Name: mesenchymal stem cell regulation of macrophage phagocytosis; quantitation and imaging
Uploaded: 2021-07-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل آلية أداة البحوث الرئيسية التابعة ل NSF في إطار أعداد المنح 1626093 1919583.

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع تقنيات الإعداد المتوسط وزراعة الخلايا في ظل ظروف مطهرة باستخدام خزانة السلامة البيولوجية مع تدفق الصفيحة. يتم تنفيذ جميع خطوات حضانة الثقافة الموصوفة باستخدام حاضنة مصممة للحفاظ على جو من 37 درجة مئوية و 5٪ CO2و 95٪ رطوبة.
1. ثقافة الخلية
<ol><li>إعداد ...

<ol>
	<li>Phinney, D. G., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Mesenchymal+stem/multipotent+stromal+cells:+The+state+of+transdifferentiation+and+modes+of+tissue+repair--current+views.">Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views.</a> Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).</li><li>Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells:+sensors+and+switchers+of+inflammation.">Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).</li><li>Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells+suppress+donor+CD4(+)+T+cell+proliferation+and+reduce+pathology+in+a+humanized+mouse+model+of+acute+graft-versus-host+disease.">Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease.</a> Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).</li><li>Giuliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+inhibitory+effects+of+fetal+liver+mesenchymal+stem+cells+on+T-lymphocyte+proliferation.">Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation.</a> PLoS One. 6 (5), 19988 (2011).</li><li>Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+induce+apoptosis+of+activated+T+cells.">Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells.</a> Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).</li><li>Luz-Crawford, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+generate+a+CD4+CD25+Foxp3++regulatory+T+cell+population+during+the+differentiation+process+of+Th1+and+Th17+cells.">Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (3), 65 (2013).</li><li>Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mesenchymal+stem+cell+(MSC)+paradigm:+Polarization+into+a+pro-inflammatory+MSC1+or+an+Immunosuppressive+MSC2+phenotype.">A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype.</a> PLoS One. 5 (4), 10088 (2010).</li><li>Nemeth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow+stromal+cells+attenuate+sepsis+via+prostaglandin+E(2)-dependent+reprogramming+of+host+macrophages+to+increase+their+Interleukin-10+production.">marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production.</a> Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).</li><li>Maggini, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+Turn+Activated+Macrophages+into+a+Regulatory-Like+Profile.">Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile.</a> PLoS One. 5 (2), 9252 (2010).</li><li>Takizawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+propagate+immunosuppressive/anti-inflammatory+macrophages+in+cell-to-cell+contact-independent+and-dependent+manners+under+hypoxic+culture.">marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture.</a> Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).</li><li>Kim, J., Hematti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-educated+macrophages:+a+novel+type+of+alternatively+activated+macrophages.">Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages.</a> Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).</li><li>Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+aorta-derived+mesenchymal+progenitor+cells+contribute+to+and+enhance+the+immune+response+of+macrophage+cells+under+inflammatory+conditions.">Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (1), 56 (2015).</li><li>Cho, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+reciprocally+regulate+the+M1/M2+balance+in+mouse+bone+marrow-derived+macrophages.">Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages.</a> Experimental Molecular Medicine. 46, 70 (2014).</li><li>Fernandez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+mesenchymal+progenitor+cells+expressing+adipogenic+and+osteogenic+transcription+factors+suppress+the+macrophage+inflammatory+response.">Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response.</a> Stem Cells International. 2017, 5846257 (2017).</li><li>Jackson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transfer+via+tunneling+nanotubes+is+an+important+mechanism+by+which+mesenchymal+stem+cells+enhance+macrophage+phagocytosis+in+the+in+vitro+and+in+vivo+models+of+ARDS.">Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS.</a> Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).</li><li>Chaplin, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+immune+response.">Overview of the immune response.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), 3-23 (2010).</li><li>Lim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+mechanisms+of+nonopsonic+uptake+of+cryptococci+by+macrophages.">Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages.</a> Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-&#947;+inhibits+nonopsonized+phagocytosis+of+macrophages+via+an+mTORC1-c/EBP+pathway.">Interferon-&#947; inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway.</a> Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).</li><li>Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+assays+with+different+PH-sensitive+fluorescent+particles+and+various+readouts.">Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts.</a> Biotechniques. 68, 245-250 (2020).</li><li>Kapellos, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real+time+imaging+platform+to+quantify+macrophage+pahgocytosis.">A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis.</a> Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).</li><li>Takahashi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitation+of+platelet+phagocytosis+by+monocytes+using+a+pH-sensitive+dye,+pHrodo-SE.">Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE.</a> Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).</li></ol>

تحليل البلعوس باستخدام الجسيمات الحيوية المترافقة مع صبغة حساسة ل درجة الحموضة هو أداة جديدة نسبيا التي أثبتت جدواها على الجسيمات التقليدية المسمى الفلورسنت12،19،20. مع الجسيمات التقليدية ذات العلامات الفلورية ، لا يمكن إجراء سوى تحليل ن?...

