Name: study of dendritic cell development by short hairpin rna-mediated gene knockdown in a hematopoietic stem and progenitor cell line in vitro
Uploaded: 2022-03-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of Dendritic Cell Development by Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in a Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Line In vitro at JoVE.com

Wir sind dankbar für die technische Unterstützung von Dr. Tz-Ling Chen. Wir danken der National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Taiwan) für die Bereitstellung von shRNA Lentivirus (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw). Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 und MOST 109-2320-B-002-054-MY3) unterstützt.

Die Handhabung des Lentivirus erfolgt gemäß den Vorschriften der Abteilung für Umweltgesundheit und -sicherheit des National Taiwan University College of Medicine.
1. Herstellung von immortalisierten hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzelllinien (iHSPCs)
<ol><li>Halten Sie die iHSPC-Zelllinie in einem vollständigen RPMI 1640-Medium mit 100 ng/ml FL und 1 μM β-Östradiol.</li>
	<li>Passieren Sie die Zellen in einem Verhältnis von 1:10 alle 3 Tage. HINWEIS: Machen Sie das vollst?...

<ol>
	<li>Steinman, R. M., Witmer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+dendritic+cells+are+potent+stimulators+of+the+primary+mixed+leukocyte+reaction+in+mice.">Lymphoid dendritic cells are potent stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (10), 5132-5136 (1978).</li><li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells,+monocytes+and+macrophages:+a+unified+nomenclature+based+on+ontogeny.">Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).</li><li>Blasius, A. L., Cella, M., Maldonado, J., Takai, T., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siglec-H+is+an+IPC-specific+receptor+that+modulates+type+I+IFN+secretion+through+DAP12.">Siglec-H is an IPC-specific receptor that modulates type I IFN secretion through DAP12.</a> Blood. 107 (6), 2474-2476 (2006).</li><li>Swiecki, M., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+functions+of+plasmacytoid+dendritic+cells+during+viral+infections,+autoimmunity,+and+tolerance.">Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance.</a> Immunology Reviews. 234 (1), 142-162 (2010).</li><li>Liu, Y. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IPC:+Professional+Type+1+interferon-producing+cells+and+plasmacytoid+dendritic+cell+precursors.">IPC: Professional Type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors.</a> Annual Review of Immunology. 23 (1), 275-306 (2005).</li><li>Panda, S. K., Kolbeck, R., Sanjuan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells+in+autoimmunity.">Plasmacytoid dendritic cells in autoimmunity.</a> Current Opinion in Immunology. 44, 20-25 (2017).</li><li>Durai, V., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+murine+dendritic+cells.">Functions of murine dendritic cells.</a> Immunity. 45 (4), 719-736 (2016).</li><li>Mashayekhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8&#945;(+)+dendritic+cells+are+the+critical+source+of+interleukin-12+that+controls+acute+infection+by+Toxoplasma+gondii+tachyzoites.">CD8&#945;(+) dendritic cells are the critical source of interleukin-12 that controls acute infection by Toxoplasma gondii tachyzoites.</a> Immunity. 35 (2), 249-259 (2011).</li><li>Anderson, D. A., Dutertre, C. -. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+human+and+mouse+dendritic+cell+development+and+function.">Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function.</a> Nature Reviews Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).</li><li>Plantinga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+and+monocyte-derived+CD11b(+)+dendritic+cells+initiate+and+maintain+T+helper+2+cell-mediated+immunity+to+house+dust+mite+allergen.">Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen.</a> Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).