Name: mesenchymal stem cell regulation of macrophage phagocytosis; quantitation and imaging
Uploaded: 2021-07-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NSF's mekanisme for større forskningsinstrumenter under tilskudsnumre 1626093 og 1919583.

BEMÆRK: Alle medium forberedelses- og cellekulturteknikker udføres under aseptiske forhold ved hjælp af et biosikkerhedsskab med laminarstrøm. Alle beskrevne kulturinkubationtrapper udføres ved hjælp af en inkubator, der er designet til at opretholde en atmosfære på 37 °C, 5% CO2og 95% fugtighed.
1. Cellekultur
<ol><li>Udarbejdelse af vækstmedium<ol>
<li>For MSC og LADMAC tilsættes 50 mL FBS og 5 mL 100x antibiotisk/antimykotisk blanding til 500 mL høj glukose DMEM.</l...

<ol>
	<li>Phinney, D. G., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Mesenchymal+stem/multipotent+stromal+cells:+The+state+of+transdifferentiation+and+modes+of+tissue+repair--current+views.">Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views.</a> Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).</li><li>Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells:+sensors+and+switchers+of+inflammation.">Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).</li><li>Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells+suppress+donor+CD4(+)+T+cell+proliferation+and+reduce+pathology+in+a+humanized+mouse+model+of+acute+graft-versus-host+disease.">Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease.</a> Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).</li><li>Giuliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+inhibitory+effects+of+fetal+liver+mesenchymal+stem+cells+on+T-lymphocyte+proliferation.">Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation.</a> PLoS One. 6 (5), 19988 (2011).</li><li>Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+induce+apoptosis+of+activated+T+cells.">Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells.</a> Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).</li><li>Luz-Crawford, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+generate+a+CD4+CD25+Foxp3++regulatory+T+cell+population+during+the+differentiation+process+of+Th1+and+Th17+cells.">Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (3), 65 (2013).</li><li>Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mesenchymal+stem+cell+(MSC)+paradigm:+Polarization+into+a+pro-inflammatory+MSC1+or+an+Immunosuppressive+MSC2+phenotype.">A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype.</a> PLoS One. 5 (4), 10088 (2010).</li><li>Nemeth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow+stromal+cells+attenuate+sepsis+via+prostaglandin+E(2)-dependent+reprogramming+of+host+macrophages+to+increase+their+Interleukin-10+production.">marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production.</a> Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).</li><li>Maggini, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+Turn+Activated+Macrophages+into+a+Regulatory-Like+Profile.">Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile.</a> PLoS One. 5 (2), 9252 (2010).</li><li>Takizawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+propagate+immunosuppressive/anti-inflammatory+macrophages+in+cell-to-cell+contact-independent+and-dependent+manners+under+hypoxic+culture.">marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture.</a> Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).</li><li>Kim, J., Hematti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-educated+macrophages:+a+novel+type+of+alternatively+activated+macrophages.">Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages.</a> Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).</li><li>Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+aorta-derived+mesenchymal+progenitor+cells+contribute+to+and+enhance+the+immune+response+of+macrophage+cells+under+inflammatory+conditions.">Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (1), 56 (2015).</li><li>Cho, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+reciprocally+regulate+the+M1/M2+balance+in+mouse+bone+marrow-derived+macrophages.">Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages.</a> Experimental Molecular Medicine. 46, 70 (2014).</li><li>Fernandez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+mesenchymal+progenitor+cells+expressing+adipogenic+and+osteogenic+transcription+factors+suppress+the+macrophage+inflammatory+response.">Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response.</a> Stem Cells International. 2017, 5846257 (2017).</li><li>Jackson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transfer+via+tunneling+nanotubes+is+an+important+mechanism+by+which+mesenchymal+stem+cells+enhance+macrophage+phagocytosis+in+the+in+vitro+and+in+vivo+models+of+ARDS.">Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS.</a> Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).</li><li>Chaplin, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+immune+response.">Overview of the immune response.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), 3-23 (2010).</li><li>Lim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+mechanisms+of+nonopsonic+uptake+of+cryptococci+by+macrophages.">Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages.</a> Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-&#947;+inhibits+nonopsonized+phagocytosis+of+macrophages+via+an+mTORC1-c/EBP+pathway.">Interferon-&#947; inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway.</a> Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).</li><li>Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+assays+with+different+PH-sensitive+fluorescent+particles+and+various+readouts.">Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts.</a> Biotechniques. 68, 245-250 (2020).</li><li>Kapellos, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real+time+imaging+platform+to+quantify+macrophage+pahgocytosis.">A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis.</a> Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).</li><li>Takahashi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitation+of+platelet+phagocytosis+by+monocytes+using+a+pH-sensitive+dye,+pHrodo-SE.">Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE.</a> Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).</li></ol>

