Name: rapid, enzymatic methods for amplification of minimal, linear templates for protein prototyping using cell-free systems
Uploaded: 2021-06-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems at JoVE.com

Författarna erkänner NIH 1R35GM138265-01 och NSF 2029532 för partiellt stöd för detta projekt.

1. Designa genfragmentet
OBS: Genfragmentet bör ha alla nödvändiga genetiska element för transkription/översättning, inklusive promotor, ribosombindningsplats (RBS), startkodon, den av intressegenen och terminator. Även om terminatorn inte är nödvändig för en mall för linjärt uttryck (LET), är det viktigt om användaren bestämmer sig för att infoga sekvensen i en plasmid. Dessa sekvenser lyftes från pJL1-sfGFP plasmid55 (gåva från Michael Jewetts labb),...

Genen av intresse kan vara vilket önskat protein som helst, men det är bäst att börja med ett fluorescerande protein som en bekväm reporter för realtids- eller slutpunktsavläsning på en brunnsplatta läsare för nya användare av denna metod. För nya proteinsekvenser, kopiera aminosyrasekvensen av önskat protein och klistra in den i önskat kodonoptimeringsverktyg61,62. Det finns vanligtvis många tillgängliga organismer och stammar av E. coli...

Cellfritt genuttryck (CFE) har vuxit fram som ett kraftfullt verktyg med många tillämpningar. Sådana applikationer inkluderar sjukdomsdetektering1,2,3,4,5,6, mikronäringsämne och småmolekyldetektering7,8,9,10,11,12, biotillverkning13,14,15,16,17 ,18, utbildning19,20,21, tillverkning av svåra proteiner17,22,23,24,25,26,27och variant screening23,28,29,30,31,32 ,33. Detta beror på de cellfria systemens öppna karaktär och den flexibilitet de ger. Många bra recensionsartiklar erbjuder historisk utbildning och framtidsperspektiv på tekniken34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44.
En typisk cellfri reaktion består av tre huvudkomponenter: cellextrakt, energimix och genetisk mall. Aktivt cellextrakt innehåller alla nödvändiga maskiner för transkription och översättning (TXTL) och kan bearbetas på olika sätt36. Glykolytiska intermediärer, elektrolyter, aminosyror och kofaktorer i energimixen stöder TXTL-processen. Det är en stor källa till variabilitet i cellfria experiment45 och kan beredas på många sätt34,46. Förberedelse av den genetiska mallen har sett färre förbättringar eftersom traditionella kloningsmetoder resulterar i plasmider med utmärkta uttrycksegenskaper. Nackdelen med dessa traditionella metoder är den leveranstid och mängd biologisk expertis som behövs för att konstruera och sprida dem. De senaste optimeringsinsatserna har resulterat i enkla 24-timmars arbetsflöden för cellextraktberedning47,48 som kan utföras parallellt med energiblandningsberedning49,50. Traditionell kloning lägger dock till flera dagar på CFE-prototypens tidslinje (tabell 1)23. Snabbt förstärkta PCR-produkter från det kommersiella genfragmentet kan användas direkt51, men detta begränsar antalet prototypexperiment eftersom endast 1 μg DNA produceras, vilket motsvarar cirka fem reaktioner (traditionella 15 μL-volymer). Med dessa ytterligare steg av cirkularisering och isotermisk förstärkning är större än milligram mängder av DNA möjligt (~ 5 000 reaktioner för 1 mg). Detta ökar dramatiskt antalet tester som kan göras vid screening med hög genomströmning av proteiner eller kombinatoriska enzymnätverk (cellfri metabolisk teknik); Det möjliggör också ett effektivt bevarande av det linjära mallbiblioteket som högkoncentrations-DNA. Dessutom skulle en ökad mängd mall vara nödvändig för att prototypa större mängder protein som behövs för materialvetenskapliga tillämpningar (proteinbaserade fibrer och hydrogeler). Vissa begränsningar av linjära mallar kan övervinnas genom att använda ett utdrag från BL21 DE3 Star eller använda nyligen upptäckta metoder för att skydda linjära mallar från nedbrytning52,53,54. Detta gäller dock inte att ha begränsade lager av leverantörsproducerat DNA för pcr-förstärkning eller utfärdande av biologisk expertis och utrustning som behövs för kloning.
Detta arbete presenterar ett protokoll som uttryckligen utformats för att öka mängden uttrycksmall som kan erhållas från små mängder leverantörsproducerade genfragment (vanligtvis 500-1000 ng ng lyofiliserat pulver). Den beskrivna metoden kräver inte de färdigheter som krävs för att utföra traditionell kloning i plasmider eller transformering och förökning i levande celler. När en användare får ett genfragment i posten kan den producera tillräckligt med mallar för många cellfria reaktioner genom att använda isotermisk förstärkning av rullcirkeln (RCA) (figur 1)23. Även om mängden DNA som tas emot från leverantören kan vara tillräckligt för begränsade screeninginsatser, är det snabbt uttömt, och att köpa genfragment igen är tidskrävande och kostsamt. Metoden är också särskilt väl lämpad för gener som är giftiga och svåra att klona i E. coli.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alaline</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium glutamate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>MP21805951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asparagine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic Acid</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen Sealing Film</td>
			<td>Corning</td>
			<td>PCR-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Provided with HindIII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4004</td>
			<td>Used for purifying DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli tRNA</td>
			<td>Sigma (Roche)</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Fragment</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic Acid</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3104L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoleucine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium glutamate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter Plate (384 well)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter Plate (96 well)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy Neo2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPhotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>NP80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylalanine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate</td>
			<td>Sigma (Roche)</td>
			<td>10108294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium oxalate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td>Provided with T4 DNA Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempliPhi Amplification Kit</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>25640010</td>
			<td>Used for RCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>C1000 Touch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoblock</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>ThermoMixer FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threonine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptophan</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U6375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0194</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, enzymatic methods for amplification of minimal, linear templates for protein prototyping using cell-free systems

