Name: mesenchymal stem cell regulation of macrophage phagocytosis; quantitation and imaging
Uploaded: 2021-07-16T14:00:00
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この研究は、NSFの主要な研究機器メカニズムによって、1626093および1919583の助成金の下で支えられた。

注:すべての培地製剤および細胞培養技術は、層流を有するバイオセーフティキャビネットを使用して無菌条件下で行われます。記載されたすべての培養工程は、37°C、5%CO2、および95%湿度の雰囲気を維持するように設計されたインキュベーターを使用して行われる。
1. 細胞培養
<ol><li>成長培地の調製<ol>
<li>MSCとLADMACの場合は、50mLのFBSと100倍の抗生物質/抗ミキテ...

<ol>
	<li>Phinney, D. G., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Mesenchymal+stem/multipotent+stromal+cells:+The+state+of+transdifferentiation+and+modes+of+tissue+repair--current+views.">Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views.</a> Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).</li><li>Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells:+sensors+and+switchers+of+inflammation.">Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).</li><li>Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells+suppress+donor+CD4(+)+T+cell+proliferation+and+reduce+pathology+in+a+humanized+mouse+model+of+acute+graft-versus-host+disease.">Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease.</a> Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).</li><li>Giuliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+inhibitory+effects+of+fetal+liver+mesenchymal+stem+cells+on+T-lymphocyte+proliferation.">Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation.</a> PLoS One. 6 (5), 19988 (2011).</li><li>Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+induce+apoptosis+of+activated+T+cells.">Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells.</a> Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).</li><li>Luz-Crawford, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+generate+a+CD4+CD25+Foxp3++regulatory+T+cell+population+during+the+differentiation+process+of+Th1+and+Th17+cells.">Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (3), 65 (2013).</li><li>Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mesenchymal+stem+cell+(MSC)+paradigm:+Polarization+into+a+pro-inflammatory+MSC1+or+an+Immunosuppressive+MSC2+phenotype.">A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype.</a> PLoS One. 5 (4), 10088 (2010).</li><li>Nemeth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow+stromal+cells+attenuate+sepsis+via+prostaglandin+E(2)-dependent+reprogramming+of+host+macrophages+to+increase+their+Interleukin-10+production.">marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production.</a> Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).</li><li>Maggini, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+Turn+Activated+Macrophages+into+a+Regulatory-Like+Profile.">Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile.</a> PLoS One. 5 (2), 9252 (2010).</li><li>Takizawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+propagate+immunosuppressive/anti-inflammatory+macrophages+in+cell-to-cell+contact-independent+and-dependent+manners+under+hypoxic+culture.">marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture.</a> Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).</li><li>Kim, J., Hematti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-educated+macrophages:+a+novel+type+of+alternatively+activated+macrophages.">Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages.</a> Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).</li><li>Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+aorta-derived+mesenchymal+progenitor+cells+contribute+to+and+enhance+the+immune+response+of+macrophage+cells+under+inflammatory+conditions.">Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (1), 56 (2015).</li><li>Cho, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+reciprocally+regulate+the+M1/M2+balance+in+mouse+bone+marrow-derived+macrophages.">Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages.</a> Experimental Molecular Medicine. 46, 70 (2014).</li><li>Fernandez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+mesenchymal+progenitor+cells+expressing+adipogenic+and+osteogenic+transcription+factors+suppress+the+macrophage+inflammatory+response.">Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response.</a> Stem Cells International. 2017, 5846257 (2017).</li><li>Jackson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transfer+via+tunneling+nanotubes+is+an+important+mechanism+by+which+mesenchymal+stem+cells+enhance+macrophage+phagocytosis+in+the+in+vitro+and+in+vivo+models+of+ARDS.">Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS.</a> Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).</li><li>Chaplin, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+immune+response.">Overview of the immune response.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), 3-23 (2010).</li><li>Lim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+mechanisms+of+nonopsonic+uptake+of+cryptococci+by+macrophages.">Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages.</a> Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-&#947;+inhibits+nonopsonized+phagocytosis+of+macrophages+via+an+mTORC1-c/EBP+pathway.">Interferon-&#947; inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway.</a> Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).</li><li>Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+assays+with+different+PH-sensitive+fluorescent+particles+and+various+readouts.">Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts.</a> Biotechniques. 68, 245-250 (2020).</li><li>Kapellos, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real+time+imaging+platform+to+quantify+macrophage+pahgocytosis.">A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis.</a> Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).</li><li>Takahashi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitation+of+platelet+phagocytosis+by+monocytes+using+a+pH-sensitive+dye,+pHrodo-SE.">Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE.</a> Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).</li></ol>

pH感受性色素に結合した生体粒子を用いた貪食の分析は、従来の蛍光標識粒子12、19、20よりも有利であることが証明された比較的新しいツールである。従来の蛍光標識粒子では、エンドポイント分析のみが可能です。検出は、食細胞によって取り込まれていない粒子を洗浄または消毒した後、蛍光顕微鏡および/または分光...