Analyse af fagocytose ved hjælp af biopartikler, der er konjugeret til et pH-følsomt farvestof, er et relativt nyt værktøj , der har vist sig fordelagtigt i forhold til traditionelle fluorescerende mærkede partikler12,19,20. Med traditionelle fluorescerende partikler er kun slutpunktsanalyse mulig. Detektionen sker med fluorescerende mikroskopi og/eller spektrofluorometri efter vask eller afkøling af partikler, der ikke er...

Mesenchymale stamceller (MSC) er stamceller, der giver anledning til bindevævsceller. MSC er til stede i voksne pattedyr væv og kan isoleres fra knoglemarven1. På grund af deres immunmodulerende egenskaber studeres disse celler bredt2. Tidlige undersøgelser fokuseret på MSC regulering af T-celler3,4,5,6, men for nylig, deres regulering af makrofag celler (MΦ), en vigtig cellulær komponent i medfødt immunitet, har fået øget opmærksomhed7,8,9,10,11,12,13,14 . Betydningen af MSC-MΦ interaktion i behandlingen af inflammatorisk sygdom understreges af det faktum, at udtømning af monocytter / makrofager ophæver de terapeutiske virkninger af MSC i dyremodeller8. Her er fokus MSC's cellekontaktinteraktion med MΦ. MSC har kapacitet til at regulere fænotypen af MΦ ved at fremme overgangen fra inflammatoriske til antiinflammatoriske reaktioner, hvilket fører til vævsreparationsaktiviteter8,9,10,11, og der er gjort meget for at demonstrere disse reguleringsmekanismer. Under andre omstændigheder kan MSC understøtte eller forværre et MΦ-drevet inflammatorisk respons12,13 og forbedre MΦ-fagocytisk aktivitet14,15. Der er imidlertid en kritisk mangel på eksisterende data, der identificerer de mekanismer, hvorved og de betingelser, hvorunder MSC regulerer MΦ-fagocytisk aktivitet.
MΦ har familier af receptorer, der genkender enten opsoniseret (antistof eller komplementbelagt) eller ikke-opsoniserede patogener, der fører til fagocytose16. Aktiveringen og aktiviteten af sidstnævnte er mindre godt undersøgt17. I et ikke-inflammatorisk in vitro-miljø forbedrer MSC MΦ-fagocytose af ikke-opsoniserede patogener13. Genkendelse af ikke-opsoniserede patogener ved MΦ kan dog reduceres efter eksponering for et inflammatorisk miljø produceret af lymfocytter under et adaptivt immunrespons. IFN-γ, udgivet af naturlige dræberceller og effektorlymfocytter, har en hæmmende virkning på MΦ-fagoccytose af ikke-opsoniserede partikler18. En co-kultur model blev udviklet til at studere mekanismerne i MSC direkte kontakt regulering af MΦ fagocytose. Målet med det eksperiment, der præsenteres her, er at afgøre, om MSC regulerer MΦ-fagocytose af ikke-opsoniserede patogener, efter at MΦ har været udsat for IFN-γ (Figur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well Black Polystyrene Microplate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS3603-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% trypan blue solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>155382PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)&#160;Gibco</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiobserver 7 Imaging System</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A8806-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS3008-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75&#160;cm2, canted neck, with cap, filtered</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>C7231-120EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1 ORL UVA [D1]</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-12424</td>
			<td>Mouse MSC Cell Line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-11.15</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2470</td>
			<td>Mouse M&#934; Cell Line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LADMAC Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2420</td>
			<td>LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-Cell Imaging solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P35365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IFN-&#947;</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>315-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax i3X</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 &#181;m</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>568-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters, 0.2 micrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430167-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mesenchymal stem cell regulation of macrophage phagocytosis; quantitation and imaging

