Name: establishment of an electrophysiological platform for modeling als with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons
Uploaded: 2021-08-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons at JoVE

Bu makale aşağıdaki makaleler tarafından desteklenmiştir: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH/NINDS (CWH), 2020 Doris Duke Hayırsever Vakfı Klinik Bilim İnsanı Kariyer Geliştirme Ödülü (CWH). 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). Açıklanan elektrofizyolojik platformu doğrulamak için kullandığımız MEA platformunu ve veri analiz yazılımını sağladıkları için Dr. Raha Dastgheyb ve Dr. Norman Haughey'e teşekkür ederiz. Khalil Rust'a protokol gösterimi ve çekimleri konusundaki yardımları için teşekkür ederiz.

1. Hücre kültürü media hazırlama
<ol><li>Tablo 1'de belirtilen bileşimleri kullanarak bireysel hücre kültürü ortamını hazırlayın.</li>
	<li>Medyayı 500 mL filtrelenmiş şişelerde karıştırın ve steril olarak filtreleyin ve 2 haftaya kadar 4 ° C'de ışıktan korunmuş olarak saklayın.</li>
</ol>2. Akıcı olmayan insan kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin (hiPSC) bakımı ve pasajı
<ol><li>Bodrum membran matrisini (-80 °C'de alikotlarda saklanır) gec...

<ol>
	<li>Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review:+Induced+pluripotent+stem+cells+and+the+search+for+new+cell-specific+ALS+therapeutic+targets.">Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets.</a> Neuroscience Letters. 755, 135911 (2021).</li><li>Taga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+spinal+cord+astrocytes+in+the+functional+maturation+of+motor+neurons+in+a+multi-electrode+array+system.">Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system.</a> Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).</li><li>Klapper, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+lineage+cells+are+essential+for+functional+neuronal+differentiation+and+synapse+maturation+in+human+iPSC-derived+neural+networks.">Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks.</a> Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+C9orf72+human+iPSC-derived+astrocytes+cause+non-cell+autonomous+motor+neuron+pathophysiology.">Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology.</a> Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).</li><li>Almad, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+43+in+astrocytes+contributes+to+motor+neuron+toxicity+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).</li><li>Wainger, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+membrane+hyperexcitability+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+patient-derived+motor+neurons.">Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons.</a> Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).</li><li>Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+astrocytes:+Specification+and+relevance+for+neurological+disorders.">Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders.</a> Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).</li><li>Imaizumi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+regional+identity+of+hPSC-derived+neurons+to+uncover+neuronal+subtype+specificity+of+neurological+disease+phenotypes.">Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).</li><li>Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+evaluation+of+convulsant+and+anticonvulsant+drugs+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cortical+neuronal+networks+using+an+MEA+system.">Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10416 (2018).</li><li>Haidet-Phillips, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+profiling+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+astrocyte+progenitors+following+spinal+cord+engraftment.">Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment.</a> Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).</li><li>Roybon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+spinal+cord+astrocytes+with+defined+mature+or+reactive+phenotypes.">Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes.</a> Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).</li><li>Shimojo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=simple+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells.">simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).</li><li>Chandrasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+2D+and+3D+neural+induction+methods+for+the+generation+of+neural+progenitor+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).</li><li>Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+transplantable+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+sonic+hedgehog+and+Wnt+signaling+determines+ventral+and+dorsal+telencephalic+neuron+types+from+human+embryonic+stem+cells.">Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells.</a> Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).</li><li>Liu, H., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+neuronal+and+glial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).</li><li>Borghese, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+notch+signaling+in+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+stem+cells+delays+G1/S+phase+transition+and+accelerates+neuronal+differentiation+in+vitro+and+in+vivo.">Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo.</a> Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cerebral+cortex+development+from+pluripotent+stem+cells+to+functional+excitatory+synapses.">Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses.</a> Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).</li></ol>

Bugüne kadar, astrosit-nöron ortak kültürlerinin elektrofizyolojik kayıtları için hiPSC ve MEA tabanlı yöntemler, epilepsi9'un in vitro modellemesi için daha yaygın kullanımlarının aksine, ALS6 alanında sınırlı bir uygulama alanı bulmuş ve hala tam olarak insan platformlarında bulunmamıştır. Bununla birlikte, bu platform, nöronal hipereksitabilite mekanizmaları, astrositin nörotoksisiteye katkısı veya ağ aktivitesinin hastalığın ile...

