Name: study of dendritic cell development by short hairpin rna-mediated gene knockdown in a hematopoietic stem and progenitor cell line in vitro
Uploaded: 2022-03-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of Dendritic Cell Development by Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in a Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Line In vitro at JoVE.com

Dr. Tz-Ling Chen'in teknik desteği için minnettarız. Ulusal RNAi Çekirdek Tesisi'ne (Academia Sinica, Tayvan) shRNA lentivirüs (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw) sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma Bilim ve Teknoloji Bakanlığı, Tayvan (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 ve MOST 109-2320-B-002-054-MY3) tarafından desteklendi.

Lentivirüsün kullanımı, Ulusal Tayvan Üniversitesi Tıp Fakültesi Çevre Sağlığı ve Güvenliği Bölümü'nün düzenlemesine göre gerçekleştirilir.
1. Ölümsüzleştirilmiş hematopoetik gövde ve progenitör hücre hatlarının (iHSPC'ler) hazırlanması
<ol><li>iHSPC hücre hattını 100 ng/mL FL ve 1 μM β-estradiol içeren eksiksiz RPMI 1640 ortamında koruyun.</li>
	<li>Hücreleri her 3 günde bir 1:10 oranında geçiştirin. NOT: %10 fetal sığır serumu (FBS), 5 x ...

<ol>
	<li>Steinman, R. M., Witmer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+dendritic+cells+are+potent+stimulators+of+the+primary+mixed+leukocyte+reaction+in+mice.">Lymphoid dendritic cells are potent stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (10), 5132-5136 (1978).</li><li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells,+monocytes+and+macrophages:+a+unified+nomenclature+based+on+ontogeny.">Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).</li><li>Blasius, A. L., Cella, M., Maldonado, J., Takai, T., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siglec-H+is+an+IPC-specific+receptor+that+modulates+type+I+IFN+secretion+through+DAP12.">Siglec-H is an IPC-specific receptor that modulates type I IFN secretion through DAP12.</a> Blood. 107 (6), 2474-2476 (2006).</li><li>Swiecki, M., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+functions+of+plasmacytoid+dendritic+cells+during+viral+infections,+autoimmunity,+and+tolerance.">Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance.</a> Immunology Reviews. 234 (1), 142-162 (2010).</li><li>Liu, Y. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IPC:+Professional+Type+1+interferon-producing+cells+and+plasmacytoid+dendritic+cell+precursors.">IPC: Professional Type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors.</a> Annual Review of Immunology. 23 (1), 275-306 (2005).</li><li>Panda, S. K., Kolbeck, R., Sanjuan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells+in+autoimmunity.">Plasmacytoid dendritic cells in autoimmunity.</a> Current Opinion in Immunology. 44, 20-25 (2017).</li><li>Durai, V., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+murine+dendritic+cells.">Functions of murine dendritic cells.</a> Immunity. 45 (4), 719-736 (2016).</li><li>Mashayekhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8&#945;(+)+dendritic+cells+are+the+critical+source+of+interleukin-12+that+controls+acute+infection+by+Toxoplasma+gondii+tachyzoites.">CD8&#945;(+) dendritic cells are the critical source of interleukin-12 that controls acute infection by Toxoplasma gondii tachyzoites.</a> Immunity. 35 (2), 249-259 (2011).</li><li>Anderson, D. A., Dutertre, C. -. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+human+and+mouse+dendritic+cell+development+and+function.">Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function.</a> Nature Reviews Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).</li><li>Plantinga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+and+monocyte-derived+CD11b(+)+dendritic+cells+initiate+and+maintain+T+helper+2+cell-mediated+immunity+to+house+dust+mite+allergen.">Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen.</a> Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).