Name: large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization
Uploaded: 2021-07-27T15:00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization at JoVE.com

يتم دعم M.B. من قبل IMPRS-PMPG "التمثيل الغذائي الأولي ونمو النبات". تقر A.R.F. و S.A. بالدعم المالي لبرنامج البحث والابتكار في أفق الاتحاد الأوروبي لعام 2020 ، ومشروع PlantaSYST (رقم SGA-CSA رقم 739582 بموجب FPA رقم 664620) ، وزيادة المشروع (GA 862862).

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان.

كل من GC-MS و LC-MS هي أدوات تستخدم على نطاق واسع لتحديد ملامح المخاليط المعقدة من فئات الأيض المختلفة. يرتبط التعامل مع مجموعات البيانات الكبيرة باستخدام هذه الأدوات بطبيعته بتباين غير بيولوجي ، على سبيل المثال ، التباين التحليلي ، الذي يتداخل مع تفسير النتائج ويحيد إليه. يقدم هذا البروتوكول خط أنابيب استخراج قوي وعالي الإنتاجية للتنميط الأيضي الشامل للقضاء على التباين في المنشأ غير البيولوجي وإجراء دراسات "omics" واسعة النطاق. تم تعديل الأحجام والتركيزات المستخدمة في هذا البروتوكول لأنواع البقوليات في الأنسجة المختلفة. ومع ذلك ، يمكن تعديل هذه المعلمات قليلا واستخدامها لعينات التمثيل الغذائي على نطاق واسع من الأنواع النباتية الأخرى أيضا.
يمكن استخدام المقتطفات ال15 الموصوفة سابقا القائمة على MTBE لتحليل الأيضات المشتقة والأيضات شبه القطبية والدهون. يمكن توسيع هذا لاستخراج البروتين والهرمونات النباتية39 ، والتي كانت خارج نطاق هذا البروتوكول. تعتمد بروتوكولات الاستخراج الأخرى على ثنائي كلورو الميثان: مخاليط الإيثانول40,41. من بين بروتوكولات الاستخراج هذه ، يوفر بروتوكول استخراج الميثانول MTBE:methanol بديلا مواتيا وأقل خطورة لبروتوكولات الاستخراج القائمة على الكلوروفورم42 ولا ينتج عنه بيليه بروتين كطور بيني بين المرحلتين القطبية والدهنية. علاوة على ذلك ، تم بالفعل استخدام طرق MTBE في العديد من الدراسات لمختلف العينات البيولوجية43،44،45.
يناقش هذا البروتوكول العديد من الخطوات الحاسمة التي قد تؤدي إلى اختلاف محتمل أثناء التعامل مع عدد كبير من العينات ، على سبيل المثال ، أثناء حصاد12،13 ، واستخراج14 ، وكذلك التوزيع العشوائي46. وعلاوة على ذلك، هناك مسائل إضافية لم تناقش في هذا البروتوكول يجب النظر فيها لضمان بيانات استقلابية عالية الجودة، مثل تأثير المصفوفة وقمع الأيونات14.
