Name: mesenchymal stem cell regulation of macrophage phagocytosis; quantitation and imaging
Uploaded: 2021-07-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging at JoVE.com

इस कार्य को 1626093 और 1919583 अनुदान संख्या के तहत एनएसएफ मेजर रिसर्च इंस्ट्रूमेंट मैकेनिज्म ने समर्थन दिया था ।

नोट: सभी मध्यम तैयारी और सेल संस्कृति तकनीकों को लेमिनार प्रवाह के साथ जैवसिफेन कैबिनेट का उपयोग करके एसेप्टिक परिस्थितियों में किया जाता है। वर्णित सभी संस्कृति इनक्यूबेशन कदम 37 डिग्री सेल्सियस, 5% स?...

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	<li>Phinney, D. G., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Mesenchymal+stem/multipotent+stromal+cells:+The+state+of+transdifferentiation+and+modes+of+tissue+repair--current+views.">Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views.</a> Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).</li><li>Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells:+sensors+and+switchers+of+inflammation.">Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).</li><li>Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells+suppress+donor+CD4(+)+T+cell+proliferation+and+reduce+pathology+in+a+humanized+mouse+model+of+acute+graft-versus-host+disease.">Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease.</a> Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).</li><li>Giuliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+inhibitory+effects+of+fetal+liver+mesenchymal+stem+cells+on+T-lymphocyte+proliferation.">Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation.</a> PLoS One. 6 (5), 19988 (2011).</li><li>Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+induce+apoptosis+of+activated+T+cells.">Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells.</a> Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).</li><li>Luz-Crawford, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+generate+a+CD4+CD25+Foxp3++regulatory+T+cell+population+during+the+differentiation+process+of+Th1+and+Th17+cells.">Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (3), 65 (2013).</li><li>Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mesenchymal+stem+cell+(MSC)+paradigm:+Polarization+into+a+pro-inflammatory+MSC1+or+an+Immunosuppressive+MSC2+phenotype.">A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype.</a> PLoS One. 5 (4), 10088 (2010).</li><li>Nemeth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow+stromal+cells+attenuate+sepsis+via+prostaglandin+E(2)-dependent+reprogramming+of+host+macrophages+to+increase+their+Interleukin-10+production.">marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production.</a> Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).</li><li>Maggini, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+Turn+Activated+Macrophages+into+a+Regulatory-Like+Profile.">Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile.</a> PLoS One. 5 (2), 9252 (2010).</li><li>Takizawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+propagate+immunosuppressive/anti-inflammatory+macrophages+in+cell-to-cell+contact-independent+and-dependent+manners+under+hypoxic+culture.">marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture.</a> Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).</li><li>Kim, J., Hematti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-educated+macrophages:+a+novel+type+of+alternatively+activated+macrophages.">Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages.</a> Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).</li><li>Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+aorta-derived+mesenchymal+progenitor+cells+contribute+to+and+enhance+the+immune+response+of+macrophage+cells+under+inflammatory+conditions.">Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (1), 56 (2015).</li><li>Cho, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+reciprocally+regulate+the+M1/M2+balance+in+mouse+bone+marrow-derived+macrophages.">Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages.</a> Experimental Molecular Medicine. 46, 70 (2014).</li><li>Fernandez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+mesenchymal+progenitor+cells+expressing+adipogenic+and+osteogenic+transcription+factors+suppress+the+macrophage+inflammatory+response.">Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response.</a> Stem Cells International. 2017, 5846257 (2017).</li><li>Jackson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transfer+via+tunneling+nanotubes+is+an+important+mechanism+by+which+mesenchymal+stem+cells+enhance+macrophage+phagocytosis+in+the+in+vitro+and+in+vivo+models+of+ARDS.">Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS.</a> Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).</li><li>Chaplin, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+immune+response.">Overview of the immune response.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), 3-23 (2010).</li><li>Lim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+mechanisms+of+nonopsonic+uptake+of+cryptococci+by+macrophages.">Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages.</a> Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-&#947;+inhibits+nonopsonized+phagocytosis+of+macrophages+via+an+mTORC1-c/EBP+pathway.">Interferon-&#947; inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway.</a> Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).</li><li>Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+assays+with+different+PH-sensitive+fluorescent+particles+and+various+readouts.">Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts.</a> Biotechniques. 68, 245-250 (2020).</li><li>Kapellos, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real+time+imaging+platform+to+quantify+macrophage+pahgocytosis.">A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis.</a> Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).</li><li>Takahashi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitation+of+platelet+phagocytosis+by+monocytes+using+a+pH-sensitive+dye,+pHrodo-SE.">Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE.</a> Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).</li></ol>

पीएच-सेंसिटिव डाई के लिए संयुग्मित जैव-कणों का उपयोग करके फागोसिटोसिस का विश्लेषण एक अपेक्षाकृत नया उपकरण है जो पारंपरिक फ्लोरोसेंटली लेबलवाले कणों12, 19,20पर लाभप्रद साबित हु?...

