Name: mesenchymal stem cell regulation of macrophage phagocytosis; quantitation and imaging
Uploaded: 2021-07-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging at JoVE.com

Bu çalışma, NSF Büyük Araştırma Aracı mekanizması tarafından hibe sayıları 1626093 ve 1919583 altında desteklendi.

NOT: Tüm orta hazırlık ve hücre kültürü teknikleri, laminer akışlı bir biyogüvenlik kabini kullanılarak aseptik koşullar altında gerçekleştirilir. Açıklanan tüm kültür kuluçka adımları, 37 °C, %5 CO2ve %95 nem atmosferini korumak için tasarlanmış bir inkübatör kullanılarak gerçekleştirilir.
1. Hücre kültürü
<ol><li>Büyüme ortamının hazırlanması<ol>
<li>MSC ve LADMAC için, 500 mL yüksek glikoz DMEM'e 50 mL FBS ve 5 mL 100x antibiyotik / ...

<ol>
	<li>Phinney, D. G., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Mesenchymal+stem/multipotent+stromal+cells:+The+state+of+transdifferentiation+and+modes+of+tissue+repair--current+views.">Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views.</a> Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).</li><li>Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells:+sensors+and+switchers+of+inflammation.">Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).</li><li>Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells+suppress+donor+CD4(+)+T+cell+proliferation+and+reduce+pathology+in+a+humanized+mouse+model+of+acute+graft-versus-host+disease.">Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease.</a> Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).</li><li>Giuliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+inhibitory+effects+of+fetal+liver+mesenchymal+stem+cells+on+T-lymphocyte+proliferation.">Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation.</a> PLoS One. 6 (5), 19988 (2011).</li><li>Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+induce+apoptosis+of+activated+T+cells.">Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells.</a> Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).</li><li>Luz-Crawford, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+generate+a+CD4+CD25+Foxp3++regulatory+T+cell+population+during+the+differentiation+process+of+Th1+and+Th17+cells.">Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (3), 65 (2013).</li><li>Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mesenchymal+stem+cell+(MSC)+paradigm:+Polarization+into+a+pro-inflammatory+MSC1+or+an+Immunosuppressive+MSC2+phenotype.">A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype.</a> PLoS One. 5 (4), 10088 (2010).</li><li>Nemeth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow+stromal+cells+attenuate+sepsis+via+prostaglandin+E(2)-dependent+reprogramming+of+host+macrophages+to+increase+their+Interleukin-10+production.">marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production.</a> Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).</li><li>Maggini, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+Turn+Activated+Macrophages+into+a+Regulatory-Like+Profile.">Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile.</a> PLoS One. 5 (2), 9252 (2010).</li><li>Takizawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+propagate+immunosuppressive/anti-inflammatory+macrophages+in+cell-to-cell+contact-independent+and-dependent+manners+under+hypoxic+culture.">marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture.</a> Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).</li><li>Kim, J., Hematti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-educated+macrophages:+a+novel+type+of+alternatively+activated+macrophages.">Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages.</a> Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).</li><li>Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+aorta-derived+mesenchymal+progenitor+cells+contribute+to+and+enhance+the+immune+response+of+macrophage+cells+under+inflammatory+conditions.">Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (1), 56 (2015).</li><li>Cho, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+reciprocally+regulate+the+M1/M2+balance+in+mouse+bone+marrow-derived+macrophages.">Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages.</a> Experimental Molecular Medicine. 46, 70 (2014).</li><li>Fernandez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+mesenchymal+progenitor+cells+expressing+adipogenic+and+osteogenic+transcription+factors+suppress+the+macrophage+inflammatory+response.">Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response.</a> Stem Cells International. 2017, 5846257 (2017).</li><li>Jackson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transfer+via+tunneling+nanotubes+is+an+important+mechanism+by+which+mesenchymal+stem+cells+enhance+macrophage+phagocytosis+in+the+in+vitro+and+in+vivo+models+of+ARDS.">Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS.</a> Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).</li><li>Chaplin, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+immune+response.">Overview of the immune response.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), 3-23 (2010).</li><li>Lim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+mechanisms+of+nonopsonic+uptake+of+cryptococci+by+macrophages.">Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages.</a> Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-&#947;+inhibits+nonopsonized+phagocytosis+of+macrophages+via+an+mTORC1-c/EBP+pathway.">Interferon-&#947; inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway.</a> Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).</li><li>Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+assays+with+different+PH-sensitive+fluorescent+particles+and+various+readouts.">Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts.</a> Biotechniques. 68, 245-250 (2020).</li><li>Kapellos, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real+time+imaging+platform+to+quantify+macrophage+pahgocytosis.">A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis.</a> Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).</li><li>Takahashi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitation+of+platelet+phagocytosis+by+monocytes+using+a+pH-sensitive+dye,+pHrodo-SE.">Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE.</a> Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).</li></ol>