İnsan pluripotent kök hücre kaynaklı astrositler (hiPSC-A) ve nöronlar (hiPSC-N), Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS) patofizyolojisini in vitro olarak modellemek için güçlü araçlardır ve ilaç keşif stratejileri için translasyonel bir paradigma sağlar1. Araştırmacılar, hiPSC-A'nın hiPSC-N ile ortak kültürünün, her iki hücre tipinin morfolojik, moleküler, elektrofizyolojik ve farmakolojik olgunlaşmasını arttırdığını, karmaşık nöronal ağlar ve in vivo muadillerine benzeyen astrosit-nöron etkileşimleri ürettiğini göstermiştir 2,3. Benzer ko-kültür deneyleri, astrosit aracılı nörotoksisite 4,5 ve nöronal hiper-uyarılabilirlik6 gibi ALS patobiyolojisinin ayırt edici özelliklerini özetleyebilir. Ek olarak, farklılaşma protokollerindeki ilerlemelerle, insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC), kortikal ve omurilik hiPSC-A ve hiPSC-N 7,8 dahil olmak üzere bölgesel olarak spesifik nöral alt tiplere ayrılabilir. Bu stratejiler, ALS'de kortikal ve spinal motor nöron patolojisinin modellenmesi için potansiyel ve her ikisi üzerindeki astrositik etkiyi sağlar. Bununla birlikte, bu, bu etkileri belirlemek için tekrarlanabilir bir fonksiyonel tahlil yapılmasını gerektirir.
Son zamanlarda, çoklu elektrot dizisi (MEA) kaydının nöron-astrosit ortak kültürlerinin elektrofizyolojik karakterizasyonu için özellikle uygun olduğu gösterilmiştir2. Tek hücreli elektrofizyolojik analizlerin aksine, bu yüksek yoğunluklu elektrot dizileri, kültür koşullarını bozmadan ve hücre zarlarının bütünlüğünü korumadan büyük nöron popülasyonlarından hücre dışı alan potansiyellerini pasif olarak kaydeder. Bu platformlar, kültürlerin hücresel ve ağ aktivitesini zaman içinde ve farmakolojik manipülasyona yanıt olarak kaydetmek için özellikle yararlıdır. Son olarak, astrositlerin varlığı bir kültür değişkeni olduğunda, MEA kayıtları astrosit-nöron çift yönlü etkileşimleri hakkında işlevsel bilgiler sağlayabilir 2,9.
Burada, hiPSC'nin omurilik hiPSC-A ve daha önce doğrulanmış olan hiPSC-motor nöronlara (MN) farklılaşması için optimize edilmiş bir protokolsunulmaktadır 2. Omurilik hiPSC-A farklılaşma protokolü tutarlı bir şekilde, hücrelerin sırasıyla% 80,% 50 ve% 90'ına kadar S100 kalsiyum bağlayıcı protein B (S100β), glial fibriler asidik protein (GFAP) ve Homeobox B4 (HOXB4) için pozitif olan astrosit kültürleriyle sonuçlanır ve olgunlaşan bir glial ve omurilik spesifikasyonunu gösterir 2,10 . HiPSC-MN farklılaşma protokolü, olgun bir alfa-motor nöron kimliği2'yi düşündüren kolin asetiltransferaz (ChAT) için% >90 pozitif nöronlar üretir. Ek olarak, protokol, astrositsiz veya kemirgen astrositleri olan nöronal kültürlerle karşılaştırıldığında, Scholl analizi ve immünofloresan mikroskopi ile artmış morfolojik karmaşıklığa sahip nöronlarla sonuçlandığı daha önce gösterilen hiPSC-A / MN ortak kültürlerinin üretilmesi için teknikleri açıklamaktadır2. Bu tanımlar omurilik hiPSC-A ve hiPSC-N'ye özgü olsa da, benzersiz bir avantaj, astrositlerin ve nöronların başlangıçtaki bağımsız kültürünün, daha sonraki zaman noktalarında ko-kültüre yönelik adımların ardından, diğer spesifik bölgelerden ve hastalığa özgü hücrelerden nöron-astrosit etkileşimlerinin etkilerini incelemek içinçevrilebilmesidir7,8 . Son olarak, protokol bu kültürlerin MEA plakalarında nasıl yetiştirileceğini açıklar, böylece ko-kültür kompozisyonunun bir faktörü olarak fonksiyonel aktivite, hücresel kompozisyonu ve kültür koşullarını manipüle etme yeteneği ile zaman içinde incelenebilir.
Bu protokollerin amacı, astrosit-nöron etkileşimlerini araştırmak, hastalığa özgü değişiklikleri incelemek ve ALS alanında terapötik potansiyele sahip ilaçları test etmek için fonksiyonel bir test sağlamaktır. Bu protokolün en zorlu adımları için video talimatları sağlanmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm sterile culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 sterile culture flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Working concentration 110 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL 0.2 &#181;m CA Filter System</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well sterile culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericine B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td>Working concentration 2.0 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anionic detergent with protease enzyme - Terg-A-Zyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273287</td>
			<td>Working concentration 1% m/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid (ASAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 &#181;m filter, aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 &#181;g/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W)</td>
			<td>Axion</td>
			<td>OPT-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axion Edge MEA platform</td>
			<td>Axion</td>
			<td>Maestro Edge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane matrix - Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Details in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microscope (sterile under cell culture hood)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415510-1100-000</td>
			<td>Primo Vert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicuculline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>14340</td>
			<td>Working concentration10 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciliary neurotrophic factor (CNTF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-13</td>
			<td>Dissolve 100 &#181;g in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tanks and regulator for Axion Edge</td>
			<td>AirGas/Harris</td>
			<td>9296NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound E</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab142164</td>
			<td>Dissolve 250 &#181;g in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 &#181;M stock. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanquixaline&#160; (CNQX)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C239</td>
			<td>Working concentration 50 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydrokainic acid (DHK)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>111</td>
			<td>Working concentration 50 &#956;M and 300 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>113300</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>Combine 10 mL of Essential 8 (10x)&#160; supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Dissolve 100 &#181;g in 1mL of PBS to 100 &#181;g/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Election Microscopy Sciences</td>
			<td>63510-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Millipore-sigma</td>
			<td>H3149-100KU</td>
			<td>Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 &#181;L tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 &#181;g/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity controlled Cell culture incubator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>370</td>
			<td>set to 37 &#186;C, 5 % CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-like growth factor 1 (IGF-1)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>291-G1-200</td>
			<td>Dissolve 200 &#181;g in 2 mL of PBS to 100 &#181;g/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 &#181;g/mL stock and store at -80 &#186;C. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 10 &#181;g/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kainc acid</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab144490</td>
			<td>Working concentration 5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10828</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 &#181;g/mL (coating), 1 &#181;g/mL (cell media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td>Dissolve 2 mg of LDN into 500 &#181;L of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 &#186;C. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 &#181;M working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25030</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA glass plates</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td>60MEA200/30iR-Ti-gr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipet P200</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>PJ22224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td>Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 &#181;L tubes. (working concentration 100 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Working concentration100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (PMN)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>540223</td>
			<td>Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 &#181;g in 1 mL of PBS to 100 &#181;g/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 &#181;L/tube and freeze at -80 &#186;C. Take 200 &#181;L of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 &#181;L/tube&#160;and store at -80 &#186;C. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK-I nhibitor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>1293823</td>
			<td>Dissolve 5 mg in 1480 &#181;L of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4317</td>
			<td>Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell culture hoods</td>
			<td>Baker Company</td>
			<td>SG-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement B - B27 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Working concentration 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement N - N2 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top cell culture centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75004261</td>
			<td>Sorvall Legend X1R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoplastic&#160;film - Parafilm</td>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue dissociation protease - Dispase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522-1G</td>
			<td>Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 &#186;C. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>2530054</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>2332</td>
			<td>Isotemp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of an electrophysiological platform for modeling als with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons

İnsan pluripotent kök hücre kaynaklı astrositler (hiPSC-A) ve nöronlar (hiPSC-N), Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS) patofizyolojisini in vitro olarak modellemek için güçlü bir araç sağlar. Çok elektrot dizisi (MEA) kayıtları, büyük nöron popülasyonlarından elektrik alan potansiyellerini kaydetmenin ve zaman içindeki ağ aktivitesini analiz etmenin bir yoludur. Daha önce, omurilik astrosit fenotipini teşvik etmek için teknikler kullanılarak farklılaştırılan hiPSC-A'nın varlığının, hiPSC-A olmadan veya kemirgen astrositlerinin varlığında kültürlenenlere kıyasla, bölgesel olarak spesifik omurilik hiPSC-motor nöronlarının (MN) olgunlaşmasını ve elektrofizyolojik aktivitesini geliştirdiği gösterilmiştir. Burada açıklanan, omurilik hiPSC-A'yı hiPSC-MN ile birlikte kültürlemek ve MEA kayıtlarını kullanarak elektrofizyolojik aktiviteyi kaydetmek için bir yöntemdir. Burada açıklanan farklılaşma protokolleri, omuriliğe bölgesel olarak özgü astrositlere ve nöronlara özgü olsa da, ortak kültürleme platformu, kortikal hiPSC-A ve hiPSC-N dahil olmak üzere diğer kaderlere özgü tekniklerle farklılaştırılmış astrositlere ve nöronlara uygulanabilir. Bu protokoller, glia-nöron etkileşimleri hakkında bilgi vermek için elektrofizyolojik bir test sağlamayı ve ALS'de terapötik potansiyeli olan ilaçları test etmek için bir platform sağlamayı amaçlamaktadır.

