Name: mesenchymal stem cell regulation of macrophage phagocytosis; quantitation and imaging
Uploaded: 2021-07-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por el mecanismo del Instrumento Principal de Investigación de la NSF bajo los números de subvención 1626093 y 1919583.

NOTA: Todas las técnicas de preparación de medios y cultivo celular se llevan a cabo en condiciones asépticas utilizando un gabinete de bioseguridad con flujo laminar. Todas las etapas de incubación del cultivo descritas se llevan a cabo utilizando una incubadora diseñada para mantener una atmósfera de 37 ° C, 5% de CO2y 95% de humedad.
1. Cultivo celular
<ol><li>Preparación del medio de crecimiento<ol>
<li>Para MSC y LADMAC, agregue 50 ml de FBS y 5 ml de mezcla de antibi...

<ol>
	<li>Phinney, D. G., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Mesenchymal+stem/multipotent+stromal+cells:+The+state+of+transdifferentiation+and+modes+of+tissue+repair--current+views.">Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views.</a> Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).</li><li>Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells:+sensors+and+switchers+of+inflammation.">Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).</li><li>Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells+suppress+donor+CD4(+)+T+cell+proliferation+and+reduce+pathology+in+a+humanized+mouse+model+of+acute+graft-versus-host+disease.">Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease.</a> Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).</li><li>Giuliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+inhibitory+effects+of+fetal+liver+mesenchymal+stem+cells+on+T-lymphocyte+proliferation.">Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation.</a> PLoS One. 6 (5), 19988 (2011).</li><li>Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+induce+apoptosis+of+activated+T+cells.">Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells.</a> Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).</li><li>Luz-Crawford, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+generate+a+CD4+CD25+Foxp3++regulatory+T+cell+population+during+the+differentiation+process+of+Th1+and+Th17+cells.">Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (3), 65 (2013).</li><li>Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mesenchymal+stem+cell+(MSC)+paradigm:+Polarization+into+a+pro-inflammatory+MSC1+or+an+Immunosuppressive+MSC2+phenotype.">A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype.</a> PLoS One. 5 (4), 10088 (2010).</li><li>Nemeth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow+stromal+cells+attenuate+sepsis+via+prostaglandin+E(2)-dependent+reprogramming+of+host+macrophages+to+increase+their+Interleukin-10+production.">marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production.</a> Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).</li><li>Maggini, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+Turn+Activated+Macrophages+into+a+Regulatory-Like+Profile.">Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile.</a> PLoS One. 5 (2), 9252 (2010).</li><li>Takizawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+propagate+immunosuppressive/anti-inflammatory+macrophages+in+cell-to-cell+contact-independent+and-dependent+manners+under+hypoxic+culture.">marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture.</a> Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).</li><li>Kim, J., Hematti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-educated+macrophages:+a+novel+type+of+alternatively+activated+macrophages.">Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages.</a> Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).</li><li>Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+aorta-derived+mesenchymal+progenitor+cells+contribute+to+and+enhance+the+immune+response+of+macrophage+cells+under+inflammatory+conditions.">Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (1), 56 (2015).</li><li>Cho, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+reciprocally+regulate+the+M1/M2+balance+in+mouse+bone+marrow-derived+macrophages.">Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages.</a> Experimental Molecular Medicine. 46, 70 (2014).</li><li>Fernandez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+mesenchymal+progenitor+cells+expressing+adipogenic+and+osteogenic+transcription+factors+suppress+the+macrophage+inflammatory+response.">Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response.</a> Stem Cells International. 2017, 5846257 (2017).</li><li>Jackson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transfer+via+tunneling+nanotubes+is+an+important+mechanism+by+which+mesenchymal+stem+cells+enhance+macrophage+phagocytosis+in+the+in+vitro+and+in+vivo+models+of+ARDS.">Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS.</a> Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).</li><li>Chaplin, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+immune+response.">Overview of the immune response.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), 3-23 (2010).</li><li>Lim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+mechanisms+of+nonopsonic+uptake+of+cryptococci+by+macrophages.">Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages.</a> Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-&#947;+inhibits+nonopsonized+phagocytosis+of+macrophages+via+an+mTORC1-c/EBP+pathway.">Interferon-&#947; inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway.</a> Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).</li><li>Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+assays+with+different+PH-sensitive+fluorescent+particles+and+various+readouts.">Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts.</a> Biotechniques. 68, 245-250 (2020).</li><li>Kapellos, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real+time+imaging+platform+to+quantify+macrophage+pahgocytosis.">A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis.</a> Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).</li><li>Takahashi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitation+of+platelet+phagocytosis+by+monocytes+using+a+pH-sensitive+dye,+pHrodo-SE.">Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE.</a> Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).</li></ol>