मेसेंचिमल स्टेम सेल (एमएससी) जनक कोशिकाएं हैं जो संयोजी ऊतक कोशिकाओं को जन्म देती हैं। एमएससी वयस्क स्तनधारी ऊतकों में मौजूद हैं और बोन मैरो1से अलग किया जा सकता है। उनके इम्यूनोमॉडी गुणों के कारण, इन कोशिकाओं का व्यापक रूप से अध्ययन किया जाता है2। टी-सेल3,4,5,6 के एमएससी नियमन पर केंद्रित प्रारंभिक अध्ययन लेकिन हाल ही में, जन्मजात प्रतिरक्षा के एक प्रमुख सेलुलर घटकमैक्रोफेज कोशिकाओं (MΦ) के उनके नियमन पर ध्यान7, 8,9,10,11,12, 13,14प्राप्त हुआहै। . भड़काऊ रोग के उपचार में एमएससी-MΦ इंटरैक्शन के महत्व को इस तथ्य से रेखांकित किया जाता है कि मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज की कमी पशु मॉडल8में एमएससी के चिकित्सीय प्रभावों को समाप्त कर देती है । यहां फोकस एमएससी की सेल कॉन्टैक्ट इंटरैक्शन विद MΦ है। एमएससी में भड़काऊ से लेकर विरोधी भड़काऊ प्रतिक्रियाओं तक स्विच को बढ़ावा देकर MΦ के फेनोटाइप को विनियमित करने की क्षमता है, जिससे ऊतक मरम्मत गतिविधियां8,9,10, 11हो रही हैं और इन नियामक तंत्रों को प्रदर्शित करने के लिए बहुत कुछ किया गया है । अन्य परिस्थितियों में, एमएससी MΦ संचालित भड़काऊ प्रतिक्रिया12, 13 का समर्थन या बढ़ा सकता है और MΦ फागोसाइटिक गतिविधि14,15को बढ़ा सकता है। हालांकि, मौजूदा आंकड़ों की एक महत्वपूर्ण कमी है जो तंत्र की पहचान करती है जिससे और एमएससी MΦ फैगोसाइटिक गतिविधि को विनियमित करती है ।
MΦ रिसेप्टर्स के परिवार होते हैं जो या तो ओपोनाइज्ड (एंटीबॉडी या पूरक लेपित) या गैर-ओपोनाइज्ड रोगजनकों को पहचानते हैं जिससे फैगोसाइटोसिस16 होताहै। बाद की सक्रियता और गतिविधि का अध्ययन कम अच्छी तरह से किया जाता है17. एक गैर-भड़काऊ इन विट्रो वातावरण में, एमएससी गैर-opsonized रोगजनकों के MΦ फागोसिटोसिस को बढ़ाता है13। हालांकि, MΦ द्वारा गैर-ओपोनाइज्ड रोगजनकों की मान्यता एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दौरान लिम्फोसाइट्स द्वारा उत्पादित भड़काऊ वातावरण के संपर्क में आने के बाद कम हो सकती है। प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं और प्रभावक लिम्फोसाइट्स द्वारा जारी आईएफएन-γ, गैर-opsonized कणों के MΦ फागोसिटोसिस पर एक निरोधात्मक प्रभाव पड़ता है18। MΦ फैगोसाइटोसिस के एमएससी डायरेक्ट कॉन्टैक्ट रेगुलेशन के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक सह-संस्कृति मॉडल विकसित किया गया था। यहां प्रस्तुत प्रयोग का लक्ष्य यह निर्धारित करना है कि एमएससी MΦ गैर-opsonized रोगजनकों के phagocytosis को विनियमित करने के बाद MΦ IFN-γ(चित्रा 1)के संपर्क में आ गया है ।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well Black Polystyrene Microplate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS3603-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% trypan blue solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>155382PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)&#160;Gibco</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiobserver 7 Imaging System</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A8806-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS3008-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75&#160;cm2, canted neck, with cap, filtered</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>C7231-120EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1 ORL UVA [D1]</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-12424</td>
			<td>Mouse MSC Cell Line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-11.15</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2470</td>
			<td>Mouse M&#934; Cell Line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LADMAC Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2420</td>
			<td>LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-Cell Imaging solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P35365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IFN-&#947;</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>315-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax i3X</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 &#181;m</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>568-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters, 0.2 micrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430167-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mesenchymal stem cell regulation of macrophage phagocytosis; quantitation and imaging

