer av neuroner utan att störa odlingsförhållandena och bevara cellmembranens integritet. Dessa plattformar är särskilt användbara för att registrera kulturernas cellulära och nätverksaktivitet över tid och som svar på farmakologisk manipulation. Slutligen, när närvaron av astrocyter är en kulturvariabel, kan MEA-inspelningar ge funktionella insikter i dubbelriktade interaktioner mellan astrocyt-neuron 2,9.
Här presenteras ett optimerat protokoll för differentiering av hiPSC till ryggmärgs hiPSC-A och hiPSC-motorneuroner (MN) som tidigare har validerats2. Ryggmärgs hiPSC-A-differentieringsprotokoll resulterar konsekvent i astrocytkulturer, som är positiva för S100 kalciumbindande protein B (S100β), glialt fibrillärt surt protein (GFAP) och Homeobox B4 (HOXB4) i upp till 80%, 50% respektive 90% av cellerna, vilket indikerar en mognad glial och ryggmärgsspecifikation 2,10 . HiPSC-MN-differentieringsprotokollet genererar neuroner som är >90% positiva för kolinacetyltransferas (ChAT), vilket tyder på en mogen alfa-motorisk neuronidentitet2. Dessutom beskriver protokollet tekniker för generering av hiPSC-A/MN-samkulturer som tidigare visat sig resultera i neuroner med förbättrad morfologisk komplexitet genom Scholl-analys och immunofluorescerande mikroskopi jämfört med neuronala kulturer utan astrocyter eller med gnagarastrocyter2. Även om dessa beskrivningar är specifika för ryggmärgs hiPSC-A och hiPSC-N, är en unik fördel att den initiala oberoende kulturen av astrocyter och neuroner följt av steg till samodling vid senare tidpunkter kan översättas för att studera effekterna av neuron-astrocytinteraktioner från andra specifika regioner såväl som sjukdomsspecifika celler 7,8 . Slutligen beskriver protokollet hur man odlar dessa kulturer på MEA-plattor så att funktionell aktivitet som en faktor för samkulturkomposition kan studeras över tid med förmågan att manipulera cellulär sammansättning såväl som odlingsförhållanden.
Målet med dessa protokoll är att tillhandahålla en funktionell analys för att undersöka astrocyt-neuroninteraktioner, undersöka sjukdomsspecifika förändringar och testa läkemedel med terapeutisk potential inom ALS-området. Videoinstruktioner tillhandahålls för de mest utmanande stegen i detta protokoll.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm sterile culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 sterile culture flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Working concentration 110 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL 0.2 &#181;m CA Filter System</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well sterile culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericine B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td>Working concentration 2.0 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anionic detergent with protease enzyme - Terg-A-Zyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273287</td>
			<td>Working concentration 1% m/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid (ASAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 &#181;m filter, aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 &#181;g/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W)</td>
			<td>Axion</td>
			<td>OPT-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axion Edge MEA platform</td>
			<td>Axion</td>
			<td>Maestro Edge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane matrix - Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Details in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microscope (sterile under cell culture hood)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415510-1100-000</td>
			<td>Primo Vert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicuculline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>14340</td>
			<td>Working concentration10 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciliary neurotrophic factor (CNTF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-13</td>
			<td>Dissolve 100 &#181;g in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tanks and regulator for Axion Edge</td>
			<td>AirGas/Harris</td>
			<td>9296NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound E</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab142164</td>
			<td>Dissolve 250 &#181;g in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 &#181;M stock. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanquixaline&#160; (CNQX)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C239</td>
			<td>Working concentration 50 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydrokainic acid (DHK)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>111</td>
			<td>Working concentration 50 &#956;M and 300 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>113300</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>Combine 10 mL of Essential 8 (10x)&#160; supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Dissolve 100 &#181;g in 1mL of PBS to 100 &#181;g/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Election Microscopy Sciences</td>
			<td>63510-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Millipore-sigma</td>
			<td>H3149-100KU</td>
			<td>Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 &#181;L tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 &#181;g/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity controlled Cell culture incubator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>370</td>
			<td>set to 37 &#186;C, 5 % CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-like growth factor 1 (IGF-1)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>291-G1-200</td>
			<td>Dissolve 200 &#181;g in 2 mL of PBS to 100 &#181;g/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 &#181;g/mL stock and store at -80 &#186;C. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 10 &#181;g/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kainc acid</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab144490</td>
			<td>Working concentration 5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10828</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 &#181;g/mL (coating), 1 &#181;g/mL (cell media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td>Dissolve 2 mg of LDN into 500 &#181;L of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 &#186;C. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 &#181;M working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25030</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA glass plates</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td>60MEA200/30iR-Ti-gr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipet P200</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>PJ22224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td>Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 &#181;L tubes. (working concentration 100 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Working concentration100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (PMN)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>540223</td>
			<td>Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 &#181;g in 1 mL of PBS to 100 &#181;g/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 &#181;L/tube and freeze at -80 &#186;C. Take 200 &#181;L of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 &#181;L/tube&#160;and store at -80 &#186;C. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK-I nhibitor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>1293823</td>
			<td>Dissolve 5 mg in 1480 &#181;L of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4317</td>
			<td>Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell culture hoods</td>
			<td>Baker Company</td>
			<td>SG-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement B - B27 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Working concentration 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement N - N2 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top cell culture centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75004261</td>
			<td>Sorvall Legend X1R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoplastic&#160;film - Parafilm</td>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue dissociation protease - Dispase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522-1G</td>
			<td>Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 &#186;C. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>2530054</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>2332</td>
			<td>Isotemp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of an electrophysiological platform for modeling als with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons

Humana pluripotenta stamcellshärledda astrocyter (hiPSC-A) och neuroner (hiPSC-N) ger ett kraftfullt verktyg för modellering av amyotrofisk lateral skleros (ALS) patofysiologi in vitro. Multi-electrode array (MEA) inspelningar är ett sätt att registrera elektriska fältpotentialer från stora populationer av neuroner och analysera nätverksaktivitet över tiden. Det har tidigare visats att närvaron av hiPSC-A som differentieras med hjälp av tekniker för att främja en ryggmärgs astrocytfenotyp förbättrade mognad och elektrofysiologisk aktivitet hos regionalt specifika ryggmärgs hiPSC-motorneuroner (MN) jämfört med de som odlades utan hiPSC-A eller i närvaro av gnagarastrocyter. Här beskrivs en metod för att samodla ryggmärgen hiPSC-A med hiPSC-MN och registrera elektrofysiologisk aktivitet med hjälp av MEA-inspelningar. Medan differentieringsprotokollen som beskrivs här är specifika för astrocyter och neuroner som är regionalt specifika för ryggmärgen, kan samodlingsplattformen tillämpas på astrocyter och neuroner differentierade med tekniker som är specifika för andra öden, inklusive kortikala hiPSC-A och hiPSC-N. Dessa protokoll syftar till att tillhandahålla en elektrofysiologisk analys för att informera om glia-neuroninteraktioner och tillhandahålla en plattform för att testa läkemedel med terapeutisk potential vid ALS.

Protokollet för ryggmärgsmönstring för generering av hiPSC-MN och ryggmärgs hiPSC-A beskrivs i figur 1. I detta protokoll upprätthålls hiPSC och passeras som icke-sammanflytande kolonier (figur 2A). Neurogenes initieras (neural induktion) genom dubbel SMAD-hämning genom tillägg av LDN193189 och SB431542, vilket inaktiverar benmorfogenetiskt protein (BMP) respektive transformerande tillväxtfaktor-beta (TGF-β) vägar. En monolagerbaserad metod används ...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons at JoVE

Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons

Vi beskriver en metod för att differentiera ryggmärgsinducerade pluripotenta härledda astrocyter och neuroner och deras samkultur för elektrofysiologisk registrering.

Etablering av en elektrofysiologisk plattform för modellering av ALS med regionalt specifika humana pluripotenta stamcellshärledda astrocyter och neuroner

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) ...