HiPSC-MN ve omurilik hiPSC-A'nın üretimi için omurilik modelleme protokolü Şekil 1'de özetlenmiştir. Bu protokolde, hiPSC'ler akıcı-olmayan koloniler olarak korunur ve geçirilir (Şekil 2A). Nörogenez, LDN193189 ve SB431542'nin eklenmesiyle ikili SMAD inhibisyonu yoluyla başlatılır (nöral indüksiyon), sırasıyla kemik morfogenetik proteini (BMP) ve dönüştürücü büyüme faktörü-beta (TGF-β) yollarını inaktive eder. Bu adım için, hiPS...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons at JoVE

Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons

Omurilik insan kaynaklı pluripotent kaynaklı astrositleri ve nöronları ve elektrofizyolojik kayıt için ortak kültürlerini ayırt etmek için bir yöntem tanımladık.

ALS'yi Bölgesel Olarak Spesifik İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Astrositler ve Nöronlarla Modellemek için Bir Elektrofizyolojik Platformun Kurulması

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) ...

Bugün sunduğumuz teknik, intrinsik nöronal faktörün ve çevredeki astrositlerin etkisinin bir sonucu olarak omurilik nöron aktivitesinin analizine izin vermektedir. Bu teknik, omuriliğe özgü hem insan nöronlarını hem de insan astrositlerini güvenilir bir şekilde üretir ve tekrarlanabilirlik için ölçeklendirilebilen fonksiyonel bir çıktı ölçüsü kullanır. Sunduğumuz teknik, sporadik veya genetik hastalığı olan hastaların nöronlarını kullanarak, amiyotrofik lateral skleroz gibi omurilik nöronlarına özgü hastalıkların araştırılmasına izin vermektedir.Başlangıç olarak, insan iPSC plakalarını, kolonilerin merkezi dağınık beyaz alanlar gösterecek şekilde yeterince yoğun koloniler için inceleyin. Daha sonra hücreleri paketlemeye başlamak için, tüm plakanın doğru bir şekilde kaplanmasını kolaylaştırmak için plakaların alt dış yüzeyine bir işaretleyici ile ızgara çizgileri çizin. 200 mikrolitrelik pipet ucuyla manuel olarak kazıyarak farklılaşmış kolonileri ayırmak için bir kültürde 10x büyütmeli bir faz kontrast mikroskobu kullanın.Ardından, plakaları PBS ile iki kez durulayın. Ve sonra 37 santigrat derecede önceden ısıtılmış beş mililitre doku ayrışma proteazı ekleyin. Kolonileri plakadan kaldırmadan önce, kolonilerin kenarları yuvarlanmaya başlayana kadar hücreleri dört ila yedi dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Dissosiyasyon proteazını dikkatlice aspire edin ve kolonileri yerinden çıkarmadan plakayı PBS ile iki kez hafifçe durulayın. Kültür plakasına beş mililitre önceden ısıtılmış insan iPSC ortamı ekleyin. Ardından, yukarıdan aşağıya doğru ileri geri bir hareket kullanarak beş mililitrelik bir pipetin ucuyla tüm plakayı çizin ve kolonileri daha küçük hücre agregalarına bölerken kaldırın.İnsan iPSC'sinin nöral progenitör hücrelere farklılaşması için. İnsan iPSC'si tek katmanlı bir tabaka oluşturduğunda ve% 90 birleştiğinde, makalede açıklandığı gibi farklılaşmaya başlayın. 12. günde, tripsin tedavisinden sonra, hücreler süspansiyonda değilse, 1000 mikrolitrelik bir pipet ucundan nöral indüksiyon ortamını, tüm yüzeyi kaplayacak dairesel bir hareketle hücrelere fırlatarak mekanik olarak hücreleri ayırır.Nöral progenitör hücre kültürleri donmuşsa, onları çözün. Makalede tarif edildiği gibi orta değişim ve PBS durulamasından sonra, 0.02 mikromolar sitozin arabinozid içeren bir motor nöron farklılaşma ortamı ile ortamı değiştirin, daha sonra glial bağlı progenitörler post mitotik motor nöron progenitörleri altında tek çoğalan düz hücreler olarak ortaya çıktığında, hücreleri 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 48 saat boyunca inkübe edin, hücre kümelerinde toplanır. Daha sonra, makalede belirtildiği gibi