El análisis de la fagocitosis utilizando biopartículas conjugadas a un colorante sensible al pH es una herramienta relativamente nueva que ha demostrado ser ventajosa sobre las partículas tradicionales etiquetadas con fluorescentes12,19,20. Con las partículas tradicionales etiquetadas con fluorescentes, solo es factible el análisis de punto final. La detección se realiza con microscopía fluorescente y/o espectrofluorometr...

Las células madre mesenquimales (MSC) son células progenitoras que dan lugar a células de tejido conectivo. Los MSC están presentes en tejidos de mamíferos adultos y se pueden aislar de la médula ósea1. Debido a sus propiedades inmunomoduladoras, estas células son ampliamente estudiadas2. Los primeros estudios se centraron en la regulación MSC de las células T3,4,5,6, pero más recientemente, su regulación de las células macrófagos (MΦ), un componente celular importante de la inmunidad innata, ha recibido una mayor atención7,8,9,10,11,12,13,14 . La importancia de la interacción MSC-MΦ en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria se ve subrayada por el hecho de que el agotamiento de monocitos/macrófagos abroga los efectos terapéuticos de MSC en modelos animales8. Aquí, el foco es la interacción de contacto celular del MSC con MΦ. Los MSC tienen la capacidad de regular el fenotipo de MΦ promoviendo el cambio de respuestas inflamatorias a antiinflamatorias, lo que lleva a actividades de reparación de tejidos8,9,10,11,y se ha hecho mucho para demostrar estos mecanismos reguladores. En otras circunstancias, MSC puede apoyar o exacerbar una respuesta inflamatoria impulsada por MΦ12,13 y mejorar la actividad fagocítica de MΦ14,15. Sin embargo, existe una falta crítica de datos existentes que identifiquen los mecanismos y las condiciones bajo las cuales MSC regula la actividad fagocítica MΦ.
Los MΦ tienen familias de receptores que reconocen patógenos opsonizados (recubiertos de anticuerpos o complemento) o no opsonizados que conducen a la fagocitosis16. La activación y actividad de este último está menos estudiada17. En un ambiente in vitro no inflamatorio, los MSC mejoran la fagocitosis MΦ de patógenos no opsonizados13. Sin embargo, el reconocimiento de patógenos no opsonizados por MΦ puede reducirse después de la exposición a un ambiente inflamatorio producido por linfocitos durante una respuesta inmune adaptativa. El IFN-γ, liberado por las células asesinas naturales y los linfocitos efectores, tiene un efecto inhibidor sobre la fagocitosis MΦ de partículas no opsonizadas18. Se desarrolló un modelo de coculto para estudiar los mecanismos de regulación del contacto directo MSC de la fagocitosis MΦ. El objetivo del experimento presentado aquí es determinar si los MSC regulan la fagocitosis MΦ de patógenos no opsonizados después de que MΦ haya sido expuesto al IFN-γ(Figura 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well Black Polystyrene Microplate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS3603-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% trypan blue solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>155382PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)&#160;Gibco</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiobserver 7 Imaging System</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A8806-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS3008-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75&#160;cm2, canted neck, with cap, filtered</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>C7231-120EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1 ORL UVA [D1]</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-12424</td>
			<td>Mouse MSC Cell Line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-11.15</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2470</td>
			<td>Mouse M&#934; Cell Line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LADMAC Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2420</td>
			<td>LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-Cell Imaging solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P35365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IFN-&#947;</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>315-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax i3X</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 &#181;m</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>568-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters, 0.2 micrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430167-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mesenchymal stem cell regulation of macrophage phagocytosis; quantitation and imaging