PH'a duyarlı bir boyaya konjuge edilen biyopartiküller kullanılarak fagositozun analizi, geleneksel floresan etiketli parçacıklara göre avantajlı olduğu kanıtlanmış nispeten yeni bir araçtır12,19,20. Geleneksel floresan etiketli parçacıklarda, sadece uç nokta analizi mümkündür. Tespit, fagosit tarafından alınmamış parçacıkları yıkadıktan veya söndürtükten sonra floresan mikroskopi ve/veya spektrofl...

Mezenkimal kök hücreler (MSC) bağ dokusu hücrelerine yol açan progenitör hücrelerdir. MSC yetişkin memeli dokularında bulunur ve kemik iliği1'denizole edilebilir. İmmünomodülatör özellikleri nedeniyle, bu hücreler yaygın olarak incelenir2. T hücrelerinin MSC regülasyonuna odaklanan ilk çalışmalar3,4,5,6, ancak daha yakın zamanda, doğuştan gelen bağışıklığın önemli bir hücresel bileşeni olan makrofaj hücrelerinin (MΦ) düzenlenmesi, 7 , 8 , 9,10,11,12,13,14'ün dikkatini çekmiştir. . Msc-MΦ etkileşiminin enflamatuar hastalığın tedavisindeki önemi, monositlerin / makrofajların tükenmesinin MSC'nin hayvan modellerinde terapötik etkilerini kırdığı gerçeği ile altı çizilmiştir8. Burada, odak noktası MSC'nin MΦ ile hücre teması etkileşimidir. MSC, enflamatuar yanıtlardan antienflamatuar yanıtlara geçişi teşvik ederek MΦ'nin fenotipini düzenleme kapasitesine sahiptir ve doku onarım faaliyetlerine yol açarak 8,9,10,11ve bu düzenleyici mekanizmaları göstermek için çok şey yapılmıştır. Diğer durumlarda, MSC MΦ güdümlü enflamatuar yanıt12,13'ü destekleyebilir veya şiddetlendirebilir ve MΦ fagositik aktivitesiniartırabilir 14,15. Bununla birlikte, MSC'nin MΦ fagositik etkinliğini düzenlediği mekanizmaları ve koşulları tanımlayan kritik bir mevcut veri eksikliği vardır.
MΦ, fenositoza yol açan opsonize (antikor veya tamamlayıcı kaplamalı) veya opsonize olmayan patojenleri tanıyan reseptör ailelerine sahiptir16. İkincisinin aktivasyonu ve aktivitesi daha az iyi çalışılmıştır17. İnflamatuar olmayan bir in vitro ortamda, MSC opsonize olmayan patojenlerin MΦ fagositozunu geliştirir13. Bununla birlikte, uyarlanabilir bir immün yanıt sırasında lenfositler tarafından üretilen enflamatuar bir ortama maruz kaldıktan sonra opsonize olmayan patojenlerin MΦ tarafından tanınması azaltılabilir. Doğal öldürücü hücreler ve efektör lenfositler tarafından salınan IFN-γ, opsonize olmayan parçacıkların MΦ fagositozu üzerinde inhibitör bir etkiye sahiptir18. MSC'nin MΦ fagositozunun doğrudan temas regülasyonunun mekanizmalarını incelemek için bir ortak kültür modeli geliştirilmiştir. Burada sunulan deneyin amacı, MSC'nin MΦ'nin IFN-γ maruz kaldıktan sonra opsonize olmayan patojenlerin MΦ fagositozunu düzenleyip düzenlemediğini belirlemektir (Şekil 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well Black Polystyrene Microplate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS3603-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% trypan blue solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>155382PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)&#160;Gibco</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiobserver 7 Imaging System</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A8806-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS3008-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75&#160;cm2, canted neck, with cap, filtered</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>C7231-120EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1 ORL UVA [D1]</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-12424</td>
			<td>Mouse MSC Cell Line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-11.15</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2470</td>
			<td>Mouse M&#934; Cell Line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LADMAC Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2420</td>
			<td>LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-Cell Imaging solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P35365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IFN-&#947;</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>315-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax i3X</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 &#181;m</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>568-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters, 0.2 micrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430167-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mesenchymal stem cell regulation of macrophage phagocytosis; quantitation and imaging