間葉系幹細胞(MSC)は、結合組織細胞を生み出す前駆細胞です。MSCは、哺乳動物の成人組織に存在し、骨髄1から単離することができる。それらの免疫調節特性のために、これらの細胞は広く研究されている2.初期の研究は、T細胞3、4、5、6のMSC調節に焦点を当てたが、最近では、自然免疫の主要な細胞成分であるマクロファージ細胞(MΦ)の調節が、7、8、9、10、11、12、13、14の注目を集めている.炎症性疾患の治療におけるMSC-MΦ相互作用の重要性は、単球/マクロファージの枯渇が動物モデル8におけるMSCの治療効果を損なうという事実によって強調される。ここで、焦点はMΦとMSCの細胞接触相互作用である。MSCは、炎症反応から抗炎症反応への切り替えを促進することによってMΦの表現型を調節する能力を有し、組織修復活動8、9、10、11に至り、これらの調節メカニズムを実証するために多くが行われている。他の状況下では、MSCはMΦ駆動の炎症反応12、13を支持または悪化させ、MΦ貪食活性14、15を増強することができる。しかし、MSCがMΦ貪食活性を調節するメカニズムと条件を特定する既存のデータが欠けています。
MΦは、オプゾン化(抗体または補体被覆)または食作用に至る非オプソン化病原体のいずれかを認識する受容体のファミリーを有する16。後者の活性化と活動はあまりよく研究されていない17.非炎症性インビトロ環境において、MSCは非オプソン化病原体13のMΦ貪食症を増強する。しかし、MΦによる非オプソナイズ病原体の認識は、適応免疫応答中にリンパ球によって産生される炎症環境への曝露後に減少し得る。天然キラー細胞およびエフェクターリンパ球によって放出されるIFN-γは、非オプソン化粒子18のMΦ貪食症に対して阻害効果を有する。MΦ貪食症のMSC直接接触調節機構を研究するために、共培養モデルが開発された。ここで提示する実験の目的は、MΦがIFN-γにさらされた後にMSCが非オプス化病原体のMΦ貪食症を調節するかどうかを決定することです(図1)。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well Black Polystyrene Microplate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS3603-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% trypan blue solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>155382PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)&#160;Gibco</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiobserver 7 Imaging System</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A8806-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS3008-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75&#160;cm2, canted neck, with cap, filtered</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>C7231-120EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1 ORL UVA [D1]</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-12424</td>
			<td>Mouse MSC Cell Line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-11.15</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2470</td>
			<td>Mouse M&#934; Cell Line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LADMAC Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2420</td>
			<td>LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-Cell Imaging solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P35365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IFN-&#947;</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>315-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax i3X</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 &#181;m</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>568-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters, 0.2 micrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430167-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mesenchymal stem cell regulation of macrophage phagocytosis; quantitation and imaging

間葉系幹細胞(MSC)は、伝統的に再生特性について研究されてきましたが、最近では免疫調節特性が最前線に位置しています。彼らは免疫細胞の活性と相互作用し、調節します。.本研究の焦点は、マクロファージ貪食活動のMSC調節である。マクロファージ(MΦ)貪食症は、感染に対する自然免疫系の反応の重要な部分であり、MSCがこの応答を調節するメカニズムは積極的に調査中である。本明細書に提示される非オプソ化ザイモサン粒子のMΦ食細胞化を研究する方法であり、MSCと共培養中にpH感受性蛍光分子に結合する。食作用活性が増加し、標識されたザイモサン粒子がファゴリソームの酸性環境内に封入されると、pH感受性分子の蛍光強度が高くなる。適切な励起波長と発光波長により、蛍光分光光度計を用いて貪食活性を測定し、70分の間に相対的な蛍光単位の変化として運動データを提示します。この定量的データをサポートするために、食作用活性の変化を動的イメージングを用いて可視化する。この方法を用いた結果は、共培養時に、MSCがナイーブとIFN γの両方の非オプソナイズザイモサンのMΦ貪食症を増強することを示γ MΦを治療した。これらのデータは、自然免疫系のMSC調節の現在の知識に追加されます。この方法は、将来の調査で、基礎となる細胞および分子機構を完全に引き出すために適用することができます。

すべての時間ポイントで各グループの平均±SEMを計算した後、データはY軸を相対蛍光強度、X軸を時間として折れ線グラフ形式で表示します。 補足ファイル 1 は、96 ウェルプレートのキネティック読み取りからスプレッドシート形式での生データの例を提供します。
本研究では、図3Aおよび表3に示す最適な結果は、1)MSCとの...