Detta protokoll beskriver utformningen av en minimal DNA-mall och stegen för enzymatisk förstärkning, vilket möjliggör snabb prototyping av märkbara proteiner på mindre än 24 timmar med hjälp av cellfritt uttryck. Efter att ha fått DNA från en leverantör förstärks, skärs, circulariseras och cryo-bankas genfragmentet. En liten mängd av det bankade DNA:t späds sedan ut och förstärks avsevärt (upp till 106x) med hjälp av isotermisk förstärkning av rullcirkeln (RCA). RCA kan ge mikrogramkvantiteter av den minimala uttrycksmallen från piogramnivåer av startmaterial (mg-nivåer om alla startsyntetiska fragment används). I detta arbete resulterade en startmängd på 20 pg i 4 μg av slutprodukten. Den resulterande RCA-produkten (concatemer av den minimala mallen) kan läggas till direkt till en cellfri reaktion utan reningssteg. På grund av att denna metod är helt PCR-baserad kan den möjliggöra framtida screeninginsatser med hög genomströmning i kombination med automatiserade vätskehanteringssystem.

Uttryck av sfGFP från RCA-mallar var jämförbart med pJL1-plasmidens uttryck vid användning av endast 0,30 μL icke-utstämt RCA-DNA i en 15 μL-reaktion(figur 2A). Faktum är att fördubbling och tredubbling av mängden mall inte verkar erbjuda någon fördel i BL21 DE3 Star extrakt, vilket tyder på redan mättade nivåer av mallen vid 0,30 μL per reaktion. Omvänt verkar det finnas en fördel med att öka mängden RCA-mall när den läggs till cellextrakt som kommer från SHuffle-stam...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems at JoVE.com

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

Studien beskriver ett protokoll för att skapa stora (μg-mg) mängder DNA för proteinscreeningskampanjer från syntetiska genfragment utan kloning eller användning av levande celler. Den minimala mallen smälts och cirkulariseras enzymatiskt och förstärks sedan med hjälp av istermisk förstärkning av rullande cirkel. Cellfria reaktioner kan utföras med den icke-försedda produkten.