Mezenkimal kök hücreler (MSC) geleneksel olarak rejeneratif özellikleri için çalışılmıştır, ancak daha yakın zamanda immünoregülatör özellikleri ön plandadır. Bağışıklık hücresi aktivitesi ile etkileşime girerler ve düzenlerler. Bu çalışmanın odak noktası makrofaj fagositik aktivitesinin MSC düzenlemesidir. Makrofaj (MΦ) fagositozu, enfeksiyona doğuştan gelen bağışıklık sistemi yanıtının önemli bir parçasıdır ve MSC'nin bu yanıtı modüle ettiği mekanizmalar aktif olarak incelenmektedir. Burada sunulan, MSC ile ortak kültürdeyken pH'a duyarlı bir floresan molekülüne konjuge edilen opsonize olmayan zymosan parçacıklarının MΦ fagositozunu incelemek için bir yöntemdir. Fagositik aktivite arttıkça ve etiketli zymosan parçacıkları fagolyozomların asidik ortamına dahil edildikçe, pH'a duyarlı molekülün floresan yoğunluğu artar. Uygun ekscitasyon ve emisyon dalga boyları ile fagositik aktivite floresan spektrofotometre kullanılarak ölçülür ve kinetik veriler 70 dakikalık bir süre içinde göreceli floresan ünitelerde değişiklik olarak sunulur. Bu nicel verileri desteklemek için, fagositik aktivitedeki değişiklik dinamik görüntüleme kullanılarak görselleştirilir. Bu yöntemi kullanan sonuçlar, ortak kültürde MSC'nin hem naif hem de IFN-γ tedavi edilen MΦ'nin opsonize edilmemiş zymosan'ının MΦ fagositozunu artırdığını göstermektedir. Bu veriler, doğuştan gelen bağışıklık sisteminin MSC düzenlemesi hakkındaki mevcut bilgi birikimine katkıda bulunur. Bu yöntem, alttaki hücresel ve moleküler mekanizmaları tam olarak tanımlamak için gelecekteki araştırmalarda uygulanabilir.

Her grup için ortalama ± SEM her zaman noktasında hesaplandıktan sonra, veriler Y ekseni ile Göreli Floresan Yoğunluğu ve X ekseni Zaman olarak çizgi grafik biçiminde sunulur. Tamamlayıcı Dosya 1, 96 kuyu plakasının elektronik tablo biçimindeki kinetik okumasından ham veri örneği sağlar.
Bu çalışmada, Şekil 3Ave Tablo 3'te sunulan en uygun sonuçlar, 1) MSC ile ortak kültürün makrofajın fagositik aktivite...

Watch this Scientific Journal Video about Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging at JoVE.com

Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

Burada sunulan, pH'a duyarlı bir floresan moleküle konjuge edilen opsonize olmayan maya (zymosan) parçacıklarının makrofaj (MΦ) fagositozunun mezenkimal kök hücre (MSC) aracılı regülasyonunun dinamik görüntülerini ölçmek ve üretmek için bir protokol sunulmaktadır.

