Name: rapid, enzymatic methods for amplification of minimal, linear templates for protein prototyping using cell-free systems
Uploaded: 2021-06-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems at JoVE.com

Авторы признают, что NIH 1R35GM138265-01 и NSF 2029532 для частичной поддержки этого проекта.

1. Проектирование фрагмента гена
ПРИМЕЧАНИЕ: Фрагмент гена должен иметь все необходимые генетические элементы для транскрипции/трансляции, включая промотор, сайт связывания рибосом (RBS), стартовый кодон, интересующий ген и терминатор. Хотя терминатор не нужен для шаблона ?...

Интересующим геном может быть любой желаемый белок, но лучше всего начать с флуоресцентного белка в качестве удобного репортера для считывания в режиме реального времени или конечной точки на считывателе пластин для новых пользователей этого метода. Для новых белковых последовательн...

Бесклеточная экспрессия генов (CFE) стала мощным инструментом со многими приложениями. Такие приложения включают обнаружение заболеваний1,2,3,4,5,6,обнаружение микроэлементов и малых молекул7,8,9,10,11,12,биопроизводство13,14,15,16,17 ,18, образование19,20,21, производство сложных белков17,22,23,24,25,26,27, и вариантскрининга 23,28,29,30,31,32 ,33. Это связано с открытой природой бесклеточных систем и гибкостью, которую они предоставляют. Многие замечательные обзорные статьи предлагают историческое образование и будущие перспективы технологии34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44.
Типичная бесклетовая реакция состоит из трех основных компонентов: клеточного экстракта, энергетического микса и генетического шаблона. Экстракт активных клеток содержит все необходимые механизмы для транскрипции и трансляции (TXTL) и может быть обработан различными способами36. Гликолитические промежуточные продукты, электролиты, аминокислоты и кофакторы в энергетическом балансе поддерживают процесс TXTL. Он является основным источником изменчивости в бесклеточных экспериментах45 и может быть получен многими способами34,46. Подготовка генетического шаблона показала меньше улучшений, поскольку традиционные методы клонирования приводят к плазмидам с отличными характеристиками экспрессии. Недостатком этих традиционных методов является время обработки и количество биологических знаний, необходимых для их создания и распространения. Недавние усилия по оптимизации привели к простым 24-часовым рабочим процессам для подготовки экстракта клеток47,48, которые могут выполняться параллельно с подготовкой энергетического баланса49,50. Однако традиционное клонирование добавляет несколько дней к временной шкале прототипирования CFE(таблица 1)23. Быстро амплифицированные продукты ПЦР из коммерческого фрагмента гена могут быть использованы непосредственно51,но это ограничивает количество экспериментов по прототипированию, так как производится только 1 мкг ДНК, что соответствует примерно пяти реакциям (традиционные объемы 15 мкл). С этими дополнительными этапами циркуляризации и изотермической амплификации возможны количества ДНК, превышающие миллиграммы (~ 5000 реакций на 1 мг). Это резко увеличивает количество тестов, которые могут быть сделаны при высокопроизводительном скрининге белков или комбинаторных ферментных сетей (бесклеточная метаболическая инженерия); это также позволяет эффективно сохранять библиотеку линейных шаблонов в виде ДНК высокой концентрации. Кроме того, для прототипирования большего количества белка, необходимого для применения в материаловедении (белковые волокна и гидрогели), потребуется увеличение количества шаблона. Некоторые ограничения линейных шаблонов можно преодолеть, используя выдержку из BL21 DE3 Star или используя недавно открытые методы защиты линейных шаблонов от деградации52,53,54. Однако это не касается наличия ограниченных запасов ДНК, производимой поставщиками для амплификации ПЦР, или вопроса о биологическом опыте и оборудовании, необходимом для клонирования.
В этой работе представлен протокол, явно предназначенный для увеличения количества шаблона экспрессии, который может быть получен из небольших количеств фрагментов генов, продуцируемых поставщиком (обычно 500-1000 нг лиофилизированного порошка). Описанный способ не требует навыков, необходимых для выполнения традиционного клонирования в плазмидах или преобразования и распространения в живых клетках. Получив фрагмент гена по почте, пользователь может создать достаточно шаблонов для многих бесклеточных реакций, используя изотермическую амплификацию скользящего круга (RCA)(Рисунок 1)23. Хотя количество ДНК, полученное от поставщика, может быть достаточным для ограниченных усилий по скринингу, оно быстро истощается, а повторная покупка фрагментов генов занимает много времени и стоит дорого. Метод также особенно хорошо подходит для генов, которые токсичны и трудно клонируются у кишечной палочки.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alaline</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium glutamate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>MP21805951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asparagine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic Acid</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen Sealing Film</td>
			<td>Corning</td>
			<td>PCR-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Provided with HindIII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4004</td>
			<td>Used for purifying DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli tRNA</td>
			<td>Sigma (Roche)</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Fragment</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic Acid</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3104L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoleucine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium glutamate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter Plate (384 well)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter Plate (96 well)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy Neo2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPhotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>NP80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylalanine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate</td>
			<td>Sigma (Roche)</td>
			<td>10108294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium oxalate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td>Provided with T4 DNA Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempliPhi Amplification Kit</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>25640010</td>
			<td>Used for RCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>C1000 Touch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoblock</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>ThermoMixer FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threonine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptophan</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U6375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0194</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, enzymatic methods for amplification of minimal, linear templates for protein prototyping using cell-free systems