تعتمد قوة طرق التطبيع القائمة على مراقبة الجودة بطبيعتها على عدد عينات مراقبة الجودة في كل دفعة. وكما ذكر سابقا، على الرغم من أن زيادة العدد من شأنه أن يزيد من الطاقة، فإن التباين داخل الدفعات لمراكز مراقبة الجودة هامشي نسبيا مقارنة بالتباين بين الدفعات في هذه النظم التحليلية، كما هو موضح في الشكل 3. بشكل عام، هناك طرق تطبيع أخرى قائمة على مراقبة الجودة، مثل إزالة الأخطاء النظامية باستخدام الغابات العشوائية (SERRF)، والتي ثبت أنها تتفوق على معظم طرق التطبيع الأخرى مثل النسبة الجزائية، والتطبيع باستخدام الاختيار الأمثل للمعايير الداخلية المتعددة (NOMIS)، وتطبيع الحاصل الاحتمالي (PQN)47 . ومع ذلك، تعتمد SERRF على عينات مراقبة الجودة المتعددة في كل دفعة، على سبيل المثال، كل عينة عاشرة، وهو أمر غير ممكن أثناء التعامل مع أعداد كبيرة من العينات. الميزة الرئيسية للتطبيع القائم على مراقبة الجودة على الطرق الأخرى القائمة على البيانات أو الداخلية القائمة على المعايير هي أنها تحتفظ بالتباين البيولوجي الأساسي مع استيعاب التباين التقني غير المرغوب فيه28. قد يشير القراء إلى هذه المراجعة حول معالجة الاختلاف28.
إحدى القضايا الرئيسية في GWAS هي معدل الإيجابيات الكاذبة ، والتي تنشأ في الغالب بسبب ارتباط المواقع السببية وغير السببية48,49. ثانيا ، نهج التصحيح الإحصائي المحافظ ، على سبيل المثال ، Bonferroni و FDR ، صحيحة لعدد الاختبارات المستقلة ، والتي لا تساوي عدد SNPs التي تم فحصها في GWAS بسبب الارتباط بين SNPs القريبة50,51 لذلك ، فإن العدد الفعلي للاختبارات المستقلة غالبا ما يكون أقل. وهناك طريقة أخرى لتقليل العتبة الإحصائية المتحفظة تتمثل في تقليل عدد SNPs التي تم اختبارها والمستخدمة في GWAS على أساس اضمحلال الروابط على المناطق الجينومية المحددة52. تحتوي منصة الأيض عالية الإنتاجية المدمجة في GWAS، الموضحة في هذا البروتوكول، على مجموعة واسعة من التطبيقات. وعلى وجه الخصوص، سوف يسهل إدخال تحسينات على تربية المحاصيل عن طريق تغيير تركيبة الأيض/الدهون للمستويات المرغوبة صناعيا وتغذويا. بشكل عام ، قدمت الأيض نظرة متعمقة على البنية الوراثية لعدد كبير من المستقلبات والتنويع الأيضي الذي حدث أثناء تدجين المحاصيل على مدى العقود الماضية ، مما يشير إلى الإمكانات الهائلة للتربية المرتبطة بالأيض53. تشمل النهج البيولوجية الجزيئية للتحقق من صحة QTL في المصب توليد خطوط CRISPR / Cas9 المتحولة54 ، وخطوط إدخال T-DNA55 ، وخطوط التعبير الزائد المستقرة و / أو العابرة56 ، و VIGS ، ونهج الأيض خارج الجسم الحي 57 بجانب النهج التقليدي في توليد مجموعات F2 المتقاطعة وكذلك التحقق المتبادل في مجموعات سكانية مختلفة.
من خلال إجراء التصحيح اللازم للاختلافات التحليلية كما هو موضح أعلاه ، يمكن إجراء العديد من النهج المتكاملة بالإضافة إلى GWAS، مثل مستقلب الأيض ، وتحليل ارتباط الأيض والدهون ، وتحليل الارتباط بالبيانات الفينومية لإلقاء الضوء على السمات الأكثر تعقيدا ، و / أو تحليل التعبير المشترك لزيادة كشف أساس النظم البيولوجية58.