Den teknik vi presenterar idag möjliggör analys av ryggmärgs neuronaktivitet som ett resultat av inneboende neuronal faktor och påverkan av omgivande astrocyter. Denna teknik genererar på ett tillförlitligt sätt både mänskliga neuroner och humana astrocyter som är ryggmärgsspecifika och använder ett funktionellt utgångsmått som kan skalas för reproducerbarhet. Tekniken vi presenterar gör det möjligt att undersöka ryggmärgs neuroner specifika sjukdomar som amyotrofisk lateralskleros, med hjälp av neuroner från patienter med antingen sporadisk eller genetisk sjukdom.Till att börja med, undersök de mänskliga iPSC-plattorna för tillräckligt täta kolonier så att koloniernas centrum visar spridda vita områden. För att börja förpacka cellerna, rita rutnät på plattans nedre yttre yta med en markör för att underlätta korrekt täckning av hela plattan. Använd ett faskontrastmikroskop med 10x förstoring i en kulturhood för att lossa differentierade kolonier genom att manuellt skrapa med en 200 mikroliter pipettspets.Skölj sedan plattorna två gånger med PBS. Och tillsätt sedan fem milliliter vävnadsdissociationsproteas förvärmt vid 37 grader Celsius. Inkubera cellerna vid 37 grader Celsius i fyra till sju minuter tills koloniernas kanter börjar runda uppåt innan kolonierna lyfts från plattan.Aspirera försiktigt dissociationsproteaset och skölj försiktigt plattan två gånger med PBS utan att lossa kolonierna. Tillsätt fem milliliter förvärmt humant iPSC-medium till odlingsplattan. Skrapa sedan hela plattan med en spets av en fem milliliter pipett med en fram och tillbaka rörelse från topp till botten och lyft kolonierna medan du bryter upp dem i mindre cellaggregat.För differentiering av humant iPSC till neurala stamceller. När mänsklig iPSC bildar ett monolager och blir 90% sammanflytande, börja differentiering som beskrivs i manuskriptet. På den 12: e dagen, efter trypsinbehandling, om cellerna inte är i suspension, lossnar celler mekaniskt genom att mata ut neuralt induktionsmedium från en 1000 mikroliter pipettspets på cellerna med en cirkulär rörelse för att täcka hela ytan.Om de neurala stamcellkulturerna frystes, tina dem. Efter medium utbyte och PBS sköljning som beskrivs i manuskriptet, byt mediet med ett motorneurondifferentieringsmedium innehållande 0,02 mikromolar cytosinarabinosid och inkubera sedan cellerna i 48 timmar vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid när glialengagerade förfäder framträder som enstaka prolifererande platta celler under postmitotiska motorneuronprogenitorer, aggregerade i cellkluster. Senare utförde mediumutbyte som anges i manuskriptet.På pläteringsdagen eller tidigare, börja belägga de 24 brunns MEA-plattorna genom att först späda PLO i vatten eller PBS. Tillsätt sedan 15 till 20 mikroliter PLO till varje brunn och bilda en droppe i mitten av brunnen och täck elektrodområdet så att elektrodområdet inte skadas med pipettspetsen. Tillsätt vatten i facken som omger brunnar, vilket säkerställer tillräcklig fuktighet.Och inkubera PLO vid 37 grader Celsius i en till två timmar. Använd sedan en mikropipettspets av plast och aspirera så mycket PLO som möjligt utan att vidröra elektroderna. Tvätta sedan brunnen med 250 mikroliter vatten tre gånger.Ta bort så mycket vatten som möjligt med pipettspetsen och låt ytan torka med locket borttaget. Tillsätt sedan 15 till 20 mikroliter utspätt laminin för att täcka varje elektroduppsättning. Efter tillsats av vatten till fuktutrymmena och byte av locket, inkubera vid 37 grader Celsius i minst två timmar upp till över natten.På pläteringsdagen, efter sköljning av motorneuronerna och astrocytkulturerna en gång med PBS, tillsätt 0,05% trypsin och inkubera vid 37 grader Celsius i cirka fem minuter för att lyfta celler. Samla celler i ett 15 ml koniskt rör innehållande trypsinhämmare. Och tvätta plattor med medium eller bas för att säkerställa att alla celler samlas in.Pellet ner cellerna genom centrifiering. Och sedan med hjälp av en 1000 mikroliter pipett, resuspendera motorneuroner och astrocyter med ett samodlingsmedium innehållande 20 mikromolar ROCK-hämmare för att generera en milliliter av en enda cellsuspension. Använd en hemocytometer, räkna motorneuronerna och astrocyterna.Och medan du räknade, höll cellsuspensionerna och placerade dem i ett styrofoamställ vid fyra grader Celsius. Centrifugera en milliliter av båda cellsuspensionerna vid 300 gånger G i fem minuter. Beräkna önskad volym och återsuspendera pelletsen.Kombinera den erforderliga volymen neuron- och astrocytsuspensioner i lika stora förhållanden och blanda försiktigt genom pipettering två gånger för att kombinera noggrant. Ta sedan bort laminin från varje brunn på plattan och överför 10 mikroliter av den slutliga kombinerade cellsuspensionen till varje brunn och bilda en liten droppe som täcker elektrodmatrisen. Inkubera plattorna med en ostörd celldroppe vid 37 grader Celsius i 20 till 30 minuter för att