Name: mesenchymal stem cell regulation of macrophage phagocytosis; quantitation and imaging
Uploaded: 2021-07-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NSF:s mekanism för större forskningsinstrument under bidragsnummer 1626093 och 1919583.

OBS: Alla medelpreparat- och cellodlingstekniker utförs under aseptiska förhållanden med hjälp av ett biosäkerhetsskåp med laminärt flöde. Alla odlade inkubationssteg som beskrivs utförs med hjälp av en inkubator utformad för att upprätthålla en atmosfär på 37 °C, 5% CO2och 95% fuktighet.
1. Cellkultur
<ol><li>Förberedelse av tillväxtmedium<ol>
<li>För MSC och LADMAC, tillsätt 50 ml FBS och 5 ml 100x antibiotika/antimykotisk blandning till 500 ml hög glukos DM...

<ol>
	<li>Phinney, D. G., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Mesenchymal+stem/multipotent+stromal+cells:+The+state+of+transdifferentiation+and+modes+of+tissue+repair--current+views.">Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views.</a> Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).</li><li>Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells:+sensors+and+switchers+of+inflammation.">Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).</li><li>Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells+suppress+donor+CD4(+)+T+cell+proliferation+and+reduce+pathology+in+a+humanized+mouse+model+of+acute+graft-versus-host+disease.">Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease.</a> Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).</li><li>Giuliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+inhibitory+effects+of+fetal+liver+mesenchymal+stem+cells+on+T-lymphocyte+proliferation.">Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation.</a> PLoS One. 6 (5), 19988 (2011).</li><li>Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+induce+apoptosis+of+activated+T+cells.">Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells.</a> Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).</li><li>Luz-Crawford, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+generate+a+CD4+CD25+Foxp3++regulatory+T+cell+population+during+the+differentiation+process+of+Th1+and+Th17+cells.">Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (3), 65 (2013).</li><li>Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mesenchymal+stem+cell+(MSC)+paradigm:+Polarization+into+a+pro-inflammatory+MSC1+or+an+Immunosuppressive+MSC2+phenotype.">A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype.</a> PLoS One. 5 (4), 10088 (2010).</li><li>Nemeth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow+stromal+cells+attenuate+sepsis+via+prostaglandin+E(2)-dependent+reprogramming+of+host+macrophages+to+increase+their+Interleukin-10+production.">marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production.</a> Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).</li><li>Maggini, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+Turn+Activated+Macrophages+into+a+Regulatory-Like+Profile.">Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile.</a> PLoS One. 5 (2), 9252 (2010).</li><li>Takizawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+propagate+immunosuppressive/anti-inflammatory+macrophages+in+cell-to-cell+contact-independent+and-dependent+manners+under+hypoxic+culture.">marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture.</a> Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).</li><li>Kim, J., Hematti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-educated+macrophages:+a+novel+type+of+alternatively+activated+macrophages.">Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages.</a> Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).</li><li>Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+aorta-derived+mesenchymal+progenitor+cells+contribute+to+and+enhance+the+immune+response+of+macrophage+cells+under+inflammatory+conditions.">Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (1), 56 (2015).</li><li>Cho, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+reciprocally+regulate+the+M1/M2+balance+in+mouse+bone+marrow-derived+macrophages.">Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages.</a> Experimental Molecular Medicine. 46, 70 (2014).</li><li>Fernandez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+mesenchymal+progenitor+cells+expressing+adipogenic+and+osteogenic+transcription+factors+suppress+the+macrophage+inflammatory+response.">Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response.</a> Stem Cells International. 2017, 5846257 (2017).</li><li>Jackson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transfer+via+tunneling+nanotubes+is+an+important+mechanism+by+which+mesenchymal+stem+cells+enhance+macrophage+phagocytosis+in+the+in+vitro+and+in+vivo+models+of+ARDS.">Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS.</a> Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).</li><li>Chaplin, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+immune+response.">Overview of the immune response.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), 3-23 (2010).</li><li>Lim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+mechanisms+of+nonopsonic+uptake+of+cryptococci+by+macrophages.">Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages.</a> Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-&#947;+inhibits+nonopsonized+phagocytosis+of+macrophages+via+an+mTORC1-c/EBP+pathway.">Interferon-&#947; inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway.</a> Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).</li><li>Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+assays+with+different+PH-sensitive+fluorescent+particles+and+various+readouts.">Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts.</a> Biotechniques. 68, 245-250 (2020).</li><li>Kapellos, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real+time+imaging+platform+to+quantify+macrophage+pahgocytosis.">A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis.</a> Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).</li><li>Takahashi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitation+of+platelet+phagocytosis+by+monocytes+using+a+pH-sensitive+dye,+pHrodo-SE.">Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE.</a> Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).</li></ol>