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Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

ここで提示されるプロトコルは、pH感受性蛍光分子に結合された非オプゾン化酵母(zymosan)粒子のマクロファージ(MΦ)食作用の間葉幹細胞(MSC)媒介性調節の動的画像を定量化し、生成するプロトコルです。

間葉系幹細胞のマクロファージ食前細胞の調節;定量とイメージング

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

この共培養法は、間葉系幹細胞調節のマクロファージ食細胞調節の背後にある細胞接触機構を取り巻く主要な質問に答え、したがって、自然免疫を調節するMSCの役割を明示するのに役立ちます。この手法は、ハイスループット分析で適用できます。pH感受性の色素に結合した生体粒子は、酸性ファゴリソソーム環境でのみ蛍光を発する。そのため、洗浄と焼入れが必要です。この方法は、好中球および他の食細胞を含む様々な共培養モデルにも適用することができる。この手順のデモンストレーションは、現在私の研究室の学部生であるイーサン・チェトコフです。まず、培養間葉系幹細胞の合流性を観察する。70~80%の合流が達成されると、培養細胞から培養液を100ミリメートル皿に吸引し、5ミリリットルのPBSを加える。PBSを吸引した後、0.05%トリプシンEDTA溶液の2ミリリットルを加え、細胞を3分間インキュベートします。3分後、逆顕微鏡を使って細胞剥離を確認します。そして、細胞が剥離されていない場合は、再び1〜2分間インキュベートします。すべての細胞が切り離されたら、5ミリリットルの新鮮な成長培地をプレートに加えます。トリプシン培地混合物を使用してプレートをすすった後、無菌血清ピペットを使用して、清潔で無菌の50ミリリットル円錐形チューブに細胞を収集します。次に、遠心分離により細胞をペレットダウンさせる。上清を吸引した後、細胞ペレットを上下に軽くピペット化して10ミリリットルの新鮮な成長培地で再懸濁する。セルカウントの場合、0.4%のトリパンブルー溶液の30マイクロリットルを含む1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管に10マイクロリットルの細胞懸濁液を加え、その後、ヘモサイトメーター計のカバースリップの下に10マイクロリットルの混合物を加えます。反転顕微鏡またはブライトフィールド顕微鏡の下で、10X対物レンズと4つの1平方ミリメートル室を使用して染色されていない生存細胞を数え、テキスト原稿に記載されているように細胞数を計算します。C1V1はC2V2と等しい式を使用して、1ミリリットル当たり5番目の細胞に10〜5番目の細胞の最終濃度で細胞懸濁液を調製するために必要な新鮮な培地および細胞懸濁液の所望の体積を決定する。マルチチャンネルマイクロピペッタを使用して、プレート設計に従って96ウェルプレートのウェルに100マイクロリットルの細胞懸濁液を追加します。マイクロピペットを使用して、プレート設計に従ってチャンバースライドの各1つに細胞懸濁液の530マイクロリットルを加え、一晩インキュベートします。100ミリメートル皿でマクロファージ細胞を活性化するために、1ミリリットル当たり250ナノグラムの濃度でインターフェロンガンマを含む活性化培地の10ミリリットルを調製する。マクロファージ細胞培養物から増殖培地を吸引し、インターフェロンガンマを欠いた活性化培地を5ミリリットルで細胞をすすくする。実験皿の中でリンス培地を吸引した後、インターフェロンガンマを補った活性化培地を10ミリリットル添加する。そして、コントロールディッシュに、インターフェロンガンマなしで10ミリリットルの活性化培地を加え、16〜24時間細胞をインキュベートする。インキュベーションの終わりに、共培養を調製するために、マクロファージ細胞から活性化培地を取り出し、新鮮な増殖培地を5ミリリットル添加する。セルリフターを使用して細胞を優しく削り取り、50ミリリットルの円錐管に細胞を集めます。次に、トリパンブルー排除および血球測定を用いて細胞を数え、続いて、間葉系幹細胞について先に示したように、1ミリリットル当たり2倍の10〜5番目の細胞の濃度でマクロファージ細胞懸濁液を調製し、処置した。間葉系幹細胞を含む実験井戸から培地を穏やかに吸引する。マルチチャネルマイクロピペットを使用して、100マイクロリットルの処理物を添加し、かつ、プレート設計に従って適切な実験井戸に制御マクロファージ細胞懸濁液を加え、実証したように一晩インキュベートする。間葉系幹細胞を含む四壁のチャンバースライドから培地を穏やかに吸引する。マイクロピペットを使用して、530マイクロリットルのマクロファージ細胞懸濁液を適切なウェルに追加し、一晩インキュベートします。