Las células madre mesenquimales (MSC) se han estudiado tradicionalmente por sus propiedades regenerativas, pero más recientemente, sus características inmunorreguladoras han estado a la vanguardia. Interactúan y regulan la actividad de las células inmunes. El enfoque de este estudio es la regulación MSC de la actividad fagocítica de los macrófagos. La fagocitosis de macrófagos (MΦ) es una parte importante de la respuesta del sistema inmune innato a la infección, y los mecanismos a través de los cuales msc modulan esta respuesta están bajo investigación activa. Aquí se presenta un método para estudiar la fagocitosis MΦ de partículas de zymosan no opsonizadas conjugadas a una molécula fluorescente sensible al pH mientras están en coculto con MSC. A medida que aumenta la actividad fagocítica y las partículas de zymosan etiquetadas están encerradas dentro del ambiente ácido del faglisosoma, la intensidad de fluorescencia de la molécula sensible al pH aumenta. Con las longitudes de onda de excitación y emisión apropiadas, la actividad fagocítica se mide utilizando un espectrofotómetro fluorescente y los datos cinéticos se presentan como cambios en las unidades fluorescentes relativas durante un período de 70 minutos. Para apoyar estos datos cuantitativos, el cambio en la actividad fagocítica se visualiza utilizando imágenes dinámicas. Los resultados que utilizan este método demuestran que cuando se está en coculto, msc mejora la fagocitosis MΦ de la zymosan no opsonizada de MΦ tanto naïve como IFN-γ tratada. Estos datos se suman al conocimiento actual de la regulación MSC del sistema inmune innato. Este método se puede aplicar en futuras investigaciones para delinear completamente los mecanismos celulares y moleculares subyacentes.

Después de calcular la media ± SEM para cada grupo en todos los puntos de tiempo, los datos se presentan en formato de gráfico de líneas con el eje Y como la intensidad fluorescente relativa y el eje X como tiempo. El archivo complementario 1 proporciona un ejemplo de datos sin procesar de una lectura cinética de la placa de 96 pozos en formato de hoja de cálculo.
En este estudio, los resultados óptimos presentados en la Figura 3Ay ...

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Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

Aquí se presenta un protocolo para cuantificar y producir imágenes dinámicas de la regulación mediada por células madre mesenquimales (MSC) de la fagocitosis de macrófagos (MΦ) de partículas de levadura no opsonizada (zymosan) que se conjugan con una molécula fluorescente sensible al pH.

Regulación de células madre mesenquimales de la fagocitosis de macrófagos; Cuantificación e imágenes