Analys av fagocytos med hjälp av biopartiklar konjugerade till ett pH-känsligt färgämne är ett relativt nytt verktyg som har visat sig fördelaktigt jämfört med traditionella fluorescerande märkta partiklar12,19,20. Med traditionella fluorescerande märkta partiklar är endast slutpunktsanalys möjlig. Detektion utförs med fluorescerande mikroskopi och/eller spektrofluorometri efter tvätt eller släckning av partiklar ...

Mesenkymala stamceller (MSC) är stamceller som ger upphov till bindvävsceller. MSC finns i vuxna däggdjursvävnader och kan isoleras från benmärgen1. På grund av deras immunmodulerande egenskaper studeras dessa celler allmänt2. Tidiga studier fokuserade på MSC-reglering av T-celler3,4,5,6 men mer nyligen har deras reglering av makrofagceller (MΦ), en viktig cellulär komponent i medfödd immunitet, fått ökad uppmärksamhet7,8,9,10,11,12,13,14 . Vikten av MSC-MΦ-interaktion vid behandling av inflammatorisk sjukdom understryks av det faktum att utarmning av monocyter/ makrofager upphäver de terapeutiska effekterna av MSC i djurmodeller8. Här är fokus MSC:s cellkontaktinteraktion med MΦ. MSC har kapacitet att reglera fenotypen av MΦ genom att främja övergången från inflammatoriska till antiinflammatoriska svar, vilket leder till vävnadsreparationsaktiviteter8,9,10,11, och mycket har gjorts för att demonstrera dessa regleringsmekanismer. Under andra omständigheter kan MSC stödja eller förvärra ett MΦ-drivet inflammatoriskt svar12,13 och förbättra MΦ fagocytisk aktivitet14,15. Det finns dock en kritisk brist på befintliga data som identifierar de mekanismer varigenom och de förhållanden under vilka MSC reglerar MΦ fagocytisk aktivitet.
MΦ har familjer av receptorer som känner igen antingen opsoniserade (antikropps- eller komplementbelagda) eller icke-opsoniserade patogener som leder till fagocytos16. Aktiveringen och aktiviteten hos den senare är mindre väl studerade17. I en icke-inflammatorisk in vitro-miljö förbättrar MSC MΦ fagocytos av icke-opsoniserade patogener13. Erkännandet av icke-opsoniserade patogener med MΦ kan dock minskas efter exponering för en inflammatorisk miljö som produceras av lymfocyter under ett adaptivt immunsvar. IFN-γ, som frigörs av naturliga mördarceller och effektorlymfocyter, har en hämmande effekt på MΦ-fagocytos av icke-opsoniserade partiklar18. En samkultur modell utvecklades för att studera mekanismerna för MSC direkt kontakt reglering av MΦ fagocytos. Målet med experimentet som presenteras här är att avgöra om MSC reglerar MΦ fagocytos av icke-opsoniserade patogener efter att MΦ har utsatts för IFN-γ (figur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well Black Polystyrene Microplate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS3603-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% trypan blue solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>155382PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)&#160;Gibco</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiobserver 7 Imaging System</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A8806-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS3008-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75&#160;cm2, canted neck, with cap, filtered</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>C7231-120EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1 ORL UVA [D1]</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-12424</td>
			<td>Mouse MSC Cell Line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-11.15</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2470</td>
			<td>Mouse M&#934; Cell Line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LADMAC Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2420</td>
			<td>LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-Cell Imaging solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P35365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IFN-&#947;</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>315-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax i3X</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 &#181;m</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>568-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters, 0.2 micrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430167-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mesenchymal stem cell regulation of macrophage phagocytosis; quantitation and imaging