الخلايا الجذعية الميكنشيمالية (MSC) هي خلايا سلفية تؤدي إلى خلايا النسيج الضام. MSC موجودة في أنسجة الثدييات الكبار ويمكن عزلها عن نخاع العظام1. بسبب خصائصها المناعية ، تتم دراسة هذه الخلايا على نطاق واسع2. الدراسات المبكرة التي ركزت على تنظيم MSC من الخلايا التائية3،4،5،6 ولكن في الآونة الأخيرة ، وتنظيمها للخلايا الضامة (MΦ) ، وهو عنصر خلوي رئيسي من الحصانة الفطرية ، وقد تلقت اهتماما متزايدا7،8،9،10،11،12،13،14 . أهمية التفاعل MSC-MΦ في علاج مرض التهابي يؤكده حقيقة أن استنفاد monocytes / الضامة يلغي الآثار العلاجية للMSC في النماذج الحيوانية8. هنا، التركيز هو تفاعل اتصال الخلية من MSC مع MΦ. MSC لديها القدرة على تنظيم النمط الظاهري من MΦ من خلال تعزيز التحول من الاستجابات الالتهابية إلى المضادة للالتهابات، مما يؤدي إلى أنشطة إصلاح الأنسجة8،9،10،11، وقد تم القيام بالكثير لإثبات هذه الآليات التنظيمية. في ظل ظروف أخرى، يمكن أن تدعم MSC أو تفاقم استجابة التهابية مدفوعة MΦ12،13 وتعزيز النشاط البلعوي MΦ14،15. ومع ذلك، هناك نقص خطير في البيانات الموجودة التي تحدد الآليات التي بموجبها والظروف التي تنظم MSC النشاط البلعوي MΦ.
MΦ لديها عائلات المستقبلات التي تعترف إما opsonized (الأجسام المضادة أو تكمل المغلفة) أو مسببات الأمراض غير opsonized مما يؤدي إلى البلعوم16. تفعيل ونشاط هذا الأخير هو أقل دراسة جيدة17. في بيئة غير التهابية في المختبر ، تعزز MSC الفوسفات MΦ من مسببات الأمراض غير opsonized13. ومع ذلك ، يمكن تقليل التعرف على مسببات الأمراض غير opsonized بواسطة MΦ بعد التعرض لبيئة التهابية تنتجها الخلايا الليمفاوية أثناء الاستجابة المناعية التكيفية. IFN-γ، التي أطلقتها الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا الليمفاوية التأثير، له تأثير مثبط على MΦ البلعوم من الجسيمات غير opsonized18. تم تطوير نموذج الثقافة المشتركة لدراسة آليات تنظيم الاتصال المباشر MSC من البلعوس MΦ. الهدف من التجربة المعروضة هنا هو تحديد ما إذا كان MSC ينظم MΦ phagocytosis من مسببات الأمراض غير opsonized بعد MΦ قد تعرضت لIFN-γ (الشكل 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well Black Polystyrene Microplate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS3603-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% trypan blue solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>155382PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)&#160;Gibco</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiobserver 7 Imaging System</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A8806-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS3008-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75&#160;cm2, canted neck, with cap, filtered</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>C7231-120EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1 ORL UVA [D1]</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-12424</td>
			<td>Mouse MSC Cell Line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-11.15</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2470</td>
			<td>Mouse M&#934; Cell Line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LADMAC Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2420</td>
			<td>LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-Cell Imaging solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P35365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IFN-&#947;</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>315-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax i3X</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 &#181;m</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>568-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters, 0.2 micrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430167-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mesenchymal stem cell regulation of macrophage phagocytosis; quantitation and imaging