मेसेंचिमल स्टेम सेल (एमएससी) पारंपरिक रूप से उनके पुनर्योजी गुणों के लिए अध्ययन किया गया है, लेकिन हाल ही में, उनकी इम्यूनोरेगुलेटरी विशेषताएं सबसे आगे रही हैं। वे प्रतिरक्षा कोशिका गतिविधि के साथ बातचीत करते हैं और उन्हें विनियमित करते हैं। इस स्टडी का फोकस एमएससी रेगुलेशन ऑफ मैक्रोफेज फैगोसाइटिक एक्टिविटी है। मैक्रोफेज (MΦ) फैगोसाइटोसिस संक्रमण के लिए जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली प्रतिक्रिया का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है, और जिन तंत्रों के माध्यम से एमएससी इस प्रतिक्रिया को संशोधित करता है, उनकी सक्रिय जांच की जा रही है। यहां प्रस्तुत एमएससी के साथ सह-संस्कृति में, जबकि पीएच-संवेदनशील फ्लोरोसेंट अणु के लिए संयुग्मित गैर-opsonized zymosan कणों के MΦ phagocytosis का अध्ययन करने के लिए एक विधि है । जैसे-जैसे फैगोसाइटिक गतिविधि बढ़ जाती है और लेबल किए गए ज़िमोसन कण फागोलिसोसोम के अम्लीय वातावरण के भीतर संलग्न होते हैं, पीएच-संवेदनशील अणु की फ्लोरेसेंस तीव्रता बढ़ जाती है। उपयुक्त उत्तेजन और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के साथ, फगोसाइटिक गतिविधि को फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके मापा जाता है और गतिज डेटा को 70 मिनट की अवधि में सापेक्ष फ्लोरोसेंट इकाइयों में परिवर्तन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। इस मात्रात्मक डेटा का समर्थन करने के लिए, फागोसाइटिक गतिविधि में परिवर्तन गतिशील इमेजिंग का उपयोग करके कल्पना की जाती है। इस विधि का उपयोग करने वाले परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि जब सह-संस्कृति में, एमएससी भोले और आईएफएन-γ दोनों के गैर-opsonized zymosan के MΦ फागोसिटोसिस को बढ़ाता है MΦ इलाज किया जाता है। ये आंकड़े जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के एमएससी नियमन के वर्तमान ज्ञान को जोड़ते हैं। इस विधि को अंतर्निहित सेलुलर और आणविक तंत्र को पूरी तरह से चित्रित करने के लिए भविष्य की जांच में लागू किया जा सकता है।

सभी समय बिंदुओं पर प्रत्येक समूह के लिए मतलब ± एसईएम की गणना करने के बाद, डेटा को वाई-एक्सिस के साथ लाइन ग्राफ प्रारूप में सापेक्ष फ्लोरोसेंट तीव्रता और एक्स-एक्सिस के रूप में समय के रूप में प्रस्तुत किय...

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Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

यहां प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल के लिए मात्रा और mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी) मैक्रोफेज (MΦ) गैर opsonized खमीर (zymosan) कणों कि एक पीएच संवेदनशील फ्लोरोसेंट अणु के लिए संयुग्मित है की phagocytosis के विनियमन मध्यस्थता की गतिशील छवियों का उत्पादन है ।