وقد مكنت نهج "omics" واسعة النطاق من تحليل النظم البيولوجية المعقدة1،2،3 وزيادة فهم العلاقة بين الأنماط الجينية والأنماط الظاهرية الناتجة4. مكنت الأيضات التي تستخدم قياس الطيف الكتلي الكروماتوغرافي السائل فائق الأداء (UHPLC-MS) و GC-MS من اكتشاف عدد كبير من ميزات الأيض ، والتي يتم تعليق بعضها فقط إلى درجة معينة ، مما يؤدي إلى نسبة عالية من المستقلبات غير المعروفة. يمكن استكشاف التفاعلات المعقدة من خلال الجمع بين الأيض على نطاق واسع مع التباين الجيني الأساسي لمجموعة متنوعة من السكان5. ومع ذلك ، فإن التعامل مع مجموعات العينات الكبيرة يرتبط بطبيعته بالاختلافات التحليلية ، مما يشوه تقييم التباين الأيضي لمزيد من العمليات النهائية. على وجه التحديد ، تستند المشكلات الرئيسية التي تؤدي إلى اختلافات تحليلية إلى أداء الماكينة والانجراف الآلي بمرور الوقت6. إن دمج التباين من دفعة إلى دفعة يمثل تحديا وإشكالية خاصة عند تحليل مجموعات النباتات الهيكلية واسعة النطاق. واقترحت إجراءات تطبيع متعددة لتصحيح الاختلافات غير البيولوجية، مثل استخدام المعايير الداخلية والخارجية والمعايير الداخلية الموسومة بالنظائر لتصحيح الأخطاء التحليلية، والتي يرتبط كل منها بطبيعته بالمشاكل والمزالق المعروفة7،8،9،10.
بالإضافة إلى التباين التحليلي ، يختلف اختيار بروتوكولات الاستخراج بشكل عام اعتمادا على الطريقة التحليلية. في نهاية المطاف ، من المرغوب فيه تقليل تكاليف المواد والعمالة بالإضافة إلى ضرورة استخدام عدة أليكوتات من نفس العينة لمختلف العمليات التحليلية من خلال تنفيذ طرق الاستخراج القائمة على فصل الطور. تم إدخال هذه الطرق لأول مرة باستخدام الكلوروفورم: مذيبات الميثانول / الماء لتجزئة المركبات القطبية والكارهة للماء11.
يصف هذا البروتوكول خط أنابيب سريع عالي الإنتاجية لمنصة متعددة الأوميكس لتحديد ملامح كل من المستقلبات القطبية والدهون في أنواع البقوليات. علاوة على ذلك ، فإنه يوضح كيف يمكن تصحيح مجموعات البيانات هذه بشكل مناسب للتباين التحليلي وتطبيعها قبل دمج معلومات النمط الجيني للكشف عن مواقع السمات الكمية للمستقلب (QTL) عن طريق إجراء GWAS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (17:0 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850360P</td>
			<td>Internal standard for lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>FAME solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovitexin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>38953-85-4</td>
			<td>Internal standard for metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lignoceric Acid Methylester</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2442-49-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13684102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyamin -hydrochlorid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>593-56-6</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl laurate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-82-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl myristate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>124-10-7</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl palmitate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-39-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl stearate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-61-8</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl tert-butyl ether (MTBE)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13890602</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-caprat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>110-42-9</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcaprylat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-11-5</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyldocosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>929-77-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyleicosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1120-28-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-hexacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5802-82-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-octacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>55682-92-3</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-pelargonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1731-84-6</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamid (MSTFA)</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>24589-78-4</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>110-86-1</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribitol</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>22566-17-2</td>
			<td>Internal standard for derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triacontanoic Acid Methyl Ester</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>629-83-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>23214102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius Corporation</td>
			<td>14 557 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-35ms, 30 m, 0,25 mm, 0,25 &#181;m</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>123-3832</td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC-MS system</td>
			<td>Leco Pegasus HT TOF-MS (LECO Corporation)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding Balls, Stainless Steel</td>
			<td>OPS DIAGNOSTICS</td>
			<td>GBSS 196-2500-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Q Exactive Focus (Q Exactive&#8482; Focus Hybrid Quadrupol-Orbitrap&#8482; 
			Massenspektrometer, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf, model 5427R</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.7 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002878</td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RP High Strength Silica (HSS) T3 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.8 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003539</td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf Thermomixer 5436</td>
			<td>2050-100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>USC 300 TH</td>
			<td>142-0084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinding mixer mill</td>
			<td>Retsch, Mixer Mill MM 300</td>
			<td>20.746.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC system</td>
			<td>Waters Acquity UPLC system (Waters)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators</td>
			<td>7.008.500.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Vortex-Genie 2, Model G560</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetAlign</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MzMine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;data.table&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;fujiplot&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pleiotrpoic map</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;genetics&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;Ime4&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BLUPs calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;LDheatmap&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>LD plots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;MASS&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;rMVP&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GWAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 4.0.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS Genedata</td>
			<td>Expressionist</td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>OPTON-30965</td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization

يستخدم كل من كروماتوغرافيا الغاز - مطياف الكتلة (GC-MS) والكروماتوغرافيا السائلة - مطياف الكتلة (LC-MS) على نطاق واسع في أساليب الأيض للكشف عن مئات الآلاف من ميزات الأيض وتحديدها كميا. ومع ذلك، فإن تطبيق هذه التقنيات على عدد كبير من العينات يخضع لتفاعلات أكثر تعقيدا، خاصة بالنسبة لدراسات الارتباط على نطاق الجينوم (GWAS). يصف هذا البروتوكول سير عمل استقلابي محسن ، يجمع بين إعداد عينة فعالة وسريعة مع تحليل عدد كبير من العينات لأنواع المحاصيل البقولية. تم تطوير طريقة الاستخراج المعدلة قليلا هذه في البداية لتحليل الأنسجة النباتية والحيوانية وتستند إلى الاستخراج في ميثيل تيرت بوتيل الأثير: مذيب الميثانول للسماح بالتقاط الأيضات القطبية والدهنية. بالإضافة إلى ذلك ، نقدم دليلا خطوة بخطوة للحد من الاختلافات التحليلية ، والتي تعد ضرورية لتقييم الإنتاجية العالية للتباين الأيضي في GWAS.

يجب أن تبدأ تجارب GWAS الناجحة في مجال التمثيل الغذائي بتصميم تجريبي مناسب ، يليه جمع العينات واستخراجها والحصول على البيانات ومعالجتها ، كما هو موضح في الشكل 1. في هذا البروتوكول ، تم استخدام طريقة MTBE15 لاستخراج وتحليل مئات المستقلبات التي تنتمي إلى عدة فئات مركبة. تعتمد الكروماتوغرافيا بشكل كبير على خصائص العمود المستخدم بالإضافة إلى مخاليط المخزن المؤقت للاستخراج. ويبين الشكل 2 كروماتوغرام عينات مراقبة الجودة، مما يشير إلى نمط الاستخلاص لبعض فئات الدهون الرئيسية في هذا النظام التحليلي. وترد في الجدول 1 التدرجات المطبقة لكل منصة. تم التركيز بشدة على معالجة الأخطاء النظامية في التجارب واسعة النطاق. يرتبط إجراء عمليات التمثيل الغذائي على نطاق واسع بطبيعته بالأخطاء الجهازية. للتوضيح ، قمنا بتحليل البيانات الدهنية عبر العديد من أنواع الفاصوليا الشائعة. يوفر الجدول التكميلي 1 البيانات الدهنية الخام المستخرجة التي تم الحصول عليها بعد معالجة الكروماتوجرام باستخدام البرنامج الموضح في جدول المواد. مكننا اتباع هذا البروتوكول من التحايل على المشكلات الرئيسية في التعامل مع بيانات omics ، خاصة أثناء التعامل مع مجموعات العينات الكبيرة. وينتج عن إجراء التطبيع تصحيح دقيق للأخطاء التحليلية الحكيمة دفعا، كما هو موضح في الشكل 3. على الرغم من أن زيادة أعداد عينات مراقبة الجودة من شأنها أن تزيد من قوة التطبيع ، إلا أن هذا ليس ممكنا دائما بسبب قيود التكلفة والوقت. بالنسبة للاستقلاب عالي الإنتاجية GWAS مع ميزات التمثيل الغذائي غير المستهدفة ، من الضروري توضيح أعداد أكبر من ارتباط علامة السمات بشكل مناسب. يمكن استخدام خريطة متعددة الأضلاع38 تجمع بين نتائج GWAS متعددة لتسليط الضوء على المناطق الجينومية التي ترتبط بها العديد من السمات (الشكل 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig01.jpg"> الشكل 1: مخطط انسيابي لنظام GWAS القائم على الأيض في النباتات. يتم عرض عدة خطوات بدءا من التصميم التجريبي وحتى اكتشاف QTL في اللوحة اليسرى. في اللوحة اليمنى ، تظهر أرقام متعددة لدعم العديد من الخطوات المذكورة في اللوحة اليمنى. بدءا من الجزء العلوي الأيمن ، (1) يتم عرض تسلسل مقترح من العينات ل LC-MS ، (2) مخططات درجات ما قبل وبعد التطبيع ل PCA ، بما في ذلك توزيع المعالم التمثيلية قبل المعالجة وبعدها ، مع إشارة حمراء إلى كثافة عينة مراقبة