Этот протокол описывает разработку минимального шаблона ДНК и этапы ферментативной амплификации, что позволяет быстро создавать прототипы анализируемых белков менее чем за 24 ч с использованием бесклеточной экспрессии. После получения ДНК от поставщика фрагмент гена амплифицируется ПЦР, разрезается, циркуляризируется и криобанкируется. Небольшое количество хранимой ДНК затем разбавляют и значительно амплируют (до 106 х)с помощью изотермической амплификации скользящего круга (RCA). RCA может давать микрограммовые количества минимального шаблона экспрессии из пикограммных уровней исходного материала (уровни mg, если используется весь исходный синтетический фрагмент). В этой работе начальное количество 20 пг привело к 4 мкг конечного продукта. Полученный продукт RCA (конкатемер минимального шаблона) может быть добавлен непосредственно в бесклеточную реакцию без этапов очистки. Поскольку этот метод полностью основан на ПЦР, он может обеспечить будущие высокопроизводительные усилия по скринингу в сочетании с автоматизированными системами обработки жидкостей.

Экспрессия sfGFP из шаблонов RCA была сопоставима с экспрессией плазмиды pJL1 при использовании только 0,30 мкл неочищенной RCA-ДНК в реакции 15 мкл(рисунок 2A). Фактически, удвоение и утроение количества шаблона, по-видимому, не приносит никакой пользы в экстракте BL21 DE3 Star, предпола...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems at JoVE.com

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

В исследовании описывается протокол создания больших (мкг-мг) количеств ДНК для кампаний скрининга белка из синтетических фрагментов генов без клонирования или использования живых клеток. Минимальный шаблон ферментативно переваривается и циркулируется, а затем усиливается с помощью изотермического усиления скользящего круга. Реакции бесклеточной экспрессии могут быть выполнены с неочищенным продуктом.

Быстрые ферментативные методы амплификации минимальных линейных шаблонов для прототипирования белка с использованием бесклеточных систем

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...