</li><li>Persson, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRF4+transcription-factor-dependent+CD103(+)CD11b(+)+dendritic+cells+drive+mucosal+T+helper+17+cell+differentiation.">IRF4 transcription-factor-dependent CD103(+)CD11b(+) dendritic cells drive mucosal T helper 17 cell differentiation.</a> Immunity. 38 (5), 958-969 (2013).</li><li>Kumamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD301b++dermal+dendritic+cells+drive+T+helper+2+cell-mediated+immunity.">CD301b+ dermal dendritic cells drive T helper 2 cell-mediated immunity.</a> Immunity. 39 (4), 733-743 (2013).</li><li>Cisse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+E2-2+is+an+essential+and+specific+regulator+of+plasmacytoid+dendritic+cell+development.">Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development.</a> Cell. 135 (1), 37-48 (2008).</li><li>Grajkowska, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-specific+expression+and+feedback+regulation+of+E+protein+TCF4+control+dendritic+cell+lineage+specification.">Isoform-specific expression and feedback regulation of E protein TCF4 control dendritic cell lineage specification.</a> Immunity. 46 (1), 65-77 (2017).</li><li>Jackson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Id2+expression+delineates+differential+checkpoints+in+the+genetic+program+of+CD8&#945;++and+CD103++dendritic+cell+lineages.">Id2 expression delineates differential checkpoints in the genetic program of CD8&#945;+ and CD103+ dendritic cell lineages.</a> The EMBO Journal. 30 (13), 2690-2704 (2011).</li><li>Suzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+roles+of+interferon+regulatory+factor+4+in+CD11bhighCD8alpha-+dendritic+cell+development.">Critical roles of interferon regulatory factor 4 in CD11bhighCD8alpha- dendritic cell development.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 101 (24), 8981-8986 (2004).</li><li>Rodrigues, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+progenitor+lineages+contribute+to+the+heterogeneity+of+plasmacytoid+dendritic+cells.">Distinct progenitor lineages contribute to the heterogeneity of plasmacytoid dendritic cells.</a> Nature Immunology. 19 (7), 711-722 (2018).</li><li>Brown, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+basis+of+mouse+and+human+dendritic+cell+heterogeneity.">Transcriptional basis of mouse and human dendritic cell heterogeneity.</a> Cell. 179 (4), 846-863 (2019).</li><li>Redecke, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+progenitor+cell+lines+with+myeloid+and+lymphoid+potential.">Hematopoietic progenitor cell lines with myeloid and lymphoid potential.</a> Nature Methods. 10 (8), 795-803 (2013).</li><li>Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polybrene+increases+the+efficiency+of+gene+transfer+by+lipofection.">Polybrene increases the efficiency of gene transfer by lipofection.</a> Gene Therapy. 5 (5), 708-711 (1998).</li><li>Sorgi, F. L., Bhattacharya, S., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protamine+sulfate+enhances+lipid-mediated+gene+transfer.">Protamine sulfate enhances lipid-mediated gene transfer.</a> Gene Therapy. 4 (9), 961-968 (1997).</li><li>Kirkling, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+facilitates+in+vitro+generation+of+cross-presenting+classical+dendritic+cells.">Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells.</a> Cell Reports. 23 (12), 3658-3672 (2018).</li><li>Pearce, E. J., Everts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+metabolism.">Dendritic cell metabolism.</a> Nature Reviews. Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).</li><li>Wculek, S. K., Khouili, S. C., Priego, E., Heras-Murillo, I., Sancho, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Control+of+Dendritic+Cell+Functions:+Digesting+Information.">Metabolic Control of Dendritic Cell Functions: Digesting Information.</a> Frontiers in Immunology. 10 (775), (2019).</li><li>Saxton, R. A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+signaling+in+growth,+metabolism,+and+disease.">mTOR signaling in growth, metabolism, and disease.</a> Cell. 168 (6), 960-976 (2017).</li></ol>