Mesenkymala stamceller (MSC) har traditionellt studerats för deras regenerativa egenskaper, men på senare tid har deras immunregulatoriska egenskaper legat i framkant. De interagerar med och reglerar immuncellaktivitet. Fokus för denna studie är MSC-regleringen av makrofagfagocytisk aktivitet. Makrofag (MΦ) fagocytos är en viktig del av det medfödda immunsystemets svar på infektion, och de mekanismer genom vilka MSC modulerar detta svar är under aktiv undersökning. Presenteras här är en metod för att studera MΦ fagocytos av icke-opsonized zymosan partiklar konjugerad till en pH-känslig fluorescerande molekyl medan i samkultur med MSC. När fagocytisk aktivitet ökar och de märkta zymosanpartiklarna innesluts i den sura miljön i phagolysosomen ökar fluorescensintensiteten hos den pH-känsliga molekylen. Med lämpliga excitations- och emissionsvåglängder mäts fagocytisk aktivitet med hjälp av en fluorescerande spektrofotometer och kinetiska data presenteras som förändringar i relativa fluorescerande enheter under en 70-minuters period. För att stödja dessa kvantitativa data visualiseras förändringen i den fagocytiska aktiviteten med hjälp av dynamisk avbildning. Resultat med denna metod visar att när i samkultur, MSC förbättra MΦ fagocytos av icke-opsonized zymosan av både naiva och IFN-γ behandlad MΦ. Dessa data bidrar till den nuvarande kunskapen om MSC-reglering av det medfödda immunsystemet. Denna metod kan tillämpas i framtida undersökningar för att helt avgränsa de underliggande cellulära och molekylära mekanismerna.

Efter beräkning av medelvärdet ± SEM för varje grupp vid alla tidpunkter presenteras data i linjediagramformat med Y-axeln som relativ fluorescerande intensitet och X-axeln som tid. Kompletterande fil 1 ger ett exempel på rådata från en kinetisk läsning av 96-brunnsplattan i ett kalkylbladsformat.
I denna studie visar de optimala resultaten i figur 3Aoch tabell 3 att 1) samkultur med MSC förbättrar makrofagens fagocytisk...

Watch this Scientific Journal Video about Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging at JoVE.com

Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

Presenteras här är ett protokoll för att kvantifiera och producera dynamiska bilder av mesenchymala stamcell (MSC) medierad reglering av makrofag (MΦ) fagocytos av icke-opsonized jäst (zymosan) partiklar som är konjugerade till en pH-känslig fluorescerande molekyl.