orta değişim gerçekleştirdi.Kaplama gününde veya öncesinde, önce FKÖ'yü su veya PBS ile seyrelterek 24 kuyulu MEA plakalarını kaplamaya başlayın. Daha sonra, kuyunun merkezinde bir damlacık oluşturan her bir kuyuya 15 ila 20 mikrolitre FKÖ ekleyin ve elektrot alanını kaplayarak pipet ucundaki elektrotlara zarar vermemesini sağlayın. Kuyuları çevreleyen bölmelere su ekleyerek yeterli nemi sağlayın.Ve FKÖ'yü bir ila iki saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra plastik bir mikro pipet ucu kullanarak, elektrotlara dokunmadan mümkün olduğunca fazla FKÖ'yü aspire edin. Daha sonra, kuyuyu üç kez 250 mikrolitre suyla yıkayın.Bir pipet ucu kullanarak mümkün olduğunca fazla su alın ve kapağı çıkarılmış olarak yüzeyin kurumasını bekleyin. Daha sonra, her elektrot dizisini örtmek için 15 ila 20 mikrolitre seyreltilmiş laminin ekleyin. Nem bölmelerine su ekledikten ve kapağı değiştirdikten sonra, gece boyunca en az iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Kaplama gününde, motor nöronları ve astrosit kültürlerini PBS ile bir kez duruladıktan sonra,% 0.05 tripsin ekleyin ve, hücreleri kaldırmak için yaklaşık beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Tripsin inhibitörü içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe hücreleri toplayın. Ve tüm hücrelerin toplandığından emin olmak için plakaları orta veya tabanla yıkayın.Hücreleri merkezleme yoluyla topaklayın. Ve sonra 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, motor nöronları ve astrositleri, tek bir hücre süspansiyonunun bir mililitresini üretmek için 20 mikromolar ROCK inhibitörü içeren bir ko-kültür ortamı ile yeniden askıya alın. Bir hemositometre kullanarak, motor nöronları ve astrositleri sayın.Ve sayarken, hücre süspansiyonlarını tuttu ve dört santigrat derecede strafor bir rafa yerleştirin. Her iki hücre süspansiyonunun bir mililitresini beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj yapın. İstenilen hacmi hesaplayın ve peletleri yeniden askıya alın.Gerekli miktarda nöron ve astrosit süspansiyonlarını eşit oranlarda birleştirin ve iyice birleştirmek için iki kez pipetleyerek, hafifçe karıştırın. Daha sonra laminini plakanın her bir kuyucuğundan çıkarın ve son kombine hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini her bir kuyucuğa aktararak elektrot dizisini kaplayan küçük bir damlacık oluşturun. Plakalar üzerinde ilk ataşmanları oluşturmak için plakaları 37 santigrat derecede bozulmamış bir hücre damlacığı ile 20 ila 30 dakika boyunca inkübe edin.Daha sonra her bir kuyucuğun duvarına ROCK inhibitörü içeren 250 mikrolitre sıcak ko-kültür ortamı pipeti ve her bir kuyucuğun karşı duvarında aynı hacimde pipet ve plakayı 24 ila 36 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, plakaları enkaz veya ölü hücreler için inceleyin. Ve gerekirse, ortamı ROCK inhibitörü içeren taze bir ko-kültür ortamı ile değiştirin.Aksi takdirde, ikinci günden başlayarak ROCK inhibitörü olmayan bir ko-kültür ortamı kullanarak haftada iki kez yarım orta değişim gerçekleştirin. Kayıt yapmak için, ortak kültür gününden sonra sıcaklığı 37 santigrat dereceye ve karbondioksiti% 5'e ayarlayarak mümkün olan en kısa sürede başlayınArdından plakaları kayıt makinesine aktarın ve kayıttan önce en az beş dakika dengeleyin. Deneysel tasarıma bağlı olarak her gün veya haftalık olarak bir ila 15 dakika boyunca temel aktiviteyi kaydedin.Nöronları veya astrositleri hedef alan bileşiklerin geçici elektrofizyolojik etkilerini araştırmak için, plaka kapağını çıkarın, ancak makine kapağını kapalı tutun ve en az bir dakika boyunca temel aktiviteyi kaydedin. Elektrofizyolojik kaydı