Mesenchymal stamceller (MSC) er traditionelt blevet undersøgt for deres regenerative egenskaber, men for nylig har deres immunregulatoriske egenskaber været på forkant. De interagerer med og regulerer immuncelleaktivitet. Fokus for denne undersøgelse er MSC regulering af makrofags-phagocytisk aktivitet. Makrofag (MΦ) phagocytose er en vigtig del af det medfødte immunsystems reaktion på infektion, og de mekanismer, hvorigennem MSC modulerer dette svar, er under aktiv undersøgelse. Præsenteret her er en metode til at studere MΦ fagocytose af ikke-opsoniserede zymosanpartikler konjugeret til en pH-følsomme fluorescerende molekyle, mens i co-kultur med MSC. Efterhånden som fagocytisk aktivitet øges, og de mærkede zymosanpartikler omsluttes i det sure miljø i fagoclysomaet, øges fluorescensintensiteten af det pH-følsomme molekyle. Med passende excitation og emission bølgelængder måles fagocytisk aktivitet ved hjælp af et fluorescerende spektrofotometer, og kinetiske data præsenteres som ændringer i relative fluorescerende enheder over en 70 min periode. For at understøtte disse kvantitative data visualiseres ændringen i den fagocytiske aktivitet ved hjælp af dynamisk billeddannelse. Resultater ved hjælp af denne metode viser, at når MSC er i co-culture, forbedrer han MΦ-fagocytose af ikke-opsoniseret zymosan af både naiv og IFN-γ behandlet MΦ. Disse data bidrager til den nuværende viden om MSC-regulering af det medfødte immunsystem. Denne metode kan anvendes i fremtidige undersøgelser for fuldt ud at afgrænse de underliggende cellulære og molekylære mekanismer.

Efter beregning af middelværdi ± SEM for hver gruppe på alle tidspunkter, præsenteres dataene i linjegrafformat med Y-aksen som relativ fluorescerende intensitet og X-aksen som Tid. Supplerende fil 1 giver et eksempel på rådata fra en kinetisk læsning af 96-brøndspladen i regnearksformat.
I denne undersøgelse viser de optimale resultater i figur 3Aog tabel 3, at 1) samkultur med MSC forbedrer makrofagets fagocytiske aktiv...

Watch this Scientific Journal Video about Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging at JoVE.com

Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

Præsenteret her er en protokol til at kvantificere og producere dynamiske billeder af mesenchymal stamcelle (MSC) medieret regulering af makrofag (MΦ) fagocytose af ikke-opsonized gær (zymosan) partikler, der er konjugeret til en pH-følsomme fluorescerende molekyle.

Mesenchymal stamcelleregulering af makrofagagocytose; Kvantificering og billeddannelse