मैक्रोफेज फागोसिटोसिस का मेसेंचिमल स्टेम सेल रेगुलेशन; क्वांटिटेशन और इमेजिंग

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

यह सह-संस्कृति विधि मैक्रोफेज फैगोसाइटोसिस के मेसेनचिमल स्टेम सेल विनियमन के पीछे सेल संपर्क तंत्र के आसपास के प्रमुख सवालों के जवाब देने में मदद करेगी, और इसलिए जन्मजात प्रतिरक्षा को विनियमित करने में एमएससी की भूमिका को रोशन करेगी। इस तकनीक को हाई-थ्रूपुट एनालिसिस में लागू किया जा सकता है। बायोकण केवल अम्लीय फैगोलिसोसोम वातावरण में पीएच-संवेदनशील रंगों फ्लोरोस के लिए संयुग्मित होते हैं।इसलिए धुलाई और शमन जरूरी है। इस विधि को विभिन्न प्रकार के सह-संस्कृति मॉडलों पर भी लागू किया जा सकता है जिसमें न्यूट्रोफिल और अन्य फैगोसाइट्स शामिल हैं। प्रक्रिया का प्रदर्शन एसे Chetkof, मेरी प्रयोगशाला में वर्तमान में एक स्नातक होगा ।शुरू करने के लिए, सुसंस्कृत मेसेंचिमल स्टेम कोशिकाओं की उदारता का निरीक्षण करें। जब 70-80% की नरमी हासिल की जाती है, तो 100 मिलीमीटर डिश में सुसंस्कृत कोशिकाओं से विकास माध्यम को बढ़ाएं और पीबीएस के पांच मिलीलीटर जोड़ें। पीबीएस को एस्पिर करने के बाद, 0.05% ट्राइप्सिन ईडीटीए समाधान के दो मिलीलीटर जोड़ें और कोशिकाओं को तीन मिनट तक इनक्यूबेट करें।तीन मिनट के बाद, एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग कर सेल टुकड़ी की जांच करें। और अगर कोशिकाओं को अलग नहीं कर रहे हैं, एक से दो मिनट के लिए फिर से इनक्यूबेट । एक बार जब सभी कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं, थाली में ताजा विकास माध्यम के पांच मिलीलीटर जोड़ें ।ट्राइप्सिन मध्यम मिश्रण का उपयोग करके प्लेट को धोने के बाद, कोशिकाओं को एक साफ, बाँझ 50 मिलीलीटर शंकु नली में इकट्ठा करने के लिए बाँझ सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें। इसके बाद, अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को नीचे गोली। सुपरनेट को एस्पिर करने के बाद, सेल पेलेट को 10 मिलीलीटर ताजा विकास माध्यम में धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके फिर से खर्च करें।सेल काउंटिंग के लिए, 0.4% ट्राइपैन ब्लू सॉल्यूशन के 30 माइक्रोलीटर युक्त 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में सेल सस्पेंशन के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें, फिर एक हीमोसाइटोमीटर गिनती कक्ष के कवरलिप के तहत मिश्रण के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें। उल्टे या ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप के तहत, 10X उद्देश्य लेंस और ४ १-वर्ग मिलीमीटर कक्षों का उपयोग करके अन दागदार व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें और पाठ पांडुलिपि में वर्णित सेल संख्या की गणना करें । समीकरण C1V1 का उपयोग करें C2V2 के बराबर होती है ताजा माध्यम और सेल निलंबन की वांछित मात्रा निर्धारित करने के लिए एक बार 10 की अंतिम एकाग्रता पर सेल निलंबन तैयार करने के लिए आवश्यक मिलीलीटर प्रति पांचवीं कोशिकाओं के लिए ।प्लेट डिजाइन के अनुसार 96-वेल प्लेट के कुओं में सेल सस्पेंशन के 100 माइक्रोलीटर जोड़ने के लिए मल्टी-चैनल माइक्रोपाइपेटर का उपयोग करें। प्लेट डिजाइन के अनुसार कक्ष स्लाइड के प्रत्येक में सेल निलंबन के 530 माइक्रोलीटर जोड़ने के लिए माइक्रोपिपेट का उपयोग करें और रात भर इनक्यूबेट करें। एक 100 मिलीमीटर डिश में मैक्रोफेज कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए 250 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता पर इंटरफेरॉन गामा युक्त सक्रियण माध्यम के 10 मिलीलीटर तैयार करें।