durdurmadan makine kapağını manuel olarak açın ve 25 mikrolitre ortamı uygun ilaç aracıyla değiştirin. Ardından kapağı manuel olarak kapatın ve gerekirse birkaç dakika daha kaydedin.Benzer şekilde, ilgilendiğiniz ilacı test edin. Bu protokolde, hiPSC'ler akıcı-olmayan koloniler olarak korunmuş ve geçirilmiştir. Nörogenez, BMP ve TGF-beta yolaklarının inaktive edilmesiyle ikili SMAD inhibisyonu ile başlatıldı.Ortaya çıkan nöro epitel kök hücreleri bölündü ve çok katmanlı bir epitel oluşturdu. Nöronal büyüme faktörlerine ve gliojenik siliyer nörotrofik faktöre erken maruz kalma, karışık bir progenitör hücre popülasyonu oluşturdu. Nöronlar bu karışık popülasyondan kendiliğinden ortaya çıktı.Gliojenik anahtar, JAK-STAT yolunun aktivasyonu yoluyla astrosit farklılaşmasını indükledi. Çentik inhibitörü ile tedavi edilen ve farklılaşan motor nöron hücrelerinin omurilik kimliği, yüksek kolin asetiltransferaz ekspresyon düzeyleri ile desteklendi. In vitro kültürden 90. gün sonrasında, insan iPSC astrositleri S100 beta ve GFAP ekspresyonu ile belirtildiği gibi olgunlaşan fenotip sergilerken, omurilik bölgesel kimlikleri daha önce şahinlerin ekspresyonu ile desteklendi.Ko-kültürlü hücreler, altta bir beslenme tabakası oluşturan astrositler ve üstte ağları birbirine bağlayan nöronlarla kendiliğinden yeniden düzenlendi. Nöronlar tek başına kültürlendiğinde büyük hücre kümelerinde toplanırken, insan iPSC motor nöronlarının insan iPSC astrositleriyle birlikte kültürlenmesi, eşit olarak dağılmış tek katmanlarla sonuçlandı. İnsan iPSC astrositleri, insan iPSC motor nöronlarının elektrofizyolojik olgunlaşmasını, ortak kültürlerde daha yüksek derecelerde ani ve patlama aktivitesi ile gösterildiği gibi arttırdı.Deneyimlerimize göre, kök hücre kültürü ve erken NPC farklılaşması teknik hatalara karşı en zor ve hassas olanlardır. Bu aşamada, teknikler sorun giderme için çok az marjla tutarlılık ve doğrulukla gerçekleştirilmemelidir. Burada açıklanan ko-kültür teknikleri, diğer hücre tipine özgü modellerde de kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Nöronal atalarıdır ve Nöronlar Verimli türetilmesi

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

İnsan Pluripotent Kök Hücreler Telencephalic glutamaterjik Nöron Şartnamesi

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri dopaminerjik Nöron Farklılaşma Yönetmen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Kök hücre kullanarak gelişmekte olan insan beyni Vitro Zika virüs enfeksiyonu modelleme serebral Organoids türetilmiş

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Pluripotent kök hücre kaynaklı nöronlarda bir 96-şey Format yöntemi için yüksek hızlı streç yaralanma insan indüklenen

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Ön montajlı plastik mikrofluidik cips içinde ınsan kök hücresi türeyen neurons compartmentalization

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Neuritogenez ve Sinaps Matürasyonu yüksek içerikli Tarama için İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronların Post-differentiation Rekaplamag

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin (iPSCs), PiggyBac vektörler kullanarak fonksiyonel spinal ve kranial motor nöronlara dönüşümü

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Göç, Kemo-Attraction, ve Co-Kültür Tahliller İnsan Kök Hücre Kaynaklı Endotel Hücreleri ve GABAerjik Nöronlar için

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Kalıtsal Spastik Paraplejide İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronlarda Mitokondriyal Taşıma ve Morfolojinin Analizi

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...