تمت دراسة الخلايا الجذعية الميزنشيمالية (MSC) تقليديا لخصائصها التجديدية ، ولكن في الآونة الأخيرة ، كانت خصائصها المناعية في المقدمة. وهي تتفاعل مع نشاط الخلايا المناعية وتنظمه. ينصب تركيز هذه الدراسة على تنظيم MSC للنشاط البلعوي الضام. الضامة (MΦ) البلعومي هو جزء مهم من استجابة الجهاز المناعي الفطرية للعدوى ، والآليات التي من خلالها تعدل MSC هذه الاستجابة قيد التحقيق النشط. هنا هو وسيلة لدراسة MΦ phagocytosis من الجسيمات غير opsonized zymosan المقترنة جزيء الفلورسنت الحساسة ل درجة الحموضة بينما في الثقافة المشتركة مع MSC. مع زيادة النشاط البلعوسي وانسداد جزيئات الزيموسان المسماة داخل البيئة الحمضية للفسوسوم ، تزداد كثافة الفلورية للجزيء الحساس ل درجة الحموضة. مع الإثارة المناسبة والأطوال الموجية للانبعاثات ، يتم قياس النشاط البلعوسي باستخدام مطياف فلوري ويتم تقديم البيانات الحركية كتغيرات في وحدات الفلورسنت النسبية على مدى فترة 70 دقيقة. ولدعم هذه البيانات الكمية، يتم تصور التغير في النشاط البلعوي باستخدام التصوير الديناميكي. تظهر النتائج باستخدام هذه الطريقة أنه عندما تكون في الثقافة المشتركة ، تعزز MSC الفوسفات MΦ من zymosan غير opsonized من كل من السذاجة وIFN-γ تعامل MΦ. هذه البيانات إضافة إلى المعرفة الحالية لتنظيم MSC من الجهاز المناعي الفطري. ويمكن تطبيق هذه الطريقة في التحقيقات المستقبلية لتحديد الآليات الخلوية والجزيئية الأساسية بشكل كامل.

بعد حساب متوسط ± SEM لكل مجموعة في كافة النقاط الزمنية، يتم تقديم البيانات بتنسيق الرسم البياني الخطي مع محور Y ككثافة الفلورسنت النسبية ومحور X كزين. يقدم الملف التكميلي 1 مثالا على البيانات الخام من قراءة حركية للوحة 96 جيدا في شكل جدول بيانات.
في هذه الدراسة، تظهر ال...

Watch this Scientific Journal Video about Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging at JoVE.com

Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

يقدم هنا بروتوكول لتحديد وإنتاج صور ديناميكية للخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) لتنظيم البلعمة الضامة (MΦ) من جزيئات الخميرة غير opsonized (zymosan) التي يتم اقترانها بجزيء فلوري حساس ل درجة الحموضة.