Этот протокол важен, потому что он подробно описывает, как быстро генерировать большое количество шаблона ДНК для использования в бесклеточных реакциях из небольшого фрагмента гена, полученного из установки синтеза. Амплификация по скользящему кругу может генерировать большое количество ДНК быстрее, чем традиционное клонирование. Таким образом, он поддерживает циклы обучения более высокой пропускной способности проектирования из библиотек синтетической ДНК.Эти методы могут иметь большую вариативность для новых пользователей из-за множества шагов и небольших требуемых объемов. Внимательно следует уделить технике, а практика делает совершенным. Для начала добавьте все компоненты из набора ПЦР в одну ПЦР-трубку.Затем добавьте один микролитр ресуспендированного фрагмента гена. Осторожно гомогенизируйте смесь путем вихря на среде в течение пяти-10 секунд. После программирования термоциклера в соответствии с протоколом производителя комплекта запустите ПЦР.По завершении ПЦР используйте набор для очистки ПЦР для очистки ДНК от реакционной смеси. В пробирке объемом 1,5 миллилитра добавьте буфер связывания ДНК и образец ПЦР в соотношении пять к одному. Перенесите эту смесь в спиновую колонну и центрифугу при 16 000 G в течение одной минуты.Отбросьте поток. Добавьте в колонку 200 микролитров буфера промывки ДНК и высиживайте его при комнатной температуре в течение одной минуты. Снова центрифугируйте колонну и отбросьте проточную.Вымойте колонку еще раз с помощью буфера промывки ДНК, как показано на рисунке. После отбрасывания проточной части от второй промывки удалите оставшийся буфер, центрифугируя колонну в течение дополнительной одной-двух минут. Чтобы элюировать ДНК, перенесите колонку в новую 1,5-миллилитровую трубку.Затем добавьте в колонку 46 микролитров двухдистиллированной воды. После минутной инкубации соберите ДНК в трубку путем центрифугирования. И количественно оценить очищенную ДНК с помощью спектрофотометра.Чтобы переварить и циркуляризировать ДНК, объедините пять микролитров необходимого реакционного буфера, 20 единиц фермента рестрикции HindIII и 45 микролитров очищенной ДНК в трубке ПЦР. Используя пипетку, аккуратно гомогенизируйте эту смесь. Затем высиживают его в термоциклере в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия.После того, как инкубация завершена, тепло инактивирует фермент HindIII путем инкубации в течение 20 минут при 80 градусах Цельсия. Затем добавьте пять микролитров буфера Т4-лигазы и 800 единиц Т4-лигазы к вновь переваренной ДНК. После осторожного смешивания с пипеткой инкубируйте смесь в течение одного часа при температуре 25 градусов Цельсия, чтобы выполнить реакцию циркуляризации.Как только реакция будет завершена, очистите ДНК с помощью набора для очистки ПЦР, как показано ранее. Затем количественно оцените ДНК. Чтобы выполнить усиление круга прокатки, объедините все компоненты реакции и один микролитр очищенного циркулярного экспрессионного шаблона в одной трубке.Гомогенизируйте смесь пипеткой и аликвотой 10 микролитров смеси в четыре отдельные пробирки. Инкубируйте трубки при температуре 30 градусов Цельсия в течение четырех-18 часов, затем нагревайте инактивировать фермент, инкубируя при 65 градусах Цельсия в течение 10 минут. После инактивации тепла поощряйте конденсацию в нижней части трубки, насиживая при 12 градусах Цельсия в течение пяти минут.Далее разбавляют полученный раствор, добавляя в каждую трубку по 15 микролитров двойной дистиллированной воды. Объедините содержимое каждой трубки перед очисткой и количественной оценкой ДНК, как показано ранее. Чтобы выполнить бесклеточную реакцию, добавьте различные необходимые компоненты в трубку и разбавьте до конечного желаемого объема двойную дистиллированную воду.Тщательно перемешайте раствор, пипетируя половину раствора вверх и вниз 10-20 раз. Перенесите реакционную смесь в 15-микролитровых аликвотах в нужные лунки в микротитровой пластине. Затем запечатайте пластину бесцветной уплотнительной пленкой для поддержания влажности и предотвращения испарения.Поместите герметичную пластину в считыватель пластин и дайте реакции пройти до завершения. При экспрессии гена субтилизина BPN с использованием бесклеточной системы аликотируют 94 микролитра двойной дистиллированной воды и один микролитр 10 микромолярной ПНА в плоскодонной бесцветной 96-луночной пластине. Затем добавляют пять микролитров завершенной бесклеточной реакции и считывают пластину с помощью пластинчатого считывателя, установленного для измерения поглощения на 410 нанометров каждые 20 секунд в течение 10 минут при сохранении температуры 25 градусов Цельсия.Экспрессия суперпапки GFP в экстракте звезды BL21 DE3 с использованием только 3 микролитров неочищенной ДНК RCA в 15-микролитровой реакции сопоставима с экспрессидой плазмиды PJL1. Удвоение и утроение количества шаблона, по-видимому, не дает очевидной выгоды, предполагая уже насыщенные уровни шаблона в 3 микролитра на реакцию. И наоборот, увеличение количества шаблона RCA при использовании экстракта клеток перетасовки штамма, по-видимому, имеет преимущество.Белки, требующие более низких температур или более длительного времени складывания, влияют на время, необходимое для завершения всего рабочего процесса. Например, анализ субтилизина после четырех часов экспрессии приводит к неудачному результату, так как четырех часов недостаточно для созревания субтилизина. Однако, позволяя реакции продолжаться до 16 часов, приводит к обнаруживаемым уровням субтилизина.Все компоненты должны быть хорошо перемешаны, чтобы этот протокол работал с максимальной эффективностью. Следуя этим методам, большая библиотека белковых кандидатов может быть сгенерирована синтетически, а затем выражена с достаточным выходом для характеристики. Этот метод проложил путь для нашей группы к разработке N C двух датчиков, которые могут работать в клеточных экстрактах, что позволяет нам быстро охарактеризовать прототип белка.Это позволит нам быстрее и разумнее итерировать белковый дизайн новых биокатализаторов и методов лечения.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Флуоресценция методы обнаружения микрофлюидных платформ капли

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Модели и методы для оценки Перевозка системам по наркотикам Доставка по клеточные барьеры

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

Высокая пропускная Микрофлюидных Быстрое и низкая стоимость создания прототипов Упаковка Методы

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Характеристика сложных систем по постановке эксперимента подхода: Переходный Белок Expression табачными в качестве примера

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Rapid and Low-cost Prototyping of Medical Devices Using 3D Printed Molds for Liquid Injection Molding

Быстрое и дешевое прототипов медицинских устройств с использованием 3D печатных Пресс-формы для литья под давлением жидкости

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Общий протокол для оптимизации производства гетерологичных белка с использованием автоматизированной технологии Microbioreactor

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Ячейки бесплатно белка выражение с использованием быстро растущих бактерией Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Многослойная микрофлюидная платформа для проведения длительного выражения генов без клеток

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

В Vesiculo Синтез прекурсоров пептидной Мембраны для автономного роста Весикл

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Methods for In Vivo Biomechanical Testing on Brachial Plexus in Neonatal Piglets

Methods for In Vivo Biomechanical Testing on Brachial Plexus in Neonatal Piglets

Методы биомеханического тестирования In Vivo на брахиальном сплетении у неонатальных поросяток

Neonatal brachial plexus palsy (NBPP) is a stretch injury that occurs during the birthing process in nerve complexes located in the neck and shoulder ...