Snabba, enzymatiska metoder för förstärkning av minimala, linjära mallar för proteinprototyper med cellfria system

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...

Detta protokoll är betydelsefullt eftersom det beskriver hur man snabbt genererar stora mängder DNA-mall för användning i cellfria reaktioner från ett litet genfragment som mottagits från en syntesanläggning. Förstärkning av rullande cirkel kan generera stora mängder DNA snabbare än traditionell kloning. Så det stöder högre genomströmning design bygga test lära cykler från bibliotek av syntetiskt DNA.Dessa tekniker kan ha stor inneboende variabilitet för nya användare på grund av de många steg och små volymer som krävs. Noggrann uppmärksamhet bör ägnas åt tekniken, och övning gör perfekt. Till att börja med, lägg till alla komponenter från ett PCR-kit i ett enda PCR-rör.Tillsätt sedan en mikroliter av det återupplivna genfragmentet. Homogenisera blandningen försiktigt genom att virvla på en medelhög inställning i fem till tio sekunder. Efter programmering av termocykeln enligt kittillverkarens protokoll, kör PCR.När PCR har slutförts ska du använda ett PCR-rengöringskit för att rena DNA från reaktionsblandningen. Tillsätt DNA-bindningsbufferten och PCR-provet i ett 1,5 milliliter rör i ett 1,5 milliliterrör. Överför denna blandning till spinnkolonnen och centrifugera vid 16 000 gånger G i en minut.Kasta bort flödet genom. Tillsätt 200 mikroliter av DNA-tvättbufferten till kolonnen och inkubera den vid rumstemperatur i en minut. Centrifugera kolonnen igen och kassera genomströmningen.Tvätta kolonnen en gång till med DNA-tvättbufferten, vilket visas. När du har kastat genomströmningen från den andra tvätten, ta bort eventuell återstående buffert genom att centrifugera kolonnen i ytterligare en till två minuter. För att undkomma DNA: t, överför kolonnen till ett nytt 1,5-milliliterrör.Tillsätt sedan 46 mikroliter dubbeldestillerat vatten i kolonnen. Efter en minuts inkubation samlar du in DNA i röret genom centrifugering. Och kvantifiera det renade DNA:t med hjälp av en spektrofotometer.För att smälta och cirkulärisera DNA, kombinera fem mikroliter av den nödvändiga reaktionsbufferten, 20 enheter av HindII-begränsningsenzymet och 45 mikroliter av det renade DNA i ett PCR-rör. Använd en pipett, homogenisera försiktigt denna blandning. Inkubera den sedan i en termocykel i 15 minuter vid 37 grader Celsius.När inkubationen är klar, värm in hindiii enzymet genom att inkubera i 20 minuter vid 80 grader Celsius. Lägg sedan till fem mikroliter T4 Ligase-buffert och 800 enheter T4 Ligase till det nyligen smälta DNA: t. Efter att försiktigt ha blandat med en pipett, inkubera blandningen i en timme vid 25 grader Celsius för att utföra cirkulariseringsreaktionen.När reaktionen är klar, rena DNA med hjälp av ett PCR-rensningskit som visats tidigare. Kvantifiera sedan DNA: t. För att utföra förstärkningen av rullcirkeln, kombinera alla reaktionskomponenter och en mikroliter av den renade cirkulära uttrycksmallen i ett enda rör.Homogenisera blandningen med en pipett och alikvot 10 mikroliter av blandningen i fyra separata rör. Inkubera rören vid 30 grader Celsius i fyra till 18 timmar och värm sedan in enzymet genom att inkubera vid 65 grader Celsius i 10 minuter. Efter värmeinaktivering, uppmuntra kondens i botten av röret genom att inkubera vid 12 grader Celsius i fem minuter.Späd sedan ut den resulterande lösningen genom att tillsätta 15 mikroliter dubbeldestillerat vatten till varje rör. Kombinera innehållet i varje rör innan du renar och kvantifierar DNA:t som visats tidigare. För att utföra den cellfria reaktionen, tillsätt de olika nödvändiga komponenterna i ett rör och späd till den slutliga önskade volymen med dubbeldestillerat vatten.Blanda lösningen noggrant genom att leda halva lösningen upp och ner 10 till 