</li><li>Persson, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRF4+transcription-factor-dependent+CD103(+)CD11b(+)+dendritic+cells+drive+mucosal+T+helper+17+cell+differentiation.">IRF4 transcription-factor-dependent CD103(+)CD11b(+) dendritic cells drive mucosal T helper 17 cell differentiation.</a> Immunity. 38 (5), 958-969 (2013).</li><li>Kumamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD301b++dermal+dendritic+cells+drive+T+helper+2+cell-mediated+immunity.">CD301b+ dermal dendritic cells drive T helper 2 cell-mediated immunity.</a> Immunity. 39 (4), 733-743 (2013).</li><li>Cisse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+E2-2+is+an+essential+and+specific+regulator+of+plasmacytoid+dendritic+cell+development.">Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development.</a> Cell. 135 (1), 37-48 (2008).</li><li>Grajkowska, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-specific+expression+and+feedback+regulation+of+E+protein+TCF4+control+dendritic+cell+lineage+specification.">Isoform-specific expression and feedback regulation of E protein TCF4 control dendritic cell lineage specification.</a> Immunity. 46 (1), 65-77 (2017).</li><li>Jackson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Id2+expression+delineates+differential+checkpoints+in+the+genetic+program+of+CD8&#945;++and+CD103++dendritic+cell+lineages.">Id2 expression delineates differential checkpoints in the genetic program of CD8&#945;+ and CD103+ dendritic cell lineages.</a> The EMBO Journal. 30 (13), 2690-2704 (2011).</li><li>Suzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+roles+of+interferon+regulatory+factor+4+in+CD11bhighCD8alpha-+dendritic+cell+development.">Critical roles of interferon regulatory factor 4 in CD11bhighCD8alpha- dendritic cell development.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 101 (24), 8981-8986 (2004).</li><li>Rodrigues, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+progenitor+lineages+contribute+to+the+heterogeneity+of+plasmacytoid+dendritic+cells.">Distinct progenitor lineages contribute to the heterogeneity of plasmacytoid dendritic cells.</a> Nature Immunology. 19 (7), 711-722 (2018).</li><li>Brown, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+basis+of+mouse+and+human+dendritic+cell+heterogeneity.">Transcriptional basis of mouse and human dendritic cell heterogeneity.</a> Cell. 179 (4), 846-863 (2019).</li><li>Redecke, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+progenitor+cell+lines+with+myeloid+and+lymphoid+potential.">Hematopoietic progenitor cell lines with myeloid and lymphoid potential.</a> Nature Methods. 10 (8), 795-803 (2013).</li><li>Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polybrene+increases+the+efficiency+of+gene+transfer+by+lipofection.">Polybrene increases the efficiency of gene transfer by lipofection.</a> Gene Therapy. 5 (5), 708-711 (1998).</li><li>Sorgi, F. L., Bhattacharya, S., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protamine+sulfate+enhances+lipid-mediated+gene+transfer.">Protamine sulfate enhances lipid-mediated gene transfer.</a> Gene Therapy. 4 (9), 961-968 (1997).</li><li>Kirkling, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+facilitates+in+vitro+generation+of+cross-presenting+classical+dendritic+cells.">Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells.</a> Cell Reports. 23 (12), 3658-3672 (2018).</li><li>Pearce, E. J., Everts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+metabolism.">Dendritic cell metabolism.</a> Nature Reviews. Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).</li><li>Wculek, S. K., Khouili, S. C., Priego, E., Heras-Murillo, I., Sancho, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Control+of+Dendritic+Cell+Functions:+Digesting+Information.">Metabolic Control of Dendritic Cell Functions: Digesting Information.</a> Frontiers in Immunology. 10 (775), (2019).</li><li>Saxton, R. A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+signaling+in+growth,+metabolism,+and+disease.">mTOR signaling in growth, metabolism, and disease.</a> Cell. 168 (6), 960-976 (2017).</li></ol>