الجودة ، و (3) مخطط مانهاتن مع ارتباطات كبيرة تم إنشاء توزيعات LD والنمط الفرداني لها. الاختصارات: GWAS = دراسات الارتباط على نطاق الجينوم. QTL = موقع السمة الكمية; PCA = تحليل المكون الرئيسي; مراقبة الجودة = مراقبة الجودة; LD = اختلال توازن الروابط; MS = قياس الطيف الكتلي; LC-MS = كروماتوغرافيا سائلة - مطياف الكتلة ؛ GC-MS = كروماتوغرافيا الغاز - مطياف الكتلة ؛ LOESS = تجانس مخطط التشتت المقدر محليا ؛ MLM / MLMM = نموذج خطي مختلط / نموذج مختلط متعدد المواقع. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig02.jpg"> الشكل 2: معالجة الكروماتوجرام. يوضح اثنان من كروماتوغرام مراقبة الجودة (الذروة الأساسية ؛ بيانات الدهون) من دفعات مختلفة التباين الحكيم للدفعات لبعض فئات الدهون في عينات مراقبة الجودة المجمعة. يشار إلى أربع فئات رئيسية من الدهون مع نوافذ التفريغ الخاصة بها في نظام LC-MS الداخلي. تم تصدير الكروماتوغرام من MzMine21. الاختصارات: مراقبة الجودة = مراقبة الجودة; LC-MS = كروماتوغرافيا سائلة-قياس الطيف الكتلي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig03.jpg"> الشكل 3: تصحيح الخطأ المنهجي. تحليل المكون الرئيسي للبيانات الدهنية المكتسبة ، قبل (يسار ، البيانات الخام) وبعد التصحيح للأخطاء النظامية (اليمين ، الدفعة loess). توضح اللوحات السفلية توزيع المعالم (Cluster_00005) على العينات (n = 650) والدفعات (n = 10) قبل (يسار) وبعد (يمين) - تصحيح للتباين التحليلي. الاختصارات: PCA = تحليل المكون الرئيسي; مراقبة الجودة = مراقبة الجودة; LOESS = تجانس مخطط التشتت المقدر محليا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig04.jpg"> الشكل 4: خريطة متعددة الأضلاع توضح النتائج المجمعة لنظام GWAS. تسلط الخريطة متعددة الأضلاع الضوء على المناطق في الجينوم بأكمله المرتبطة بالعديد من السمات. تشير الأرقام الموجودة على الحلقات الخارجية إلى الكروموسومات المقابلة. تمثل كل دائرة سمة فردية مع SNPs المرتبطة بها بشكل كبير. تمثل الألوان فئات مركبة مختلفة (الرمادي = الفئة المركبة 1 ؛ الأخضر = الفئة المركبة 2 ؛ الأرجواني = الفئة المركبة 3 ؛ الأصفر = الفئة المركبة 4). في حالة الارتباطات بين الطبقات المركبة مع نفس المنطقة الجينومية ، يتم تسليط الضوء على الجينات. تظهر الدائرة الرمادية الداخلية مجموع جميع SNPs الهامة المرتبطة بموقع جينومي محدد. يتم إنشاء الارتباطات الموضحة في هذا الشكل بشكل مصطنع فقط للتوضيح. الاختصارات: GWAS = دراسات الارتباط على نطاق الجينوم. SNPs = تعدد الأشكال أحادية النوكليوتيد. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="5">إعدادات UHPLC-MS للدهون</td>
		</tr>
<tr>
<td>الوقت [دقيقة]</td>
			<td>من A إلى B [٪]*</td>
			<td colspan="3">معلومات</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>45٪ أ</td>
			<td colspan="3">Eluent A: 1٪ 1M NH 4-Acetate ، 0.1٪ حمض الخليك في الماء (درجة UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 4.00</td>
			<td>إل جي 45٪ - 25٪ أمبير</td>
			<td colspan="3">Eluent B: 1٪ 1M NH 4-Acetate ، 0.1٪ حمض الخليك في الأسيتونيتريل / 2-بروبانول 7: 3 (درجة UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4.00 - 12.00</td>