20 gånger. Överför reaktionsblandningen i 15-mikroliter alikvoter till önskade brunnar i mikrotiterplattan. Försegla sedan plattan med en färglös tätningsfilm för att bibehålla fuktigheten och förhindra avdunstning.Placera den förseglade plattan i plattläsaren och låt reaktionen fortsätta till slutförandet. Om du uttrycker subtilisin BPN-genen med hjälp av det cellfria systemet, aliquot 94 mikroliter av dubbeldestillerat vatten och en mikroliter av 10 mikromolar PNA i en platt botten, färglös 96 brunnsplatta. Tillsätt sedan fem mikroliter av den färdiga cellfria reaktionen och läs av plattan med en plattläsare inställd för att mäta absorbansen vid 410 nanometer var 20: e sekund i 10 minuter samtidigt som en temperatur på 25 grader Celsius bibehålls.Uttryck av Superfolder GFP i BL21 DE3 stjärnextrakt med endast 3 mikroliter av ej utsmätt RCA DNA i en 15-mikroliter reaktion är jämförbar med PJL1 plasmid. Fördubbling och tredubbling av mängden mall verkar inte erbjuda någon uppenbar fördel, vilket tyder på redan mättade nivåer av mallen vid 3 mikroliter per reaktion. Omvänt verkar det finnas en fördel med att öka mängden RCA-mall när du använder shuffle stam cell extrakt.Proteiner som kräver lägre temperaturer eller längre vikningstider påverkar den tid som krävs för att slutföra hela arbetsflödet. Till exempel, analysera subtilisin efter fyra timmars uttryck leder till ett misslyckat resultat, eftersom fyra timmar inte räcker för subtilisin mognad. Att tillåta reaktionen att fortsätta till 16 timmar leder dock till detekterbara nivåer av subtilisin.Alla komponenter måste vara väl blandade för att detta protokoll ska fungera maximalt effektivt. Efter dessa metoder kan ett stort bibliotek av proteinkandidater genereras syntetiskt och sedan uttryckas med tillräcklig avkastning för karakterisering. Denna metod banade väg för vår grupp att utveckla N C två sensorer som kan fungera i cellextrakt, så att vi snabbt kan karakterisera prototypproteinet.Detta kommer att göra det möjligt för oss att snabbare och intelligentare iterera på proteindesign av nya biokatalysatorer och terapier.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Fluorescens detektionsmetoder för mikroflödessystem droppe plattformar

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modeller och metoder för att utvärdera Transport av Drug Delivery System Across Cellular Hinder

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Karakterisering av komplexa system Använda Försöks Tillvägagångssätt: Transient Protein Expression i tobak som en fallstudie

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Rapid and Low-cost Prototyping of Medical Devices Using 3D Printed Molds for Liquid Injection Molding

Snabb och billig Prototyping för medicintekniska produkter Använda 3D Tryckt Formar för Liquid Injection Molding

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Generiskt protokoll för optimering av heterologa proteinproduktion med hjälp av automatiserad Microbioreactor teknik

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cellfria Protein uttryck med den snabbt växande bakterien Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

En Multilayer Microfluidic plattform för ledning av långvarig cell-fri genuttryck

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

I Vesiculo syntes av peptid membran prekursorer för autonoma vesikler tillväxt

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Methods for In Vivo Biomechanical Testing on Brachial Plexus in Neonatal Piglets

Methods for In Vivo Biomechanical Testing on Brachial Plexus in Neonatal Piglets

Metoder för in vivo biomekaniska tester på brachial plexus i neonatal smågrisar

Neonatal brachial plexus palsy (NBPP) is a stretch injury that occurs during the birthing process in nerve complexes located in the neck and shoulder ...