Makrofaj Fagositozun Mezenkimal Kök Hücre Regülasyonu; Nicellik ve Görüntüleme

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

Bu ortak kültür yöntemi, makrofaj fagositozun mezenkimal kök hücre düzenlemesinin arkasındaki hücre temas mekanizmalarını çevreleyen önemli soruların cevaplandırılmasına yardımcı olacak ve bu nedenle MSC'nin doğuştan gelen bağışıklığı düzenlemedeki rolünü aydınlatacaktır. Bu teknik yüksek verimli analizlerde uygulanabilir. Biyopartiküller sadece asidik fagolyozom ortamlarında pH'a duyarlı boyalar floresanlarına konjuge edildi.Bu nedenle, yıkama ve söndürme gereklidir. Bu yöntem nötrofiller ve diğer fagositleri içeren çeşitli ortak kültür modellerine de uygulanabilir. Prosedürü gösteren ethan Chetkof olacak, şu anda laboratuvarımda bir lisans öğrencisi.Başlangıç olarak, kültürlü mezenkimal kök hücrelerin birleştiği yer. % 70-80 izdiah elde edildiğinde, 100 milimetrelik bir tabakta kültürlü hücrelerden büyüme ortamını epire edin ve beş mililitre PBS ekleyin. PBS'yi aspire ettikten sonra, iki mililitre % 0.05 tripsin EDTA çözeltisi ekleyin ve hücreleri üç dakika kuluçkaya bırakın.Üç dakika sonra, ters bir mikroskop kullanarak hücre müfrezesini kontrol edin. Ve hücreler ayrılmazsa, tekrar bir ila iki dakika kuluçkaya yatırın. Tüm hücreler ayrıldıktan sonra, plakaya beş mililitre taze büyüme ortamı ekleyin.Trypsin orta karışımını kullanarak plakayı durulamadan sonra, hücreleri temiz, steril 50 mililitre konik bir tüpe toplamak için steril bir serolojik pipet kullanın. Daha sonra, hücreleri santrifüjleme ile aşağı doğru pelet. Süpernatantı aspire ettikten sonra, hücre peletini hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme ile 10 mililitre taze büyüme ortamında yeniden canlandırın.Hücre sayımı için, %0,4 Trypan Blue çözeltisinin 30 mikrolitresini içeren 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne 10 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin, ardından hemositometre sayım odasının kapaklarının altına 10 mikrolitre karışım ekleyin. Ters veya Brightfield mikroskobu altında, 10X objektif lens ve dört bir milimetrelik odacık kullanarak ulaşılamayan uygulanabilir hücreleri sayın ve hücre numarasını metin el yazmasında açıklandığı gibi hesaplayın. Hücre süspansiyonunun mililitre başına beşinci hücrelere bir kez 10'luk son konsantrasyonda hazırlanması için gereken taze orta ve hücre süspansiyonunun istenen hacmini belirlemek için C1V1 eşittir C2V2 denklemini kullanın.Plaka tasarımına göre 96 kuyulu bir plakanın kuyularına hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini eklemek için çok kanallı bir mikropipetter kullanın. Plaka tasarımına göre oda kaydırağının her birine 530 mikrolitre hücre süspansiyonu eklemek ve bir gecede kuluçkaya yatmak için bir mikropipette kullanın. Makrofaj hücrelerini bir 100 milimetrelik tabakta etkinleştirmek için mililitre başına 250 nanogram konsantrasyonda interferon gama içeren 10 mililitre aktivasyon ortamı hazırlayın.Büyüme ortamını makrofaj hücre kültürlerinden ayırın ve hücreleri interferon gamasından yoksun aktivasyon ortamının beş mililitresi ile durulayın. Deneysel çanaktaki durulama ortamını epire ettikten sonra interferon gama ile desteklenmiş 10 mililitre aktivasyon ortamı ekleyin. Ve kontrol kabına interferon gaması olmadan 10 mililitre aktivasyon ortamı ekleyin, ardından hücreleri 16 ila 24 saat kuluçkaya yatırın.Kuluçkanın sonunda, ortak kültürleri hazırlamak için, aktivasyon ortamını makrofaj hücrelerinden çıkarın ve beş mililitre taze büyüme ortamı ekleyin. Hücreleri hafifçe kazımak ve hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe toplamak için bir hücre kaldırıcı kullanın. Daha sonra, Trypan Blue dışlama ve hemositometri kullanarak hücreleri sayın, ardından kontrol hazırlığı ve tedavi makrofaj hücresi süspansiyonları mililitre başına iki kez 10 ila beşinci hücreler konsantrasyonda mezenkimal kök hücreler için daha önce gösterildiği gibi.Mezenkimal kök hücreler içeren deneysel kuyulardan ortamı hafifçe aspire edin. Tedavi edilen 100 mikrolitreyi eklemek ve plaka tasarımına göre uygun deneysel kuyularda makrofaj hücresi süspansiyonlarını kontrol etmek için çok kanallı bir mikropipette kullanın ve gösterildiği gibi bir gecede kuluçkaya yatırın. Mezenkimal kök hücreler içeren dört duvarlı oda kaydıraktan ortamı hafifçe aspire edin.Tasarıma göre uygun kuyulara 530 mikrolitre makrofaj hücresi süspansiyonu eklemek ve bir gecede kuluçkaya yatmak için bir mikropipette kullanın. Bir miligram Zymosan parçacığı içeren şişeye bir mililitre canlı hücre görüntüleme ortamı ekleyin ve orta parçacık