			<td>إل جي 25٪ - 11٪ A</td>
			<td colspan="3">
معدل التدفق: 400 ميكرولتر / دقيقة</td>
		</tr>
<tr>
<td>12.00 - 15.00</td>
			<td>إل جي 11٪ - 0٪ A</td>
			<td colspan="3">
حجم الحقن: 2 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 19.50</td>
			<td>cw 0٪ A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.50-19.51</td>
			<td>0٪ - 45٪ أمبير</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.51-24.00</td>
			<td>eq 45٪</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">إعدادات UHPLC-MS/MS للمستقلبات القطبية وشبه القطبية</td>
		</tr>
<tr>
<td>الوقت [دقيقة]</td>
			<td>Eluent A و B [٪]*</td>
			<td colspan="3">معلومات</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>99٪ أ</td>
			<td colspan="3">Eluent A: 0.1٪ حمض الفورميك في الماء (درجة UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 11.00</td>
			<td>إل جي 99٪ -60٪ A</td>
			<td colspan="3">Eluent B: 0.1٪ حمض الفورميك في الأسيتونيتريل (الصف UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>11.00 - 13.00</td>
			<td>إل جي 60٪ - 30٪ أمبير</td>
			<td colspan="3">
معدل التدفق: 400 ميكرولتر / دقيقة</td>
		</tr>
<tr>
<td>13.00 - 15.00</td>
			<td>إل جي 30٪ - 1٪ A</td>
			<td colspan="3">
حجم الحقن: 3 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 16.00</td>
			<td>cw 1٪ A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>16.00 - 17.00</td>
			<td>إل جي 1٪ - 99٪ A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>17.00 - 20.00</td>
			<td>eq 99٪ A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">إعدادات GC-MS للمستقلبات المشتقة</td>
		</tr>
<tr>
<td>الوقت [دقيقة]</td>
			<td>درجة الحرارة [°C]</td>
			<td colspan="3">معلومات</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 2.00</td>
			<td>85</td>
			<td colspan="3">
الغاز الناقل: هيليوم</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.00 - 18.66</td>
			<td>إل جي 80 - 330</td>
			<td colspan="3">
معدل التدفق: 2 مل / دقيقة</td>
		</tr>
<tr>
<td>18.66 - 24.66</td>
			<td>سي دبليو 330</td>
			<td colspan="3">
تدرج درجة الحرارة: 15 درجة مئوية / دقيقة</td>
		</tr>
<tr>
<td>24.66</td>
			<td>تبريد سريع</td>
			<td colspan="3">
حجم الحقن: 1 ميكرولتر</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: إعدادات التدرج لكل منصة من المنصات التحليلية7. الاختصارات: lg = التدرج الخطي ؛ cw = غسل الأعمدة. eq = التوازن; UHPLC-MS = كروماتوغرافيا سائلة فائقة الأداء - مطياف الكتلة ؛ UHPLC-MS/MS = كروماتوغرافيا سائلة فائقة الأداء - قياس الطيف الكتلي الترادفي ؛ GC-MS = كروماتوغرافيا الغاز - مطياف الكتلة. * = قيمة النسبة المئوية تتوافق مع A؛ قيمة النسبة المئوية المتبقية تتوافق مع B.
الجدول التكميلي 1: بيانات الدهون الخام. يشير إلى شدة الذروة لكل مجموعة من المجموعات المكتشفة على كل عينة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/Supplementary%20Table%201%20.xlsx" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization at JoVE.com