मैक्रोफेज सेल संस्कृतियों से विकास माध्यम को एएसपाइप करें और इंटरफेरॉन गामा से रहित सक्रियण माध्यम के पांच मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को कुल्ला करें। प्रायोगिक पकवान में कुल्ला माध्यम को एस्पिर करने के बाद, इंटरफेरॉन गामा के साथ पूरक सक्रियण माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें। और नियंत्रण पकवान में, इंटरफेरॉन गामा के बिना सक्रियण माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें, फिर कोशिकाओं को 16 से 24 घंटे तक इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन के अंत में, सह-संस्कृतियों को तैयार करने के लिए, मैक्रोफेज कोशिकाओं से सक्रियण माध्यम को हटा दें और नए विकास माध्यम के पांच मिलीलीटर जोड़ें। कोशिकाओं को धीरे-धीरे परिमार्जन करने और कोशिकाओं को 50 मिलीलीटर शंकु नली में इकट्ठा करने के लिए एक सेल लिफ्टर का उपयोग करें। इसके बाद, ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन और हेमोसायॉमेट्री का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें, जिसके बाद नियंत्रण की तैयारी की जाती है और दो गुना 10 की एकाग्रता पर मैक्रोफेज सेल निलंबन का इलाज किया जाता है, जैसा कि पहले मेसेंचिमल स्टेम कोशिकाओं के लिए प्रदर्शित किया गया था।धीरे-धीरे मध्यम को मेसेंचिमल स्टेम कोशिकाओं वाले प्रायोगिक कुओं से हटा दें। प्लेट डिजाइन के अनुसार उचित प्रायोगिक कुओं में उपचारित और नियंत्रण मैक्रोफेज सेल निलंबन के 100 माइक्रोलीटर जोड़ने के लिए एक बहु-चैनल माइक्रोपिपेट का उपयोग करें और प्रदर्शन के अनुसार रात भर इनक्यूबेट करें। धीरे-धीरे चार दीवारों वाले कक्ष स्लाइड से माध्यम को एस्पिरेट करें जिसमें मेसेंचिमल स्टेम सेल होते हैं।डिजाइन के अनुसार उपयुक्त कुओं में मैक्रोफेज सेल सस्पेंशन के 530 माइक्रोलीटर जोड़ने के लिए माइक्रोपिपेट का उपयोग करें और रात भर इनक्यूबेट करें। एक मिलीग्राम Zymosan कणों से युक्त शीशी के लिए लाइव सेल इमेजिंग माध्यम के एक मिलीलीटर जोड़ें और एक गिलास संस्कृति ट्यूब में मध्यम कण मिश्रण इकट्ठा । इमेजिंग समाधान के अतिरिक्त एक मिलीलीटर के साथ शीशी को धोने के बाद, ग्लास ट्यूब में कुल्ला इमेजिंग माध्यम स्थानांतरित करें, फिर 0.2 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर ज़ाइमोसन कण निलंबन प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त इमेजिंग समाधान के तीन मिलीलीटर जोड़ें।भंवर 30 से 60 सेकंड के लिए त्वरित दालों का उपयोग कर Zymosan निलंबन, तो 60 त्वरित दालों के साथ निलंबन सोनीकेट करने के लिए एक जांच ध्वनिक का उपयोग करें। माध्यम को एस्पिर करने के बाद, लाइव सेल इमेजिंग समाधान के 100 माइक्रोलीटर के साथ प्रायोगिक कुओं और रीएजेंट ब्लैंक कुओं को कुल्लाएं। इसके बाद, कुओं से लाइव सेल इमेजिंग समाधान को एस्पिरेट करें और ज़ाइमोसन निलंबन के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें।टच पैड इंटरफेस का उपयोग कर फ्लोरोसेंट रीडर की प्लेट ट्रे खोलें। ऊपरी बाएं कोने में A1 अच्छी तरह से के साथ ट्रे में ढक्कन के बिना थाली सेट करें । टच पैड का इस्तेमाल कर ट्रे बंद करें और टॉप मेन्यू में ग्रीन रीड बटन पर क्लिक करें।फागोसिटोसिस परख का संचालन करने के लिए, इमेजिंग माध्यम के 750 माइक्रोलीटर के साथ पहले प्रायोगिक कुएं को धोने के बाद, शेष कुओं को विकास माध्यम में छोड़ने वाले ज़ीमोसान सस्पेंशन के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें। आगे की स्लाइड में इमेजिंग सिस्टम के इनक्यूबेटेड स्टेज पर रखें। इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।पता लगाने टैब के तहत ब्राइटफील्ड विकल्प का चयन करें, और फिर आईपीस आइकन पर क्लिक करें। जगह में 10X उद्देश्य के साथ, आंख का उपयोग करें और घुंडी ध्यान केंद्रित करने के लिए कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित । अधिग्रहण टैब का चयन करें।