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

Este método de coculto ayudará a responder preguntas clave sobre los mecanismos de contacto celular detrás de la regulación de las células madre mesenquimales de la fagocitosis de macrófagos y, por lo tanto, iluminará el papel de MSC en la regulación de la inmunidad innata. Esta técnica se puede aplicar en análisis de alto rendimiento. Las biopartículas conjugadas con colorantes sensibles al pH fluorescencia solo en ambientes de faglisosomas ácidos.Por lo tanto, el lavado y el enfriamiento son necesarios. Este método también se puede aplicar a una variedad de modelos de coculto que incluyen neutrófilos y otros fagocitos. Demostrando el procedimiento estará Ethan Chetkof, un estudiante universitario actualmente en mi laboratorio.Para empezar, observe la confluencia de células madre mesenquimales cultivadas. Cuando se alcanza una confluencia del 70-80%, aspire el medio de crecimiento de las células cultivadas en un plato de 100 milímetros y agregue cinco mililitros de PBS. Después de aspirar el PBS, agregue dos mililitros de solución de EDTA de tripsina al 0,05% e incube las células durante tres minutos.Después de tres minutos, verifique el desprendimiento celular con un microscopio invertido. Y si las células no están separadas, incube durante uno o dos minutos nuevamente. Una vez que todas las células estén separadas, agregue cinco mililitros de medio de crecimiento fresco a la placa.Después de enjuagar la placa con la mezcla de medio de tripsina, use una pipeta serológica estéril para recolectar células en un tubo cónico limpio y estéril de 50 mililitros. A continuación, peletizar las células por centrifugación. Después de aspirar el sobrenadante, vuelva a colocar la gránula celular en 10 mililitros de medio de crecimiento fresco mediante el pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo.Para el conteo celular, agregue 10 microlitros de suspensión celular en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros que contenga 30 microlitros de solución de Trypan Blue al 0.4%, luego agregue 10 microlitros de la mezcla debajo de la cubierta de una cámara de conteo del hemocitómetro. Bajo el microscopio invertido o Brightfield, cuente las células viables no teñidas utilizando una lente de objetivo 10X y cuatro cámaras de un milímetro cuadrado y calcule el número de células como se describe en el manuscrito de texto. Utilice la ecuación C1V1 igual a C2V2 para determinar el volumen deseado del medio fresco y la suspensión celular necesaria para preparar la suspensión celular a una concentración final de una vez 10 a la quinta célula por mililitro.Use un micropipetador multicanal para agregar 100 microlitros de la suspensión celular en los pozos de una placa de 96 pozos de acuerdo con el diseño de la placa. Use una micropipeta para agregar 530 microlitros de la suspensión celular a cada uno de los portaobjetos de la cámara de acuerdo con el diseño de la placa e incube durante la noche. Preparar 10 mililitros de medio de activación que contenga interferón gamma a una concentración de 250 nanogramos por mililitro para activar las células de macrófagos en un plato de 100 milímetros.Aspire el medio de crecimiento de los cultivos de células macrófagos y enjuague las células con cinco mililitros del medio de activación desprovisto de interferón gamma. Después de aspirar el medio de enjuague en el plato experimental, agregue 10 mililitros de medio de activación suplementado con interferón gamma. Y en el plato de control, agregue 10 mililitros de medio de activación sin interferón gamma, luego incube las células durante 16 a 24 horas.Al final de la incubación, para preparar los cocultivos, retire el medio de activación de las células de macrófagos y agregue cinco mililitros de medio de crecimiento fresco. Use un elevador de células para raspar suavemente las células y recolectar las células en un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, cuente las células utilizando la exclusión de Trypan Blue y la hemocitometría, seguida de la preparación de suspensiones de células macrófagos de control y tratadas a la concentración de dos veces 10 a la quinta célula por mililitro como se demostró previamente para las células madre mesenquimales.Aspire suavemente el medio de los pozos experimentales que contienen células madre mesenquimales. Utilice una micropipeta multicanal para agregar 100 microlitros de las suspensiones de células de macrófagos tratadas y de control en los pozos experimentales apropiados de acuerdo con el diseño de la placa e incube durante la noche como se ha demostrado. Aspire suavemente el medio desde el portaobjetos de cámara de cuatro paredes que contiene células madre mesenquimales.Use una micropipeta para agregar 530 microlitros de la suspensión de células de macrófagos a los pozos apropiados de acuerdo con el diseño e incube durante la noche. Agregue un mililitro de medio de imágenes de células vivas al vial que contiene un miligramo de partículas de Zymosan y recoja la mezcla de partículas de medio en un tubo de cultivo de vidrio. Después de enjuagar el vial