تنظيم الخلايا الجذعية Mesenchymal من البلعم البلعمي; الكمية والتصوير

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

ستساعد طريقة الثقافة المشتركة هذه في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المحيطة بآليات الاتصال بالخلايا وراء تنظيم الخلايا الجذعية الوسطى لداء البلعم الكلي ، وبالتالي إلقاء الضوء على دور MSC في تنظيم المناعة الفطرية. ويمكن تطبيق هذه التقنية في التحليلات عالية الإنتاجية. الجسيمات الحيوية مترافقة مع الأصباغ الحساسة ل درجة الحموضة الفلور فقط في بيئات phagolysosome الحمضية.وبالتالي، الغسيل والإرواء ضروريان. ويمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على مجموعة متنوعة من نماذج الثقافة المشتركة التي تشمل العدلات وغيرها من الخلايا الفرجية. إثبات الإجراء سيكون إيثان شيتكوف، وهو طالب جامعي حاليا في مختبري.في البداية، لاحظ التقاء الخلايا الجذعية المستزرعة. عندما يتحقق التقاء 70-80٪، يستنشق متوسط النمو من الخلايا المستزرعة في طبق 100 ملليمتر وإضافة خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. بعد أسبيراتينغ برنامج تلفزيوني, إضافة اثنين من ملليلتر من 0.05٪ trypsin EDTA الحل واحتضان الخلايا لمدة ثلاث دقائق.بعد ثلاث دقائق، تحقق من مفرزة الخلية باستخدام مجهر مقلوب. وإذا لم يتم فصل الخلايا، واحتضان لمدة دقيقة إلى دقيقتين مرة أخرى. مرة واحدة يتم فصل جميع الخلايا، إضافة خمسة ملليلتر من متوسط النمو الطازج إلى لوحة.بعد شطف لوحة باستخدام خليط تريبسين المتوسطة، واستخدام ماصة المصلية العقيمة لجمع الخلايا في نظيفة، معقمة 50 ملليلتر أنبوب مخروطي. بعد ذلك ، بيليه أسفل الخلايا عن طريق الطرد المركزي. بعد قرصنة supernatant، resuspend بيليه الخلية في 10 ملليلتر من متوسط النمو الطازج عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا.لحساب الخلية، إضافة 10 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنبوب 1.5 ملليلتر ميكروسينتر الطرد الدقيق التي تحتوي على 30 ميكرولتر من محلول 0.4٪ تريبان الأزرق، ثم إضافة 10 ميكرولتر من الخليط تحت غطاء غرفة عد مقياس الدم. تحت المجهر المقلوب أو برايتفيلد، عد الخلايا غير الملطخة القابلة للحياة باستخدام عدسة هدف 10X وأربع غرف ملليمتر مربع واحد وحساب رقم الخلية كما هو موضح في المخطوطة النصية. استخدم المعادلة C1V1 يساوي C2V2 لتحديد الحجم المطلوب من تعليق الخلايا والمتوسطة الطازجة المطلوبة لإعداد تعليق الخلية بتركيز نهائي من 10 مرات إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر.استخدام micropipetter متعددة القنوات لإضافة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في آبار لوحة 96 جيدا وفقا لتصميم لوحة. استخدام micropipette لإضافة 530 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل واحد من الشريحة الغرفة وفقا لتصميم لوحة واحتضان بين عشية وضحاها. إعداد 10 ملليلتر من وسيط التنشيط التي تحتوي على غاما الإنترفيرون بتركيز 250 نانوغرام لكل ملليلتر لتنشيط خلايا الضامة في طبق واحد 100 ملليمتر.يستنشق متوسط النمو من ثقافات خلايا الضامة ويشطف الخلايا بخمسة ملليلترات من وسيط التنشيط الخالي من أشعة غاما الإنترفيرون. بعد أسبيراتينغ المتوسطة الشطف في الطبق التجريبي، إضافة 10 ملليلتر من تنشيط المتوسطة تكملها أشعة غاما الإنترفيرون. وفي طبق التحكم، أضف 10 ملليلتر من وسيط التنشيط بدون إنترفيرون غاما، ثم احتضن الخلايا لمدة 16 إلى 24 ساعة.في نهاية الحضانة ، لإعداد الثقافات المشتركة ، قم بإزالة وسيط التنشيط من خلايا الضامة وإضافة خمسة ملليلترات من وسيط النمو الطازج. استخدام رافع الخلية لكشط بلطف الخلايا وجمع الخلايا في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. بعد ذلك، عد الخلايا باستخدام استبعاد تريبان الأزرق والخلايا الهيموستومترية، تليها إعداد السيطرة وتعامل تعليق خلايا الضامة بتركيز مرتين 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر كما هو موضح سابقا للخلايا الجذعية mesenchymal.يستنشق بلطف المتوسطة من الآبار التجريبية التي تحتوي على الخلايا الجذعية المتوسطة. استخدام micropipette متعددة القنوات لإضافة 100 ميكرولتر من المعالجة وتعليق خلية الضامة التحكم في الآبار التجريبية المناسبة وفقا لتصميم لوحة واحتضان بين عشية وضحاها كما هو موضح. يستنشق بلطف المتوسطة من الشريحة غرفة أربعة جدران تحتوي على الخلايا الجذعية المتوسطة.