प्रयोग ड्रॉपडाउन मेनू खोलें और तरंगदैर्ध्य का एक सेट चुनें जिसमें पीएच-संवेदनशील डाई के 509 नैनोमीटर उत्तेजन और 533 नैनोमीटर उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य को समायोजित करने के लिए EGFP फ़िल्टर सेट शामिल है। जब टाइमर पर लगभग दो मिनट बचे हों, तो उद्देश्य मेनू में 20X आइकन पर क्लिक करें उद्देश्य को 20X में बदल दें, फिर चैनल मेनू पर क्लिक करें, ईजीएफपी फिल्टर का चयन करें, और एक्सपोजर मेनू में, पीएच-संवेदनशील ग्रीन फ्लोरोफोर का पता लगाने के लिए 400 मिलीसेकंड के लिए एक्सपोजर समय निर्धारित करें, और फिर लाइव पर क्लिक करें। फोकस को एडजस्ट करने के बाद लाइट बंद करने के लिए स्टॉप पर क्लिक करें और टॉप टाइम-लैप्स एक्सपेरिमेंटल सेटिंग के बगल में बॉक्स चेक करें ।फोकसिंग स्ट्रैटजी मेन्यू में सॉफ्टवेयर ऑटो फोकस और ड्रॉपडाउन मेन्यू से चुनें, लाइट के एक्सपोजर के समय को कम करने के लिए स्मार्ट और कोर सेटिंग्स का चयन करें जबकि ऑटो फोकस चल रहा है । समय-चूक मेनू में, अधिग्रहण की वांछित संख्या को 30 से 60 तक सेट करें, अंतराल का समय एक मिनट तक, और फिर अधिग्रहण शुरू करने के लिए स्टार्ट प्रयोग बटन पर क्लिक करें। सह-संस्कृति पर इंटरफेरॉन गामा के प्रभाव का अध्ययन किया गया।प्रतिनिधि परिणाम दर्शाते हैं कि मेसेंचिमल स्टेम कोशिकाओं के साथ मैक्रोफेज की सह-संस्कृति मैक्रोफेज की फैगोसाइटिक गतिविधि को बढ़ाती है। इंटरफेरॉन गामा उपचार मैक्रोफेज की गतिविधि को कम करता है। हालांकि, मेसेंचिमल स्टेम सेल की मौजूदगी में मैक्रोफेज फैगोसाइटिक एक्टिविटी को आंशिक रूप से बचाया गया ।इन अध्ययनों में इष्टतम कोशिका घनत्व महत्वपूर्ण हैं। और जब मैक्रोफेज कोशिकाओं को घनत्व के बहुत कम पर चढ़ाया गया था, तो फ्लोरेसेंस तीव्रता में परिवर्तन का पता नहीं चला । जब मैक्रोफेज कोशिकाओं को उच्च घनत्व पर चढ़ाया गया था, तो फ्लोरेसेंस तीव्रता सभी समूहों में तेजी से बढ़ गई थी और मतभेदों को नहीं समझा गया था।इस प्रक्रिया के दौरान सबसे महत्वपूर्ण चीजों में से एक यह सुनिश्चित करना है कि सेल घनत्व को अनुकूलित किया जाए और प्रयोगों के बीच सुसंगत रखा जाए।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

माउस 2-photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग thymus के intravital इमेजिंग

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

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विवो इमेजिंग विधि में तीव्र और जीर्ण सूजन भेद

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं पर Phagocytosis Assays के लिए सुअर या गोजातीय फोटोरिसेप्टर बाहरी क्षेत्रों में बड़े पैमाने पर शुद्धीकरण

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

बृहतभक्षककोशिका Phagocytosis और actin polymerization के आकलन के लिए उच्च Throughput Fluorometric तकनीक

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Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

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बृहतभक्षककोशिका कोलेस्ट्रॉल कमी और के phagocytosis पर उसके प्रभाव<em&gt; क्रिप्टोकोकस neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

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मानव mesenchymal स्टेम सेल की immunomodulatory गुण (MSCs) का आकलन

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

संक्रामक रोगों के लिए मॉडल के रूप में Organoids: हेलिकोबेक्टर के मानव की संस्कृति और murine पेट Organoids और microinjection

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

संतृप्त फैटी एसिड प्रेरित Ceramide-एसोसिएटेड Macrophage कोशिका मृत्यु

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...