Lentivirus-basierte shRNA-Vektoren werden häufig für das Gen-Silencing durch virale Transduktion in Zellen verwendet und ermöglichen eine stabile Integration in das Wirtsgenom. Es müssen jedoch verschiedene Transduktionseffizienzen in verschiedenen Zelltypen berücksichtigt werden, und es wurden eine Reihe von Ansätzen verfolgt, um dieses Problem zu lösen. 
Polybren ist ein polykationisches Polymer, das die Ladungen auf der Zellmembran neutralisieren kann, wodurch die Bindung des Virions...

DCs sind wichtige Regulatoren der angeborenen und adaptiven Immunität1. DCs werden hauptsächlich in zwei funktional unterschiedliche Populationen eingeteilt, nämlich pDCs und cDCs. Darüber hinaus umfassen cDCs zwei Untergruppen, nämlich Typ I und Typ II cDCs oder cDC1s bzw. cDC2s2s. pDCs, die BST2, Siglec-H und mittlere CD11c-Spiegel in Mäusen exprimieren3,4, sind die Zellen, die während Entzündungen und Virusinfektionen große Mengen an IFN-I sezernieren können5. Aufgrund ihrer robusten IFN-I-produzierenden Fähigkeit stehen sie auch im Verdacht, eine Schlüsselrolle beim Fortschreiten von Autoimmunerkrankungen, einschließlich des systemischen Lupus erythematodes (SLE)6, zu spielen. cDC1s, definiert durch die Oberflächenexpression von XCR1, CD8a, CLEC9A und CD103 in Mäusen7, sind auf die Aktivierung und Polarisation von zytotoxischen CD8+ T-Zellen (CTLs) durch die Antigen-Kreuzpräsentation spezialisiert und initiieren dadurch eine Typ-I-Immunität als Reaktion auf intrazelluläre Erreger und Krebs8,9. Auf der anderen Seite können cDC2s, die CD11b und CD172α (auch bekannt als Sirpα) sowohl bei Menschen als auch bei Mäusen exprimieren, CD4+ T-Zellen aktivieren und die Typ-II-Immunantwort gegen Allergene und Parasiten10 fördern sowie die Typ-III-Immunität nach extrazellulärer Bakterien und Mikrobiota-Erkennung modulieren11,12.
Die Diversifikation von DCs wird durch eine Gruppe von TFs aus hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) im BM bestimmt. E2-2 (kodiert von Tcf4) ist ein Hauptregulator für die Differenzierung und Funktion von pDCs13,14. Im Gegensatz dazu treibt der Inhibitor der DNA-Bindung 2 (ID2) die cDC-Spezifikation voran und hemmt die pDC-Entwicklung durch Blockierung der E-Proteinaktivität15. Darüber hinaus erfordert die Entwicklung von cDC1 IRF8 und BATF3, während die Differenzierung von cDC2s stark von IRF416 abhängt. Neuere Arbeiten haben die Heterogenität von pDCs17 und cDCs und deren transkriptioneller Regulation untersucht18. Aufgrund der Komplexität des DC-Netzwerks besteht ein unerfüllter Bedarf, eine Plattform einzurichten, um andere TFs zu identifizieren, die die Entwicklung und Funktionalität von DCs steuern.
Hier verwendeten wir einen iHSPC, der durch Exprimieren von Östrogen-regulierter Kerntranslokation von Hoxb8 in BM-Zellen (auch hoxb8-FL-Zellen genannt) erzeugt wurde19. iHSPCs können sich in Gegenwart von β-Östradiol und Flt3-Liganden (FL) vermehren und in einem undifferenzierten Stadium verbleiben, während sie sich in Gegenwart von FL nach Abzug von β-Östradiol19 in verschiedene DC-Typen zu differenzieren beginnen. Basierend auf dieser Eigenschaft können wir Interessante Gene im Vorläuferstadium niederschlagen, gefolgt von der Untersuchung der Wirkung auf die In-vitro-Differenzierung von pDCs und cDCs. Daher ist diese Methode ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Gene zu entdecken, die die Entwicklung und Funktion von DCs regulieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti-mouse CD11c Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117324</td>
			<td>(Clone: N418)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse/human CD11b Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101206</td>
			<td>(Clone: M1/70)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse/human B220 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103208</td>
			<td>(Clone: RA3-6B2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Micro tube</td>
			<td>&#160;ExtraGene</td>
			<td>TUBE-170-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well tissue culture-treated plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-estradiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E2758-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td>home-made</td>
			<td></td>
			<td>Formula: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flt3 ligand (FL)</td>
			<td>home-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pr-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIsure</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-38032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shRNA (Taregt sequence/clone ID)</td>
			<td>Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shId2&#160; (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)</td>
			<td>The RNAi Consortium (TRC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)</td>
			<td>The RNAi Consortium (TRC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)</td>
			<td>The RNAi Consortium (TRC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of dendritic cell development by short hairpin rna-mediated gene knockdown in a hematopoietic stem and progenitor cell line in vitro

Dendritische Zellen (DCs) sind wichtige Antigen-präsentierende Zellen, die angeborene und adaptive Immunantworten verbinden. DCs sind heterogen und können in konventionelle DCs (cDCs) und plasmazytoide DCs (pDCs) unterteilt werden. cDCs ist darauf spezialisiert, naiven T-Zellen Antigene zu präsentieren und zu aktivieren. Auf der anderen Seite können pDCs während einer Virusinfektion große Mengen an Typ-I-Interferonen (IFN-I) produzieren. Die Spezifizierung von DCs erfolgt in einem frühen Stadium von DC-Vorläufern im Knochenmark (BM) und wird durch ein Netzwerk von Transkriptionsfaktoren (TFs) definiert. Zum Beispiel drücken CDCs ID2 hoch aus, während pDCs E2-2 stark ausdrücken. Da immer mehr Teilmengen von DCs identifiziert werden, besteht ein wachsendes Interesse daran, spezifische TFs zu verstehen, die die DC-Entwicklung steuern. Hier etablieren wir eine Methode zum Screening von TFs, die für die DCs-Differenzierung in vitro entscheidend sind, indem lentivirus-tragende kurzhaarnadelige RNA (shRNA) in eine immortalisierte hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzelllinie (iHSPCs) abgegeben wird. Nach der Selektion und In-vitro-Differenzierung werden cDC- und pDC-Potential der stabilen Knockdown-Zelllinien mittels Durchflusszytometrie analysiert. Dieser Ansatz bietet eine Plattform, um Gene zu identifizieren, die möglicherweise das DC-Schicksal von Vorläufern in vitro bestimmen.