1ミリグラムのZymosan粒子を含むバイアルに生細胞イメージング培地を1ミリリットル加え、培地粒子混合物をガラス培養チューブに集める。さらに1ミリリットルのイメージング溶液でバイアルをすすった後、ガラスチューブにリンスイメージング媒体を移し、3ミリリットルのイメージング溶液を追加して、1ミリリットルのZymosan粒子懸濁液あたり0.2ミリグラムを達成する。30〜60秒間クイックパルスを使用してZymosanサスペンションをボルテックスし、プローブ超音波処理器を使用して60のクイックパルスでサスペンションを超音波処理します。培地を吸引した後、実験井戸と試薬ブランクウェルを100マイクロリットルの生細胞イメージング溶液でリンスします。次に、生細胞イメージング溶液をウェルから吸引し、100マイクロリットルのZymosan懸濁液を加える。タッチパッドインターフェイスを使用して、蛍光リーダーのプレートトレイを開きます。トレイの蓋を付けずにプレートを左上にA1ウェルにセットします。タッチパッドを使用してトレイを閉じ、トップメニューの緑色の読み取りボタンをクリックします。食塩基性アッセイを行うために、イメージング培地の750マイクロリットルで第1の実験をよくすすった後、残りのウェルを成長培地に残して400マイクロリットルのZymosan懸濁液を加える。次に、撮像システムのインキュベート段階にスライドを置きます。イメージング ソフトウェアを使用します。[探す] タブの [明るいフィールド] オプションを選択し、接眼アイコンをクリックします。10Xの目的を所定の位置に置いて、接眼レンズとフォーカスノブを使用して細胞に焦点を当てます。取得タブを選択します。実験ドロップダウンメニューを開き、509ナノメートルの励起とpH感受性色素の533ナノメートルの発光波長に対応するように設定されたEGFPフィルタを含む波長のセットを選択します。タイマーに約2分残っている場合は、目的メニューの20Xアイコンをクリックして目的を20Xに変更し、チャンネルメニューをクリックしてEGFPフィルタを選択し、露出メニューでpH感受性の緑色のフルオロフォアを検出するために露出時間を400ミリ秒に設定し、ライブでクリックします。フォーカスを調整した後、停止をクリックしてライトをオフにし、トップタイムラプス実験設定の横にあるチェックボックスをオンにします。フォーカス戦略メニューでソフトウェアのオートフォーカスを選択し、ドロップダウンメニューからスマート設定とコア設定を選択して、オートフォーカスの実行中の光への露出時間を短縮します。タイムラプスメニューで、必要な取得数を30~60、間隔を1分に設定し、実験開始ボタンをクリックして取得を開始します。インターフェロンガンマの共培養に及ぼす影響を検討した。本代表結果は、間葉系幹細胞とマクロファージの共培養がマクロファージの貪食活性を高めることを示す。インターフェロンガンマ治療は、マクロファージの活性を低下させる。しかし、間葉系幹細胞の存在下では、マクロファージ貪食活性が部分的に救出された。これらの研究では、最適な細胞密度が重要です。また、マクロファージ細胞が低密度でめっきされた場合、蛍光強度の変化は検出されなかった。マクロファージ細胞を高密度でめっきした場合、蛍光強度は全群で急速に上昇し、差異は見分けができなかった。この手順で最も重要なことの 1 つは、細胞密度が最適化され、実験間で一貫性を保つようにすることです。

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Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

網膜色素上皮細胞に貪食アッセイのためにブタまたはウシの感光体外側セグメントの大規模精製

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

マクロファージ食作用およびアクチン重合の評価のためのハイスループット蛍光技術

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

マクロファージコレステロール枯渇との食作用への影響<em&gt;クリプトコックス·ネオフォルマンス</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

ヒト間葉系幹細胞（MSC）の免疫調節特性の評価

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

感染症のためのモデルとしてのオルガノイド：人間の文化とマウス胃オルガノイドとピロリ菌のマイクロインジェクション

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

飽和脂肪酸は、セラミド関連マクロファージの細胞死を誘導します。

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...