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

Denne co-kultur metode vil hjælpe med at besvare centrale spørgsmål omkring cellekontakt mekanismer bag mesenchymal stamcelle regulering af makrofag phagocytose, og derfor belyse den rolle, MSC i reguleringen af medfødt immunitet. Denne teknik kan anvendes i analyser med høj gennemløb. De biopartikler, der kun konjugeres til pH-følsomme farvestoffer, fluorescerer i sure fagoclysomatmiljøer.Derfor er vask og slukning nødvendig. Denne metode kan også anvendes på en række co-kultur modeller, der omfatter neutrofiler og andre fagocytter. At demonstrere proceduren vil være Ethan Chetkof, en bachelor i øjeblikket i mit laboratorium.Til at begynde med skal du observere sammenløbet af kultiverede mesenkymale stamceller. Når 70-80% sammenløb er opnået, aspirere vækstmediet fra de kultiverede celler i en 100 millimeter skål og tilsæt fem milliliter PBS. Efter at have aspireret PBS, tilsættes to milliliter af 0,05% trypsin EDTA-opløsning og inkuberer cellerne i tre minutter.Efter tre minutter kontrolleres cellefordelingen ved hjælp af et omvendt mikroskop. Og hvis cellerne ikke løsnes, inkuberes i et til to minutter igen. Når alle cellerne er afmonteret, tilsæt fem milliliter frisk vækstmedium til pladen.Efter skylning af pladen ved hjælp af trypsin medium blandingen, skal du bruge en steril serologisk pipette til at samle celler i et rent, sterilt 50 milliliter konisk rør. Dernæst pellet ned cellerne ved centrifugering. Efter at have aspireret supernatanten, genbruges cellepillen i 10 milliliter frisk vækstmedium ved forsigtigt at pipetter op og ned.Til celletælling tilsættes 10 mikroliter celleophæng i et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør, der indeholder 30 mikroliter af 0,4% Trypan Blue-opløsning, og tilsæt derefter 10 mikrolitere af blandingen under coverlip af et hæmocytometertællingskammer. Under det omvendte eller Brightfield mikroskop skal du tælle de ikke-farvede levedygtige celler ved hjælp af en 10X objektiv linse og fire en kvadrat millimeter kamre og beregne cellenummeret som beskrevet i tekstmanuskriptet. Brug ligningen C1V1 er lig med C2V2 til at bestemme den ønskede volumen af det friske medium og celle suspension kræves for at forberede celle suspension ved en endelig koncentration på en gange 10 til den femte celler pr milliliter.Brug en multi-kanals mikropipetter til at tilføje 100 mikroliter af celleaffjedringen i brøndene på en 96-brønds plade i henhold til pladedesignet. Brug en mikropipette til at tilføje 530 mikroliter af celleaffjedringen til hver enkelt af kammeret glide i henhold til pladedesignet og inkubere natten over. Forbered 10 milliliter aktiveringsmedium, der indeholder interferon gamma i en koncentration på 250 nanogram pr. milliliter til aktivering af makrofagcellerne i en 100-millimeter skål.Aspirer vækstmediet fra makrofagscellekulturerne og skyl cellerne med fem milliliter af aktiveringsmediet uden interferon gamma. Efter at have aspireret skyllemediet i forsøgsskålen tilsættes 10 milliliter aktiveringsmedium suppleret med interferon gamma. Og i kontrolskålen tilsættes 10 milliliter aktiveringsmedium uden interferon gamma, og inkuber derefter cellerne i 16 til 24 timer.I slutningen af inkubationen, til forberedelse af samkulturerne, skal du fjerne aktiveringsmediet fra makrofagcellerne og tilføje fem milliliter frisk vækstmedium. Brug en celleløfter til forsigtigt at skrabe cellerne og samle cellerne i et 50 milliliter konisk rør. Derefter tælles cellerne ved hjælp af Trypan Blue udelukkelse og hæmocytometri, efterfulgt af forberedelse af kontrol og behandlede makrofag celle suspensioner i koncentrationen af to gange 10 til den femte celler pr milliliter som påvist tidligere for mesenkymale stamceller.Sug forsigtigt mediet fra de eksperimentelle brønde, der indeholder mesenkymale stamceller. Brug en multikanalmikropipette til at tilføje 100 mikroliter af de behandlede og kontrolmakrofagcelleaffjedringerne i de relevante eksperimentelle brønde i henhold til pladedesignet og inkubere natten over som demonstreret. Sug forsigtigt mediet fra den firevæggede kammerrutschebane, der indeholder mesenkymale stamceller.Brug en mikropipette til at tilføje 530 mikroliter af makrofagscelleaffjedringen til de relevante brønde i henhold til design og inkubation natten over. Tilsæt en milliliter af levende cellebilleddannelsesmedium til hætteglasset, der indeholder et milligram Zymosan-partikler, og saml den mellemstore partikelblanding i et