bilda initiala fästen på plattorna.Pipettera sedan 250 mikroliter varmt samodlingsmedium innehållande ROCK-hämmare ner på väggen i varje brunn och pipettera samma volym på motsatt vägg i varje brunn och inkubera plattan vid 37 grader Celsius i 24 till 36 timmar. Nästa dag, undersök plattorna för skräp eller döda celler. Och vid behov, byt ut mediet mot ett nytt samodlingsmedium innehållande ROCK-hämmare.Annars utför halva mediumutbyten två gånger i veckan med ett samodlingsmedium utan en ROCK-hämmare från och med samkulturdag två. För att utföra inspelning, börja så snart som möjligt efter samodling dag ett genom att ställa in temperaturen till 37 grader Celsius och koldioxid till 5%Överför sedan plattorna till inspelningsmaskinen och balansera i minst fem minuter före inspelningen. Registrera baslinjeaktivitet varannan dag eller varje vecka under en till 15 minuter beroende på experimentell design.För att undersöka de övergående elektrofysiologiska effekterna av föreningar som riktar sig mot antingen neuroner eller astrocyter, ta bort plattlocket men håll maskinlocket stängt och registrera baslinjeaktivitet i minst en minut. Öppna maskinlocket manuellt utan att stoppa den elektrofysiologiska registreringen och byt ut 25 mikroliter medium med lämpligt läkemedelsfordon. Stäng sedan locket manuellt och spela in i ytterligare minuter om det behövs.På samma sätt testa läkemedlet av intresse. I detta protokoll upprätthölls hiPSC och passerade som icke-sammanflytande kolonier. Neurogenes initierades genom dubbel SMAD-hämning genom att inaktivera BMP- och TGF-beta-vägar.De resulterande neuroepiteliala stamcellerna delade sig och genererade ett flerskiktigt epitel. Den tidiga exponeringen för neuronala tillväxtfaktorer och en gliogen ciliär neurotrofisk faktor genererade en blandad population av stamceller. Neuroner uppstod spontant från denna blandade population.Den gliogena omkopplaren inducerade astrocytdifferentiering genom aktivering av JAK-STAT-vägen. Ryggmärgsidentiteten hos notch-hämmare behandlade och differentierade motorneuronceller stöddes av höga kolinacetyltransferasuttrycksnivåer. På den 90: e dagen efter in vitro-kulturen uppvisade humana iPSC-astrocyter mognande fenotyp som indikeras av S100 beta- och GFAP-uttryck medan deras ryggmärgs regionala identitet stöddes av uttryck av hökar tidigare.Samodlade celler omarrangerade spontant med astrocyter som skapar ett matningsskikt längst ner och neuroner som förbinder nätverk på toppen. Neuroner aggregerade i stora cellkluster när de odlades ensamma, medan samkulturen av humana iPSC-motorneuroner med humana iPSC-astrocyter resulterade i jämnt fördelade monolager. Humana iPSC-astrocyter förbättrade den elektrofysiologiska mognaden hos humana iPSC-motorneuroner, vilket framgår av högre grader av spikning och sprängningsaktivitet i samkulturerna.Enligt vår erfarenhet är stamcellsodlingen och tidig NPC-differentiering de svåraste och känsligaste för tekniska fel. I detta skede får teknikerna inte utföras med konsekvens och noggrannhet med liten marginal för felsökning. Samodlingsteknikerna som beskrivs här kan också användas i andra celltypspecifika modeller.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Derivering av mänskliga neurala stamceller och nervceller från Pluripotenta mänskliga embryonala stamcellslinjer med liten molekyl Induktion

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Specifikationen av Telencephalic glutamaterg nervceller från mänskliga pluripotenta stamceller

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Riktad dopaminerga nerv Differentiering från Human pluripotenta stamceller

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellering Zika Virus infektion av utveckla mänskliga hjärnan In Vitro med stamceller härstammar Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Metod för hög hastighet Stretch skada av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller-derived nervceller i en 96-väl Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Uppdelning av mänskliga stamceller-härledda neuroner inom förmonterade plast Microfluidic chips

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Efter differentiering Replating av mänskliga pluripotenta stamceller-härledda nervceller för hög innehåll screening av Neuritogenes och synapsen mognad

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Omvandling av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) till funktionella spinal och kranial motor neuron använda PiggyBac vektorer

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Migration, Chemo-Attraction och Co-Kultur Analyser för humanstamcells-härledda endotelceller och GABAergic nervceller

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analysera mitokondriell transport och morfologi i mänskliga inducerad pluripotent stamcell-härledda nervceller i ärftliga spastisk paraplegi

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...