Mesenkymal stamcellsreglering av makrofag fagocytos; Mängdering och avbildning

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

Denna samkulturmetod kommer att hjälpa till att svara på viktiga frågor kring cellkontaktmekanismerna bakom mesenkymal stamcellsreglering av makrofagfagfagocytos, och därför belysa MSC: s roll för att reglera medfödd immunitet. Denna teknik kan tillämpas i analyser med hög genomströmning. Biopartiklarna konjugerade till pH-känsliga färgämnen fluorescerar endast i sura phagolysosommiljöer.Därför är tvättning och släckning nödvändig. Denna metod kan också tillämpas på en mängd olika samkulturmodeller som inkluderar neutrofiler och andra fagocyter. Ethan Chetkof, en student i mitt labb.Till att börja med observera sammanflödet av odlade mesenkymala stamceller. När 70-80% sammanflöde uppnås, aspirera tillväxtmediet från de odlade cellerna i en 100 millimeters maträtt och tillsätt fem milliliter PBS. Efter att ha aspirerat PBS, tillsätt två milliliter av 0,05% trypsin EDTA-lösning och inkubera cellerna i tre minuter.Efter tre minuter kontrollerar du cellavlossningen med hjälp av ett inverterat mikroskop. Och om cellerna inte lossnar, inkubera i en till två minuter igen. När alla celler har lossnat, tillsätt fem milliliter färskt tillväxtmedium till plattan.Efter sköljning av plattan med trypsin mediumblandningen, använd en steril serologisk pipet för att samla celler i ett rent, sterilt 50 milliliter koniskt rör. Därefter pellets ner cellerna genom centrifugering. Efter att ha aspirerat supernatanten, återanvänd cellpelleten i 10 milliliter friskt tillväxtmedium genom att försiktigt pipettera upp och ner.För cellräkning, tillsätt 10 mikroliter cellupphängning i ett 1,5 milliliter mikrocentrifugerör som innehåller 30 mikroliter av 0,4%Trypan Blue-lösning och tillsätt sedan 10 mikroliter av blandningen under täckslipet av en hemocytometerräkningskammare. Under det inverterade eller Brightfield-mikroskopet räknar du de oförstörda livskraftiga cellerna med hjälp av en 10X objektivlins och fyra en kvadratmillimeterkammare och beräknar cellnumret enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Använd ekvationen C1V1 är lika med C2V2 för att bestämma önskad volym av det färska medie- och cellupphängningen som krävs för att förbereda cellupphängningen vid en slutlig koncentration av en gånger 10 till de femte cellerna per milliliter.Använd en flerkanalig mikropipetter för att lägga till 100 mikroliter av cellupphängningen i brunnarna på en 96-brunnsplatta enligt plattdesignen. Använd en mikropipette för att tillsätta 530 mikroliter av cellupphängningen till var och en av kammarens glid enligt plattdesignen och inkubera över natten. Förbered 10 milliliter aktiveringsmedium som innehåller interferon gamma vid en koncentration av 250 nanogram per milliliter för aktivering av makrofagcellerna i en 100-millimeters skål.Aspirera tillväxtmediet från makrofagcellskulturerna och skölj cellerna med fem milliliter av aktiveringsmediet utan interferon gamma. Efter att ha aspirerat sköljmediet i försöksrätten, tillsätt 10 milliliter aktiveringsmedium kompletterat med interferon gamma. Och i kontrollrätten, tillsätt 10 milliliter aktiveringsmedium utan interferon gamma och inkubera sedan cellerna i 16 till 24 timmar.I slutet av inkubationen, för att förbereda samkulturerna, ta bort aktiveringsmediet från makrofagcellerna och tillsätt fem milliliter färskt tillväxtmedium. Använd en celllyftare för att försiktigt skrapa cellerna och samla cellerna i ett koniskt rör på 50 milliliter. Räkna sedan cellerna med Trypan Blue-uteslutning och hemocytometri, följt av beredning av kontroll och behandlade makrofagcellsupphängningar vid koncentrationen av två gånger 10 till de femte cellerna per milliliter som tidigare visats för de mesenkymala stamcellerna.Aspirera försiktigt mediet från de experimentella brunnarna som innehåller mesenkymala stamceller. Använd en flerkanalig mikropipett för att tillsätta 100 mikroliter av de behandlade och kontrollmakrofagcellsupphängningarna i lämpliga experimentbrunnar enligt plattdesignen och inkubera över natten enligt vad som visats. Aspirera försiktigt med mediet från den fyrväggiga kammarrutschbanan som innehåller mesenkymala stamceller.Använd en mikropipette för att tillsätta 530 mikroliter av makrofagcellsupphängningen till lämpliga brunnar enligt designen och inkubera över natten. Tillsätt en milliliter levande cellavbildningsmedium till injektionsflaskan som innehåller ett milligram Zymosanpartiklar och samla upp den medelstora