glaskulturrør. Efter skylning hætteglasset med en yderligere en milliliter billeddannelse løsning, overføre skyllet billedbehandling medium i glasrøret, derefter tilføje tre milliliter ekstra billeddannelse løsning for at opnå 0,2 milligram per milliliter Zymosan partikel suspension.Vortex den Zymosan suspension ved hjælp af hurtige impulser i 30 til 60 sekunder, derefter bruge en sonde sonicator at sonikere suspensionen med 60 hurtige pulser. Efter indsugning af mediet skylles de eksperimentelle brønde og reagensblynde med 100 mikroliter af levende cellebilledopløsning. Dernæst aspirere den levende celle imaging løsning fra brønde og tilføje 100 mikroliter af Zymosan suspension.Åbn pladebakken på lysstofrøreren ved hjælp af berøringspudegrænsefladen. Sæt pladen uden låget i bakken med A1 brønden i øverste venstre hjørne. Luk bakken ved hjælp af touchpad og klik på den grønne læseknap i den øverste menu.For at gennemføre fagocytoseanalysen tilsættes 400 mikroliter af Zymosan-suspensionen efter at have skyllet den første eksperimentelle brønd med 750 mikroliter af billedmediet. Placer derefter diaset på billedsystemets inkuberede fase. Brug billedbehandlingssoftwaren.Vælg indstillingen Brightfield under fanen Find, og klik derefter på okularikonet. Med 10X målet på plads, skal du bruge okularet og fokus drejeknap til at fokusere på cellerne. Vælg fanen Anskaffelse.Åbn rullemenuen eksperimentet, og vælg et sæt bølgelængder, der indeholder EGFP-filtersæt til at rumme 509 nanometer excitation og 533 nanometer emissionsbølgelængder af det pH-følsomme farvestof. Når der er ca. to minutter tilbage på timeren, skal du klikke på 20X-ikonet i målmenuen for at ændre målsætningen til 20X, derefter klikke på kanalmenuen, vælge EGFP-filtre og i eksponeringsmenuen indstille eksponeringstiden til 400 millisekunder for at registrere det pH-følsomme grønne fluorophore og derefter klikke på live. Når du har justeret fokus, skal du klikke på stop for at slukke lyset og markere afkrydsningsfeltet ud for den eksperimentelle indstilling for den øverste time-lapse.I fokusstrategimenuen skal du vælge automatisk fokus på software og vælge smarte indstillinger og kerneindstillinger i rullemenuen for at reducere tidspunktet for eksponering for lys, mens autofokus kører. I time-lapse-menuen skal du angive det ønskede antal anskaffelser til 30 til 60, intervaltiden til et minut, og klik derefter på knappen Starteksperiment for at starte anskaffelsen. Virkningen af interferon gamma på co-kultur blev undersøgt.De repræsentative resultater viser, at makrofagernes samkultur med mesenkymale stamceller øger makrofagets fagocytiske aktivitet. Interferon gamma behandling reducerer aktiviteten af makrofaget. Men i nærværelse af mesenkymale stamceller blev makrofaget fagocytisk aktivitet delvist reddet.De optimale celletætheder er kritiske i disse undersøgelser. Og når makrofagcellerne var for belagt med for lav densitet, blev ændringer i fluorescensintensiteten ikke opdaget. Når makrofagcellerne blev forgyldt med høj densitet, blev fluorescensintensiteten forhøjet hurtigt i alle grupper, og forskelle blev ikke skelnet.En af de vigtigste ting under denne procedure er at sikre, at celletæthederne optimeres og holdes konsistente mellem eksperimenter.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging af Mouse Thymus med 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Live-cell Video Microscopy af svampepatogen Fagocytose

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

In vivo Imaging metode til at skelne akut og kronisk inflammation

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Large-Scale Oprensning af Svin eller Bovin Lysmodtageren ydre segmenter for fagocytose assays på Retinal Pigment epitelceller

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

High Throughput Fluorometrisk Teknik for Vurdering af makrofag Fagocytose og actinpolymerisation

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Makrofag Kolesterol Udtømmelse og dens indflydelse på fagocytose af<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

Vurdering af immunmodulerende egenskaber af humane mesenchymale stamceller (MSC&#39;er)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Organoids som model for infektionssygdomme: Kultur i humane og murine mave Organoids og Mikroinjektion af Helicobacter pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

Mættede fedtsyrer fremkalde ceramid-associerede makrofag celledød

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...