Die Karte des lentiviralen Vektors pLKO.1-Puro ist dargestellt (Abbildung 1). Nach der Verabreichung von Lentivirus- exprimierender shRNA gegen LacZ (eine Nicht-Targeting-Kontrolle), Tcf4 und Id2 in iHSPCs zeigte die durch RT-qPCR bestätigte Knockdown-Effizienz, dass die Expression von Tcf4 in shTcf4-iHSPCs im Vergleich zu shLacZ-iHSPCs reduziert war (Abbildung 2A). Auf der anderen Seite wurde die vermindert...

Watch this Scientific Journal Video about Study of Dendritic Cell Development by Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in a Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Line In vitro at JoVE.com

Study of Dendritic Cell Development by Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in a Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Line In vitro

Hier stellen wir ein Protokoll für das Screening potenzieller Transkriptionsfaktoren zur Verfügung, die an der Entwicklung dendritischer Zellen (DC) beteiligt sind, unter Verwendung der lentiviralen Transduktion von shRNA, um stabile Knockdown-Zelllinien für die In-vitro-DC-Differenzierung zu erhalten.

Untersuchung der dendritischen Zellentwicklung durch kurze Haarnadel RNA-vermittelte Gen-Knockdown in einem hämatopoetischen Stamm und Vorläuferzelllinie In vitro

Dendritic cells (DCs) are important antigen-presenting cells that connect innate and adaptive immune responses. DCs are heterogeneous and can be divided ...