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

في هذا البروتوكول ، نقدم سير عمل محسن ، يجمع بين إعداد عينة فعالة وسريعة للعديد من العينات. بالإضافة إلى ذلك ، نقدم دليلا خطوة بخطوة لتقليل الاختلافات التحليلية لتقييم الإنتاجية العالية لدراسات GWAS الأيضية.

دراسات الارتباط واسعة النطاق متعددة الأوميكس على نطاق الجينوم (Mo-GWAS): مبادئ توجيهية لإعداد العينات وتطبيعها

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

يأتي التحقيق في عدد أكبر من السكان مع تباين مدفوع بالآلة ، والذي من خلال هذا التباين الفعلي الناشئ عن التنوع الطبيعي. نوضح هنا طريقة لتقليل التباين الفني لتحليل التكامل النهائي. تشمل مزايا هذه التقنية الاستخراج القائم على فصل الوجه ، مما يوفر تحليل المستقلبات المختلفة على المنصة التحليلية المعنية ، مع إزالة الخطأ النظامي والحفاظ على التباين البيولوجي.بمجرد الحصول على معلومات النمط الوراثي والمظهري ، يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي مجموعة طبيعية متنوعة في أي مملكة حياة. للبدء في أخذ أنابيب حصاد 20 ملليلتر ، أضف خرزتين معدنيتين قطرهما ثمانية ملليمترات لتجانس الأنابيب وتسميتها. ثم ، املأ ديوار بالنيتروجين السائل ، مباشرة بعد قطع عينات الأوراق والأنسجة الجذرية الطازجة في النيتروجين السائل عن طريق التجميد السريع.تخزين العينات البيولوجية المحصودة عند 80 درجة مئوية لمزيد من المعالجة. قم بتبريد حاملات الأنابيب مسبقا في النيتروجين السائل. بعد ذلك ، قم بطحن الأنسجة عند 25 هرتز لمدة دقيقة واحدة للحصول على مسحوق متجانس.كرر التجميد والطحن إذا لم تكن الأنسجة مطحونة بشكل متجانس. وزن 50 ملليغرام من المواد النباتية الطازجة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الآمنة ذات القفل المبردة مسبقا والتي تحمل علامة مليمترين لضمان بقاء المواد النباتية مجمدة أثناء عملية الوزن. أضف ملليلتر واحد من خليط الاستخراج المبرد مسبقا من 1 إلى 50 ملليغرام من العينة ، ودوامة الأنبوب لفترة وجيزة قبل الاحتفاظ به على الثلج.احتضن العينات على شاكر مداري بسرعة 800 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، تليها الصوتنة في حمام صوتنة مبرد بالجليد لمدة 10 دقائق. استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 500 ميكرولتر من خليط الاستخراج أيضا إلى العينات وخلط المستخلصات عن طريق دوامة قصيرة ، ثم الطرد المركزي للخليط عند 11،200 مرة G لمدة 5 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، قم بنقل 500 ميكرولتر من المرحلة العلوية المنفصلة المحتوية على الدهون إلى أنبوب طرد مركزي آمن 1.5 ملليلتر محدد مسبقا ، وإزالة بقية المرحلة العليا.في أنابيب منفصلة ، قفل آمن 1.5 ملليلتر ، تنقل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 150 ميكرولتر من المرحلة شبه القطبية السفلى أربعة GCMS و 300 ميكرولتر من المرحلة شبه القطبية الرابعة U-H-P-L-C MS تحليل. استخدم مكثف فراغ لتبخر المذيبات لتركيز جميع الكسور المستخرجة دون تسخين وتخزين الكسور المجففة عند 20 درجة مئوية. لإعداد العينة للأداء العالي للغاية ، يعيد الكروماتوغرافيا السائلة أو قياس الطيف الكتلي أو H-P-L-C MS تعليق الأجزاء شبه القطبية المجففة في 180 ميكرولتر من خليط من الميثانول والماء.ثم سونيك المرحلة شبه القطبية لمدة دقيقتين ، تليها الطرد المركزي في 11،200 مرة G لمدة دقيقة واحدة. بعد الطرد المركزي ، انقل 90 ميكرولتر من السوبرناتانت إلى قارورة زجاجية وحقن ميكرولترين من المستخلصات في عينة LCMS المصبوبة. قم بإجراء تجزئة الأيض على عمود Phase C18 معكوس يتم الاحتفاظ به عند 40 درجة مئوية ، وتدفق 400 ميكرولتر في الدقيقة مع التغيرات التدريجية للنفايات السائلة A و B ، والحصول على أطياف الكتلة للاختبار فارغة وعينات مراقبة الجودة في وضع التأين السلبي مع نطاق كتلة 102 1500 كتلة إلى نسبة الشحن.