Lentivirüs bazlı shRNA vektörleri genellikle hücrelere viral transdüksiyon ile gen susturma için kullanılır ve konak genomuna istikrarlı entegrasyona izin verilir. Bununla birlikte, farklı hücre tiplerinde çeşitli transdüksiyon verimliliğinin göz önünde bulundurulması gerekir ve bu sorunun üstesinden gelmek için bir dizi yaklaşımda olunmuştur. 
Polibren, hücre zarındaki yükleri nötralize edebilen ve böylece transdüksiyon20 sırasında viryonun hücrelere bağlanma...

DC'ler doğuştan gelen ve uyarlanabilir bağışıklığın temel düzenleyicileridir1. DC'ler esas olarak işlevsel olarak farklı iki popülasyona, yani PDC'lere ve CDC'lere ayrılır. Ayrıca, cDC'ler iki alt kümeden oluşur, yani tip I ve tip II cDC'ler veya cDC1'ler ve cDC2'ler, sırasıyla2. farelerde BST2, Siglec-H ve orta düzey CD11c'yi ifade eden pDC'ler3,4, iltihaplanma ve viral enfeksiyon sırasında büyük miktarlarda IFN-I salgılayabilen hücrelerdir5. Sağlam IFN-I-üretim yetenekleri nedeniyle, sistemik lupus eritematozus (SLE)6 da dahil olmak üzere otoimmün hastalıkların ilerlemesinde kilit rol oynadıklarından şüphelenilmektedir. Fare7'de XCR1, CD8a, CLEC9A ve CD103'ün yüzey ekspresyözü ile tanımlanan cDC1'ler, sitotoksik CD8 + T hücrelerinin (CTL' ler) antijen çapraz sunumu yoluyla aktivasyonu ve polarizasyonu konusunda uzmanlaşmıştır, böylece hücre içi patojenlere ve kansere yanıt olarak tip I bağışıklığı başlatılır8,9. Öte yandan, hem insanlarda hem de farelerde CD11b ve CD172α'yı (Sirpα olarak da bilinir) ifade eden cDC2'ler, CD4 + T hücrelerini aktive edebilir ve alerjen ve parazitlere karşı tip II bağışıklık tepkisini teşvik edebilir10, ayrıca hücre dışı bakteriler ve mikrobiyota tanımayı takiben tip III bağışıklığı modüle edebilir11,12.
DC'lerin çeşitlendirilmesi, BM'deki hematopoetik kök ve progenitör hücrelerden (HSPC' ler) bir grup TF tarafından belirlenir. Buna karşılık, DNA bağlama 2 (ID2) inhibitörü cDC spesifikasyonunu yönlendirir ve E protein aktivitesini engelleyerek pDC gelişimini engeller15. Ayrıca, cDC1'lerin geliştirilmesi IRF8 ve BATF3 gerektirirken, cDC2'lerin farklılaşması IRF416'ya bağlıdır. Son çalışmalar pDC'lerin heterojenliğini, CDC'leri17 ve cDC'leri ve transkripsiyonsal düzenlemelerini araştırdı18. DC ağının karmaşıklığı nedeniyle, DC'lerin gelişimini ve işlevselliğini kontrol eden diğer TF'leri tanımlamak için karşılanmamış bir platform kurma ihtiyacı vardır.
Burada, BM hücrelerinde (Hoxb8-FL hücreleri olarak da adlandırılır) Hoxb8'in östrojenle düzenlenmiş nükleer translokasyonunun ifade edildiği bir iHSPC kullandık 19. iHSPC'ler β-estradiol ve Flt3 ligand (FL) varlığında çoğalabilir ve farklılaşmamış bir aşamada kalabilirken, β-estradiol19'un çekilmesiyle FL'nin varlığında farklı DC türlerine farklılaşmaya başlarlar. Bu özelliğe dayanarak, progenitör aşamasında ilgi genlerini devirebilir, ardından PDC'lerin ve CDC'lerin in vitro farklılaşması üzerindeki etkisini inceleyebiliriz. Bu nedenle, bu yöntem DC'lerin gelişimini ve işlevini düzenleyen genleri keşfetmek için güçlü bir araçtır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti-mouse CD11c Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117324</td>
			<td>(Clone: N418)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse/human CD11b Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101206</td>
			<td>(Clone: M1/70)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse/human B220 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103208</td>
			<td>(Clone: RA3-6B2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Micro tube</td>
			<td>&#160;ExtraGene</td>
			<td>TUBE-170-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well tissue culture-treated plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-estradiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E2758-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td>home-made</td>
			<td></td>
			<td>Formula: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flt3 ligand (FL)</td>
			<td>home-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pr-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIsure</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-38032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shRNA (Taregt sequence/clone ID)</td>
			<td>Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shId2&#160; (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)</td>
			<td>The RNAi Consortium (TRC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)</td>
			<td>The RNAi Consortium (TRC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)</td>
			<td>The RNAi Consortium (TRC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of dendritic cell development by short hairpin rna-mediated gene knockdown in a hematopoietic stem and progenitor cell line in vitro

Dendritik hücreler (DC' ler), doğuştan gelen ve adaptif immün yanıtları birbirine bağlayan önemli antijen sunan hücrelerdir. DC'ler heterojendir ve geleneksel DC'lere (cDC' ler) ve plazmasikoid DC'lere (PDC'ler) ayrılabilir. cDC'ler naif T hücrelerine antijen sunma ve etkinleştirme konusunda uzmanlaşmıştır. Öte yandan, pDC'ler viral enfeksiyon sırasında büyük miktarlarda I tipi interferonlar (IFN-I) üretebilir. DC spesifikasyonu, kemik iliğindeki (BM) DC atalarının erken bir aşamasında ortaya çıkar ve transkripsiyon faktörleri (TF' ler) ağı ile tanımlanır. Örneğin, cDC'ler ID2'yi yüksek oranda ifade ederken, pDC'ler E2-2'yi yüksek oranda ifade ediyor. Giderek daha fazla DC alt kümesi tanımlandığından, DC gelişimini kontrol eden belirli TF'leri anlamaya yönelik artan bir ilgi vardır. Burada, kısa saç tokası RNA 'sı (shRNA) taşıyan lentivirüsü ölümsüzleştirilmiş hematopoetik kök ve progenitör hücre (iHSPC' ler) hattına ulaştırarak DC'lerin farklılaşması için kritik öneme sahip TF'leri taramak için bir yöntem oluşturuyoruz. Seçim ve in vitro farklılaşmadan sonra, kararlı devirme hücre hatlarının cDC ve pDC potansiyeli akış sitometrisi ile analiz edilir. Bu yaklaşım, potansiyel olarak DC kaderlerini yöneten genleri in vitro atalarından tanımlamak için bir platform sağlar.