partikelblandningen i ett glasodlingsrör. Efter sköljning av injektionsflaskan med ytterligare en milliliter bildlösning, överför det sköljda bildmediet i glasröret och tillsätt sedan tre milliliter extra bildbehandlingslösning för att uppnå 0,2 milligram per milliliter Zymosan partikel suspension.Vortex Zymosan suspension med snabba pulser i 30 till 60 sekunder, använd sedan en sond sonicator för att sonikera suspensionen med 60 snabba pulser. Efter att ha aspirerat mediet, skölj de experimentella brunnarna och reagens blanka brunnar med 100 mikroliter levande cellavbildningslösning. Aspirera sedan på den levande cellavbildningslösningen från brunnarna och tillsätt 100 mikroliter av Zymosan-suspensionen.Öppna lysrörsfacket på den fluorescerande läsaren med hjälp av pekplattans gränssnitt. Ställ plattan utan lock i brickan med A1-brunnen i det övre vänstra hörnet. Stäng facket med hjälp av pekplattan och klicka på den gröna läsknappen i den övre menyn.För att genomföra fagocytosanalysen, efter sköljning av den första experimentella brunnen med 750 mikroliter av bildmediet, tillsätt 400 mikroliter av Zymosan suspension lämnar de återstående brunnarna i tillväxtmediet. Placera sedan bilden på det inkuberade skedet av bildsystemet. Använd bildbehandlingsprogramvaran.Välj alternativet Brightfield under fliken Hitta och klicka sedan på okularikonen. Med 10X-målet på plats, använd okularet och fokuseringsknappen för att fokusera på cellerna. Välj fliken förvärv.Öppna rullgardinsmenyn för experiment och välj en uppsättning våglängder som innehåller EGFP-filteruppsättningen för att rymma 509 nanometer excitation och 533 nanometers emissionsvåglängder för det pH-känsliga färgämnet. När ungefär två minuter återstår på timern klickar du på 20X-ikonen i målmenyn för att ändra målet till 20X, klickar sedan på kanalmenyn, väljer EGFP-filter och i exponeringsmenyn ställer du in exponeringstiden till 400 millisekunder för att upptäcka den pH-känsliga gröna fluoroforen och klickar sedan på live. När du har justerat fokus klickar du på stopp för att stänga av ljuset och markera rutan bredvid den översta experimentella inställningen för tidsfördröjning.I fokusstrategimenyn väljer du automatisk fokusering på programvara och väljer smarta inställningar och kärninställningar på rullgardinsmenyn för att minska exponeringstiden för ljus medan autofokuset körs. I timelapse-menyn ställer du in önskat antal förvärv till 30 till 60, intervalltiden till en minut och klickar sedan på startexperimentknappen för att påbörja förvärvet. Effekten av interferon gamma på samkulturen studerades.De representativa resultaten visar att samkulturen av makrofager med mesenkymala stamceller förbättrar makrofagens fagocytiska aktivitet. Interferon gammabehandling minskar makrofagens aktivitet. I närvaro av mesenkymala stamceller räddades dock makrofag fagocytic verksamhet delvis.Den optimala celltätheten är avgörande i dessa studier. Och när makrofag cellerna var pläterade på för låg densitet, upptäcktes inte förändringar i fluorescens intensitet. När makrofag cellerna var pläterade med en hög densitet, fluorescens intensitet höjdes snabbt i alla grupper och skillnader inte urskiljas.En av de viktigaste sakerna under denna procedur är att se till att celltätheterna optimeras och hålls konsekventa mellan experiment.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging av Mouse Thymus med 2-Photon Mikroskopi

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Live-cell videomikroskopi av svamppatogen Fagocytos

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

In vivo Imaging för att skilja akut och kronisk inflammation

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Storskaliga Rening av Svin eller Bovin ljusmätare yttre segment för Fagocytos Analyser på Retinal Pigment epitelceller

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Hög genomströmning Fluorometrisk Teknik för Bedömning av Macrophage Fagocytos och aktin polymerisation

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Makrofag Kolesterol Utarmning och dess effekt på Fagocytos av<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

Bedömning av immunmodulerande egenskaper av humana mesenkymala stamceller (MSC: er)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Organoids som modell för Infektionssjukdomar: Culture of Human och Murina mage Organoids och mikroinjektion av Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

Mättade fettsyror inducerar Ceramide-associerade makrofag celldöd

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...