con un mililitro adicional de solución de imágenes, transfiera el medio de imágenes enjuagado en el tubo de vidrio, luego agregue tres mililitros de solución de imágenes adicional para lograr 0.2 miligramos por mililitro de suspensión de partículas de Zymosan.Vórtice la suspensión Zymosan usando pulsos rápidos durante 30 a 60 segundos, luego use un sonicador de sonda para sonicar la suspensión con 60 pulsos rápidos. Después de aspirar el medio, enjuague los pozos experimentales y los pozos en blanco del reactivo con 100 microlitros de solución de imágenes de células vivas. A continuación, aspire la solución de imágenes de células vivas de los pozos y agregue 100 microlitros de la suspensión de Zymosan.Abra la bandeja de placas del lector fluorescente utilizando la interfaz del panel táctil. Coloca la placa sin la tapa en la bandeja con el pozo A1 en la esquina superior izquierda. Cierre la bandeja con el panel táctil y haga clic en el botón verde de lectura en el menú superior.Para realizar el ensayo de fagocitosis, después de enjuagar el primer pozo experimental con 750 microlitros del medio de imagen, agregue 400 microlitros de la suspensión de Zymosan dejando los pozos restantes en el medio de crecimiento. A continuación, coloque la diapositiva en la etapa incubada del sistema de imágenes. Utilice el software de imágenes.Seleccione la opción Campo brillante en la pestaña Localizar y, a continuación, haga clic en el icono del ocular. Con el objetivo 10X en su lugar, use el ocular y la perilla de enfoque para enfocar las células. Seleccione la pestaña de adquisición.Abra el menú desplegable del experimento y seleccione un conjunto de longitudes de onda que incluya el conjunto de filtros EGFP para acomodar la excitación de 509 nanómetros y las longitudes de onda de emisión de 533 nanómetros del tinte sensible al pH. Cuando queden unos dos minutos en el temporizador, haga clic en el icono 20X en el menú del objetivo para cambiar el objetivo a 20X, luego haga clic en el menú de canales, seleccione filtros EGFP y, en el menú de exposición, establezca el tiempo de exposición en 400 milisegundos para detectar el fluoróforo verde sensible al pH, y luego haga clic en en vivo. Después de ajustar el enfoque, haga clic en detener para apagar la luz y marque la casilla junto a la configuración experimental de lapso de tiempo superior.En el menú de estrategia de enfoque, seleccione el enfoque automático del software y, en el menú desplegable, seleccione la configuración inteligente y central para reducir el tiempo de exposición a la luz mientras se ejecuta el enfoque automático. En el menú de lapso de tiempo, establezca el número deseado de adquisiciones en 30 a 60, el tiempo de intervalo en un minuto y luego haga clic en el botón Iniciar experimento para comenzar la adquisición. Se estudió el efecto del interferón gamma sobre el coculto.Los resultados representativos demuestran que el coculto de macrófagos con células madre mesenquimales mejora la actividad fagocítica del macrófago. El tratamiento con interferón gamma reduce la actividad del macrófago. Sin embargo, en presencia de células madre mesenquimales, la actividad fagocítica de los macrófagos fue parcialmente rescatada.Las densidades celulares óptimas son críticas en estos estudios. Y cuando las células de macrófagos se cubrieron a una densidad demasiado baja, no se detectaron cambios en la intensidad de la fluorescencia. Cuando las células macrófagos se colocaron en una alta densidad, la intensidad de la fluorescencia se elevó rápidamente en todos los grupos y no se discernieron diferencias.Una de las cosas más importantes durante este procedimiento es asegurarse de que las densidades celulares se optimicen y se mantengan consistentes entre los experimentos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Imagen intravital del timo de ratón utilizando 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Investigación

Inmunología e Infección

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Vídeo en vivo de células Microscopía de fagocitosis hongo patógeno

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

In vivo método de imagen para distinguir la inflamación aguda y crónica

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

A gran escala de purificación de porcino o bovino fotorreceptor Outer Segmentos para Fagocitosis ensayos sobre células pigmento retiniano epitelial

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Alto Rendimiento Fluorométrico Técnica de Evaluación de macrófagos fagocitosis y actina polimerización

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

El colesterol de los macrófagos agotamiento y su efecto sobre la fagocitosis de<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

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Evaluación de las propiedades inmunomoduladoras de las células madre mesenquimales humanas (MSC)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

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Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

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