بالنسبة لعينات المستقلبات شبه القطبية، قم بتشغيل عينة مراقبة الجودة المجمعة في قياس الطيف الكتلي الترادف المعتمد على البيانات في أوضاع التأين السلبية والإيجابية. استخدم أطياف الكتلة التي تم الحصول عليها للتعليق التوضيحي. قم بإجراء تطبيع مجموعة البيانات عن طريق التحقق من توزيع المعيار الداخلي.تطبيع البيانات عن طريق تصحيح إشارة معايير داخلية واحدة أو متعددة. بعد ذلك ، قم بتصحيح كثافة الذروة التي تم الحصول عليها من الكروماتوجرام على وزن العينة الدقيق. لتصحيح انحراف الشدة عبر سلسلة الدفعات المتعددة ، قم بإجراء طرق تصحيح قائمة على مراقبة الجودة مثل تجانس مخطط التشتت المقدر محليا باستخدام R.قبل إجراء دراسات الارتباط على نطاق الجينوم أو GWAS ، قم بتصفية بيانات النمط الجيني لترددات الأليل الثانوية أقل من 5٪ ومعدل مفقود يزيد عن 10٪ باستخدام شرابة.هذا سوف يتجنب التحيز منخفض التردد. للقضاء على التحيز الناشئ عن العوامل البيئية ، استخدم حزمة R LME Four واحسب أفضل التنبؤات أو النقط الخطية وغير المتحيزة لكل ميزة طبيعية على التكرار التجريبي. استخدم نقاط من كل ميزة على حدة لأداء GWAS مع حزمة rMVP في R.يتم عرض البيانات الدهنية عبر العديد من أنواع الفاصوليا الشائعة بناء على كروماتوغرام الذروة الأساسي الخام لعينتين من مراقبة الجودة من دفعات مختلفة.لوحظ اختلاف في كثافة الإشارة لبعض فئات الدهون. كان الخطأ المنهجي أكثر وضوحا عندما تم إجراء تحليل المكون الرئيسي على البيانات الخام. أدى إجراء التطبيع ، بما في ذلك تجانس مخطط التشتت المقدر محليا ، إلى تجميع عينات مراقبة الجودة.عند التشريح إلى مجموعات فردية ، أصبحت الأخطاء التي تحركها الآلة في الدفعتين السابعة والثامنة واضحة قبل التطبيع ، والتي تم تصحيحها. تم استخدام مجموعات الأيض الفردية بعد التطبيع والتحويل ل GWAS، مما أدى إلى العديد من ارتباطات علامات السمات. في التحليل التمثيلي ، يتم تمييز فئات المركبات المختلفة بألوان مختلفة ، في حين تتم الإشارة إلى العلامات المرتبطة بفئات مركبة متعددة بأقرب جين لها.يعد تطبيع البيانات وتحويلها أحد أهم الخطوات. تأكد من إجراء التصحيح المناسب لتصحيح الخطأ النظامي ، وضمان الوضع الطبيعي في التوزيع. من خلال إجراء تصحيح للتباين التحليلي ، يمكن تنفيذ العديد من نهج التكامل ، مثل تحليل الارتباط الأيضي والاندماج في البيانات الظاهرية لإلقاء الضوء على السمات المعقدة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

إعداد نموذج لتحديد الهوية الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي للجيش الملكي النيبالي-ربط المناطق

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

على نطاق الجينوم الكمي للترجمة في مهدها الخميرة بالتنميط الريبوسوم

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

زراعة الواسعة النطاق على أساس لوحة ايليجانس كاينورهابديتيس: "إعداد نموذج" "دراسة التعديلات الأيضي" في مرض السكري

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

إعداد عينة لمسبار Electrospray قياس الطيف الكتلي

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

التسمية خاليه ايمونوبريسيبيتيشن الطيف الطيفي سير العمل لتحديد المواقع النووية علي نطاق واسع التنميط

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

إعداد عينة TMT لتقديم مرافق Proteomics وتحليل البيانات اللاحقة

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

خط أنابيب إعداد عينة للبلورات الدقيقة في خط شعاع VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

إعداد شبكات عينات ذات درجة حرارة عالية ل Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

إعداد العينة والكمية النسبية باستخدام الميثيل الاختزالي للأمينات لدراسات علم البيبتي

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

إعداد العينة باستخدام طريقة أحادية الطبقة الدهون للدراسات البلورية الإلكترون

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...