استخدام micropipette لإضافة 530 ميكرولتر من تعليق الخلية الضامة إلى الآبار المناسبة وفقا لتصميم واحتضان بين عشية وضحاها. إضافة ملليلتر واحد من الخلايا الحية التصوير المتوسطة إلى القارورة التي تحتوي على ملليغرام واحد من جزيئات Zymosan وجمع خليط الجسيمات المتوسطة في أنبوب زجاج الثقافة. بعد شطف القارورة مع ملليلتر واحد إضافي من محلول التصوير ، قم بنقل وسيط التصوير المشطف في الأنبوب الزجاجي ، ثم أضف ثلاثة ملليلترات من محلول التصوير الإضافي لتحقيق 0.2 ملليغرام لكل تعليق جسيمات Zymosan ملليلتر.دوامة تعليق Zymosan باستخدام نبضات سريعة لمدة 30 إلى 60 ثانية، ثم استخدام سونيكاتور التحقيق ل sonicate التعليق مع 60 نبضة سريعة. بعد قرصنة الوسط، شطف الآبار التجريبية والآبار الفارغة الكاشفة مع 100 ميكرولتر من محلول تصوير الخلايا الحية. بعد ذلك ، يستنشق محلول تصوير الخلايا الحية من الآبار وإضافة 100 ميكرولتر من تعليق Zymosan.افتح درج لوحة القارئ الفلوري باستخدام واجهة لوحة اللمس. ضبط لوحة دون غطاء في علبة مع بئر A1 في الزاوية اليسرى العليا. أغلق الدرج باستخدام لوحة اللمس وانقر على زر القراءة الأخضر في القائمة العلوية.لإجراء فحص البلعوم ، بعد شطف البئر التجريبي الأول مع 750 ميكرولتر من وسيط التصوير ، أضف 400 ميكرولتر من تعليق Zymosan تاركا الآبار المتبقية في وسط النمو. بعد ذلك ، ضع الشريحة على المرحلة المحتضنة من نظام التصوير. استخدم برنامج التصوير.حدد خيار برايتفيلد ضمن علامة التبويب تحديد موقع، ثم انقر فوق أيقونة العدسة. مع الهدف 10X في مكان، واستخدام العدسة ومقبض التركيز للتركيز على الخلايا. حدد علامة التبويب الاستحواذ.افتح القائمة المنسدلة للتجربة وحدد مجموعة من الأطوال الموجية التي تتضمن مرشح EGFP الذي تم تعيينه لاستيعاب 509 نانومتر من الإثارة وأطوال موجية لانبعاثات 533 نانومتر من الصبغة الحساسة لمقياس الحموضة. عندما يتم ترك حوالي دقيقتين على جهاز ضبط الوقت، انقر على رمز 20X في القائمة الهدف لتغيير الهدف إلى 20X، ثم انقر على قائمة القنوات، حدد مرشحات EGFP، وفي قائمة التعرض، تعيين وقت التعرض إلى 400 مللي ثانية للكشف عن الفلوروفوري الأخضر الحساسة لhh، ومن ثم انقر على العيش. بعد ضبط التركيز، انقر على التوقف لإيقاف تشغيل الضوء والتحقق من المربع بجوار الإعداد التجريبي الفاصل الزمني العلوي.في قائمة إستراتيجية التركيز، حدد التركيز التلقائي للبرامج ومن القائمة المنسدلة، حدد الإعدادات الذكية والأساسية لتقليل وقت التعرض للضوء أثناء تشغيل التركيز التلقائي. في القائمة الفاصل الزمني، قم بتعيين العدد المطلوب من عمليات الاستحواذ إلى 30 إلى 60، ووقت الفاصل الزمني إلى دقيقة واحدة، ثم انقر على زر بدء التجربة لبدء عملية الاستحواذ. تمت دراسة تأثير غاما الإنترفيرون على الثقافة المشتركة.تظهر النتائج التمثيلية أن الثقافة المشتركة لل الضامة مع الخلايا الجذعية الميكنشيمالية تعزز النشاط البلعوي للكواميرا. يقلل علاج غاما الإنترفيرون من نشاط الضامة. ومع ذلك ، في وجود الخلايا الجذعية mesenchymal ، تم إنقاذ النشاط البلعوي الضام جزئيا.كثافة الخلايا المثلى حاسمة في هذه الدراسات. وعندما كانت خلايا الضامة مطلية عند مستوى منخفض جدا من الكثافة، لم يتم اكتشاف التغيرات في كثافة الفلورسينس. عندما كانت الخلايا الضامة مطلية بكثافة عالية ، تم رفع كثافة الفلورسينس بسرعة في جميع المجموعات ولم يتم تمييز الاختلافات.واحدة من أهم الأشياء خلال هذا الإجراء هو التأكد من أن كثافة الخلايا هي الأمثل وأبقى متسقة بين التجارب.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital تصوير الغدة الصعترية باستخدام الماوس 2 فوتون الميكروسكوب

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

الخلية الحية المجهرية فيديو البلعمة الممرض الفطرية

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

في الجسم الحي أسلوب التصوير لتميز الالتهاب الحاد والمزمن

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

واسع النطاق تنقية لحم الخنزير أو البقر مبصرة الخارجي قطاعات للالبلعمة فحوصات على خلايا الشبكية صبغات الظهارية

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

تقنية عالية الإنتاجية فلوروميتريك تقييم بلعم البلعمة وأكتين البلمرة

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

بلعم الكولسترول استنفاد وتأثيره على البلعمة من<em&gt; المستخفية المورمة</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

تقييم خصائص المناعية للالوسيطة الإنسان الخلايا الجذعية (اللجان الدائمة)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Organoids كنموذج للأمراض المعدية: ثقافة الإنسان وOrganoids المعدة الفئران وهيليكوباكتر بيلوري Microinjection من

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

الأحماض الدهنية المشبعة الحث على موت الخلايا المرتبطة السيراميد بلعم

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...