Lentiviral vektör pLKO.1-Puro haritası gösterilmiştir (Şekil 1). LacZ (hedeflenmeyen bir kontrol), Tcf4 ve ID2'ye karşı shRNA'yı ifade eden lentivirüs'ün iHSPC'lerde teslim edildikten sonra, RT-qPCR tarafından onaylanan devirme verimliliği, ShLacZ iHSPC'lere kıyasla Tcf4 iHSPC'lerde Tcf4 ifadesinin azaldığını ortaya koydu (Şekil 2A). Öte yandan, shLacZ iHSPC'ler kontrolüne kıyas...

Watch this Scientific Journal Video about Study of Dendritic Cell Development by Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in a Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Line In vitro at JoVE.com

Study of Dendritic Cell Development by Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in a Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Line In vitro

Burada , in vitro DC farklılaşması için stabil nakavt hücre hatları elde etmek için shRNA'nın lentiviral transdüksiyonunu kullanarak dendritik hücrenin (DC) gelişiminde rol oynayan potansiyel transkripsiyon faktörlerini taramak için bir protokol sunuyoruz.

Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücre Hattı In vitrounda Kısa Saç Tokası RNA Aracılı Gen Knockdown ile Dendritik Hücre Gelişiminin İncelenmesi Çalışması

Dendritic cells (DCs) are important antigen-presenting cells that connect innate and adaptive immune responses. DCs are heterogeneous and can be divided ...