Dendritische Zellen oder DCs sind wichtige Immunzellen, die das angeborene und adaptive Immunsystem verbinden. Während DCs heterogen sind, hilft uns diese Methode zu verstehen, welche Gene, einschließlich Transkriptionsfaktoren, die DC-Entwicklung regulieren können. Diese Technik bietet eine einfache und schnelle Möglichkeit, ein Gen zu identifizieren, das die DC-Entwicklung von ihrem Vorläufer in vitro steuert.Halten Sie zunächst die immortalisierten hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen oder iHSPCs in einem vollständigen RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 100 Nanogramm pro Milliliter des FLT3-Liganden und einem mikromolaren Beta-Östradiol. Für die lentivirale Transduktion werden die iHSPCs in 12 Well-Platten mit einer Dichte von eins mal 10 zu den fünften Zellen pro Vertiefung und einem Milliliter vollständigem Medium, das den FLT3-Liganden, Beta-Östradiol und Polybren enthält, plattiert. Fügen Sie dann das Lentivirus hinzu, das die kurze Haarnadel-RNA in jeder Vertiefung bei einer Vielzahl von Infektionen von 100 trägt.Als nächstes drehen Sie die Platte bei 1100 mal g und 37 Grad Celsius für 90 Minuten und inkubieren Sie dann die infizierten Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am folgenden Tag wird das Polybren entfernt, indem die Zellen in Zentrifugation in 15-Milliliter-Röhrchen gesammelt werden, nachdem das Medium durch ein frisches vollständiges Medium ersetzt wird, das den FLT3-Liganden und das Beta-Östradiol enthält. Nach weiteren 24 Stunden sechs Mikrogramm pro Milliliter Puromycin in das Medium geben, um die infizierten Zellen auszuwählen.Ersetzen Sie das Selektionsmedium alle drei Tage und halten Sie die Zellen mindestens eine Woche lang, um die stabil transduzierten iHSPCs zu erweitern. Generieren und pflegen Sie stabile Knockdown-iHSPCs für LacZ, Tcf4 und Id2 in einem vollständigen Medium, das mit dem FLT3-Liganden und Beta-Östradiol ergänzt wird. Um die In-vitro-Differenzierung einzuleiten, werden die undifferenzierten iHSPCs in 15-Milliliter-Röhrchen gesammelt und die Zellen durch Zentrifugation pelletiert.Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen und die Zellen zweimal mit 10 Milliliter PBS waschen. Nach der zweiten Wäsche resuspendieren Sie die Zellen in einem vollständigen Medium, das nur den FLT3-Liganden enthält, und säen Sie sie dann mit einer Dichte von zweimal 10 bis zum fünften Verkauf pro Milliliter in eine 12-Well-Platte. Nach drei Tagen fügen Sie einen Milliliter frisches komplettes Medium hinzu, das den FLT3-Liganden enthält.Nach weiteren zwei Tagen fahren Sie mit der Analyse der differenzierten Zellen mittels Durchflusszytometrie fort. Für die durchflusszytometrische Analyse pipettieren Sie die Zellen zwei- bis dreimal in der Platte nach oben und unten und sammeln die Zellen dann in 1,5 Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen und entsorgen Sie den Überstand, bevor Sie die Zellen in 50 Mikroliter Faxpuffer wiederverwenden.Als nächstes fügen Sie 50 Mikroliter Anti-CD16 durch 32 Hybridom-Überstand hinzu und inkubieren Sie für fünf bis 10 Minuten auf Eis. Fügen Sie dann fluoreszierende Farbstoff-konjugierte Antikörper direkt zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie für 15 Minuten auf Eis im Dunkeln. Nach der Inkubation die Zellen mit einem Milliliter Faxpuffer waschen und die Probe zentrifugieren.Nach der Zentrifugation resuspenieren Sie die Zellen in 100 Mikroliter Faxpuffer und analysieren die Proben mittels Durchflusszytometrie. Nach einem kurzen Haarnadel-RNA-vermittelten Knockdown von LacZ, Tcf4 und Id2 in iHSPCS zeigte die Bestätigung der Knockdown-Effizienz durch RTQ-PCR, dass die Expression von Tcf4- und Tcf4-Knockdown-iHSPCs im Vergleich zu der in LacZ-Knockdown-iHSPCs reduziert war. Ähnliche Ergebnisse wurden für die Id2-Expression in den Id2-Knockdown-iHSPCs beobachtet.Nach der Kultivierung von LacZ-Knockdown-iHSPCs für fünf Tage lag die Häufigkeit von CD11c-positiven Zellen, die die dendritische Zellpopulation darstellen, bei etwa 95%. Eine weitere Analyse von CD11c-positiven dendritischen Zellen, die aus den LacZ-Knockdown-iHSPCs gewonnen wurden, ergab, dass 70% konventionelle dendritische Zellen waren, während 22% plasmazytoide dendritische Zellen waren. Die Tcf4-Knockdown-iHSPCs erzeugten einen signifikant geringeren Prozentsatz an plasmazytoide dendritischen Zellen, die der LacZ-Knockdown kontrolliert.Im Gegensatz dazu erzeugten die Id2-Knockdown-iHSPCs einen signifikant geringeren Prozentsatz herkömmlicher dendritischer Zellen als die LacZ-Knockdown-Kontrollen, aber einen höheren Prozentsatz an plasmazytoden dendritischen Zellen. Spin-Infektionen erhöhen die Transduktionseffizienz von Lentivirus-tragender shRNA in die iHSPCs. Diese Technik befasst sich mit der Rolle von Transkriptionsfaktoren und erleichtert die Untersuchung anderer Gene in der Zytokin-Signaltransduktion oder im Metabolismus, die wahrscheinlich an der DC-Entwicklung beteiligt sind.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Study of Dendritic Cell Development by Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in a Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Line In vitro

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Generierung von Multivirus-spezifischen T-Zellen zu verhindern / zu behandeln virale Infektionen nach allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Analyse der Lungen-Reifung von dendritischen Zellen und Migration während der allergischen Atemwegsentzündung

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

PRP als neuer Ansatz, um eine Infektion zu verhindern: Vorbereitung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Antimikrobielle Eigenschaften von PRP

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Generierung eines neuartigen Dendritisch-Zell-Impfstoffs mit Melanom- und Plattenkrebs-Stammzellen

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

Eine Tetracyclin-regulierten Zelllinie produziert qualitativ Titer lentiviralen Vektoren, die gezielt Dendritische Zellen

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Identifizierung von DNA-Mutationen in hämatopoetischen Stammzellen Gereinigtes / Vorläuferzellen

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Die Beurteilung der Entwicklung der Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen in Peyer-Patches mit Adoptiv Übertragung von hämatopoetischen Vorläuferzellen

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Eine einfache und effiziente Methode zu konstruieren Mutant Vacciniavirusvektoren

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Entwicklung und Identifizierung eines neuen Subpopulation von humanen neutrophilen abgeleiteten Riesen Phagozyten<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Ein Saug Blister-Protokoll, menschliche T-Zelle Recall Antworten In Vivo zu studieren

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...