karışımını bir cam kültür tüpüne toplayın. Şişeyi ek bir mililitre görüntüleme çözeltisi ile duruladıktan sonra, durulanmış görüntüleme ortamını cam tüpe aktarın, ardından mililitre Zymosan parçacık süspansiyonu başına 0,2 miligram elde etmek için üç mililitre ek görüntüleme çözeltisi ekleyin.Vortex the Zymosan süspansiyonu 30 ila 60 saniye boyunca hızlı darbeler kullanarak, ardından süspansiyonu 60 hızlı darbe ile sonicate etmek için bir prob sonicator kullanın. Ortamı aspire ettikten sonra, deneysel kuyuları ve reaktif boş kuyuları 100 mikrolitre canlı hücre görüntüleme çözeltisi ile durulayın. Daha sonra, canlı hücre görüntüleme solüsyonını kuyulardan epire edin ve Zymosan süspansiyonunun 100 mikrolitresini ekleyin.Dokunmatik yüzey arayüzünü kullanarak floresan okuyucunun plaka tepsisini açın. Tabağı sol üst köşede A1 kuyusu ile tepside kapaksız olarak ayarlayın. Dokunmatik yüzeyi kullanarak tepsiyi kapatın ve üst menüdeki yeşil okuma düğmesine tıklayın.Fagositoz testini yapmak için, görüntüleme ortamının 750 mikrolitresi ile ilk deneysel kuyuyu durulamadan sonra, kalan kuyuları büyüme ortamında bırakarak Zymosan süspansiyonunun 400 mikrolitresini ekleyin. Ardından, slaydı görüntüleme sisteminin inkübe edilmiş aşamasına yerleştirin. Görüntüleme yazılımını kullanın.Bul sekmesinin altındaki Brightfield seçeneğini belirleyin ve göz merceği simgesine tıklayın. 10X hedefiyle, hücrelere odaklanmak için göz merceği ve odaklama düğmesini kullanın. Edinme sekmesini seçin.Deneme açılır menüsünü açın ve pH'a duyarlı boyanın 509 nanometresini ekscitasyon ve 533 nanometre emisyon dalga boylarını barındıracak EGFP filtre setini içeren bir dalga boyları kümesi seçin. Zamanlayıcıda yaklaşık iki dakika kaldığında, hedefi 20X olarak değiştirmek için nesnel menüdeki 20X simgesine tıklayın, ardından kanallar menüsüne tıklayın, EGFP filtrelerini seçin ve pozlama menüsünde pH'a duyarlı yeşil floroforu tespit etmek için pozlama süresini 400 milisaniye olarak ayarlayın ve ardından canlı yayına tıklayın. Odağı ayarladıktan sonra, ışığı kapatmak için dur'a tıklayın ve üst zaman atlamalı deneysel ayarın yanındaki kutuyu işaretleyin.Odaklama stratejisi menüsünde, yazılım otomatik odaklama'yı seçin ve açılır menüden, otomatik odaklama çalışırken ışığa maruz kalma süresini azaltmak için akıllı ve çekirdek ayarları seçin. Zaman atlamalı menüde, istenen alım sayısını 30 ila 60, aralık süresini bir dakika olarak ayarlayın ve ardından edinmeye başlamak için denemeyi başlat düğmesine tıklayın. Interferon gamanın ortak kültür üzerindeki etkisi incelenmiştir.Temsili sonuçlar, makrofajların mezenkimal kök hücrelerle ortak kültürünün makrofajın fagositik aktivitesini artırdığını göstermektedir. Interferon gama tedavisi makrofajın aktivitesini azaltır. Ancak mezenkimal kök hücrelerin varlığında makrofaj fagositik aktivitesi kısmen kurtarıldı.Bu çalışmalarda optimal hücre yoğunlukları kritik öneme sahiptir. Makrofaj hücreleri çok düşük yoğunlukta kaplandığında floresan yoğunluğunda değişiklikler tespit edildi. Makrofaj hücreleri yüksek yoğunlukta kaplandığında, floresan yoğunluğu tüm gruplarda hızla yükselmiş ve farklılıklar farkedilmemektedir.Bu işlem sırasında en önemli şeylerden biri, hücre yoğunluklarının optimize edilmesini ve deneyler arasında tutarlı tutulmasını sağlamaktır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

2-Foton Mikroskopi kullanarak Fare Thymus intravital Görüntüleme

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Fungal Patojen Fagositoz Canlı hücre video Mikroskopi

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

In vivo Görüntüleme Yöntemi Akut ve Kronik İltihap ayırt

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Retina Pigment Epitel Hücreleri üzerinde Fagositoz Tahliller için Domuz veya Sığır fotoreseptör dış Kesimleri Büyük Ölçekli Arıtma

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Makrofaj Fagositoz ve Aktin Polimerizasyon Değerlendirme Yüksek Verimli Florimetrik Tekniği

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Makrofaj Kolesterol tükenmesi ve Fagositoz Üzerine Etkisi<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

İnsan Mezenkimal Kök Hücre İmmünomodüler Properties (MKH) değerlendirilmesi

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Enfeksiyon Hastalıkları Modeli Olarak Organoids: Helicobacter Pylori ve İnsan Kültür ve kemirgen Mide Organoids ve Mikroenjeksiyon

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

Doymuş yağ asitleri Ceramide ilişkili makrofaj hücre ölümüne neden

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...