Dendritik hücreler veya DC'ler, doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık sistemini birbirine bağlayan temel bağışıklık hücreleridir. DC'ler heterojen olsa da, bu yöntem transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere hangi genlerin DC gelişimini düzenleyebileceğini anlamamıza yardımcı olur. Bu teknik, DC gelişimini kontrol eden bir geni progenitör in vitrolarından tanımlamak için basit ve hızlı bir yol sağlar.Başlamak için, ölümsüzleştirilmiş hematopoetik kök ve progenitör hücreleri veya iHSPC'leri, FLT3 ligandının mililitresi başına 100 nanogram ve bir mikromoler beta estradiol ile desteklenmiş tam RPMI 1640 ortamında koruyun. Lentiviral transdüksiyon için, iHSPC'leri kuyu başına beşinci hücrelere bir kez 10 ve FLT3 ligand, beta estradiol ve polibren içeren bir mililitre tam ortam yoğunluğunda 12 kuyu plakasında plakalayın. Daha sonra, 100'lük çok miktarda enfeksiyonda her kuyuda kısa saç tokası RNA'sını taşıyan lentivirüs ekleyin.Daha sonra, plakayı 1100 kez g ve 37 santigrat derecede 90 dakika döndürün, ardından enfekte hücreleri bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya bırakın. Ertesi gün, hücreleri santrifüjlemede 15 mililitre tüpe toplayarak polibreni çıkarın, medyayı FLT3 ligand ve beta estradiol içeren taze komple ortamla değiştirdikten sonra. Ek 24 saat sonra, enfekte hücreleri seçmek için ortama mililitre puromisicin başına altı mikrogram ekleyin.Seçim ortamını her üç günde bir değiştirin ve hücreleri en az bir hafta boyunca muhafaza ederek, saplı bir şekilde transdüklenmiş iHSPC'leri genişletin. LACZ, Tcf4 ve Id2 için FLT3 ligand ve beta estradiol ile birlikte eksiksiz bir ortamda kararlı nakavt iHSPC'leri oluşturun ve koruyun. İn vitro farklılaşmayı başlatmak için farklılaşmamış iHSPC'leri 15 mililitre tüpler halinde toplayın ve hücreleri santrifüjleme ile peletlayın.Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve hücreleri 10 mililitre PBS ile iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, hücreleri sadece FLT3 ligini içeren tam bir ortamda yeniden depolayın ve daha sonra mililitre başına 12 kuyu plakasına mililitre başına iki kez 10 ila beşinci satış yoğunluğunda tohumlayın. Üç gün sonra, FLT3 ligandını içeren bir mililitre taze tam ortam ekleyin.Ek iki gün sonra, farklılaştırılmış hücreleri akış sitometrisine göre analiz etmeye devam edin. Akış sitometrik analizi için, hücreleri plakada iki ila üç kez yukarı ve aşağı pipetlayın, ardından hücreleri 1,5 mililitrelik tüpler halinde toplayın. Tüpleri santrifüj edin ve hücreleri 50 mikrolitre faks arabelleği içinde yeniden canlandırmadan önce üst kapağı atın.Ardından, 32 hibridoma süpernatant tarafından 50 mikrolitre anti-CD16 ekleyin ve buz üzerinde beş ila 10 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, floresan boya konjuge antikorları doğrudan hücrelere ekleyin ve karanlıkta buz üzerinde 15 dakika kuluçkaya yatırın. İnkübasyondan sonra, hücreleri bir mililitre faks arabelleğiyle yıkayın ve örneği santrifüj edin.Santrifüjlemeden sonra, hücreleri 100 mikrolitre faks arabelleğine yeniden ayırın ve örnekleri akış sitometrisine göre analiz edin. iHSPCS'de LacZ, Tcf4 ve Id2'nin kısa saç tokası RNA aracılı nakavtlarından sonra, RTQ-PCR tarafından nakavt verimliliğinin onaylanması, Tcf4 ve Tcf4 nakavt iHSPC'lerinin ifadesinin LacZ knockdown iHSPC'lerdekine kıyasla azaldığını gösterdi. Benzer sonuçlar Id2 knockdown iHSPC'lerinde Id2 ifadesi için de gözlenmiştir.LacZ nakavt iHSPC'leri beş gün boyunca kült ettikten sonra, dendritik hücre popülasyonu temsil eden CD11c pozitif hücrelerin sıklığı% 95 civarındaydı, Ancak Tcf4 veya Id2'yi devirmek CD11c pozitif dendritik hücrelerin neslini biraz azalttı. LacZ nakavt iHSPC'lerinden elde edilen CD11c pozitif dendritik hücrelerin daha fazla analizi, %70'inin geleneksel dendritik hücreler, %22'sinin ise plazmasikoid dendritik hücreler olduğunu ortaya koydu. Tcf4 nakavt iHSPC'leri, LacZ nakavtının kontrol ettiği plazmasikoid dendritik hücrelerin önemli ölçüde daha düşük bir yüzdesini oluşturdu.Buna karşılık, Id2 nakavt iHSPC'leri LacZ devirme kontrollerinden önemli ölçüde daha düşük bir konvansiyonel dendritik hücre yüzdesi, ancak plazmasikoid dendritik hücrelerin daha yüksek bir yüzdesini oluşturdu. Spin enfeksiyonları lentivirüs taşıyan shRNA'nın iHSPC'lere transdüksiyon verimliliğini arttırır. Bu teknik transkripsiyon faktörlerinin rolünü ele almak ve DC gelişiminde rol alması muhtemel sitokin sinyal transdüksiyon veya metabolizmada diğer genlerin çalışmasını kolaylaştırır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Study of Dendritic Cell Development by Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in a Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Line In vitro

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Multivirus-spesifik T hücrelerinin üretilmesi Allojenik Hematopoetik Kök Hücre Nakli sonra Viral Enfeksiyonlar önleme / tedavi etmek için

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Alerjik Havayolu Enflamasyon sırasındaki solunum Dendritik Hücre olgunlaşması ve Göç Analizi

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

Hazırlama ve: Enfeksiyon Önleme Yeni Bir Yaklaşım olarak PRP<em&gt; In vitro</emPRP&gt; Antimikrobiyal Özellikleri

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Melanom ve Skuamöz Kanser Kök Hücreleri Kullanılarak Yeni Bir Dendritik Hücre aşısının Üretilmesi

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

Bir Tetrasiklin düzenlenmiş Hücre Hattı Özellikle dendritik hücreler Hedef Yüksek titre Lentiviral vektörler üretir

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Saf Hematopoetik kök / progenitör hücrelerin DNA mutasyonları belirlenmesi

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Hematopoetik progenitörlerin Evlatlık Transferi kullanarak Peter Parçacıklannda Murin plazmasitoid dendritik hücreleri Gelişimini değerlendirilmesi

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Basit ve Etkin Yaklaşım Mutant Vaccinia Virüs Vektörler Construct

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

İnsan Nötrofil türetilmiş Dev Fagositler bir Roman ICSI&#39;nin Gelişimi ve Kimlik<em&gt; İn Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

İnsan T-hücre hatırlama yanıt Vivo içinde çalışmaya emme Blister iletişim kuralı

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...