Name: large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization
Uploaded: 2021-07-27T15:00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization at JoVE.com

M.B. understøttes af IMPRS-PMPG 'Primary Metabolism and Plant Growth'. A.R.F. og S.A. anerkender den finansielle støtte fra EU's Horizon 2020 Forsknings- og Innovationsprogram, projekt PlantaSYST (SGA-CSA nr. 739582 under FPA nr. 664620) og projekt INCREASE (GA 862862).

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.

Både GC-MS og LC-MS er meget anvendte værktøjer til profilering af komplekse blandinger af forskellige metabolitklasser. Håndtering af store datasæt med disse værktøjer er i sagens natur forbundet med en ikke-biologisk variation, f.eks. analytisk variation, som forstyrrer og skævvrider fortolkningen af resultaterne. Denne protokol præsenterer en robust ekstraktionspipeline med høj kapacitet til omfattende metabolisk profilering for at eliminere variation af ikke-biologisk oprindelse og udføre store "omics" -undersøgelser. De mængder og koncentrationer, der blev anvendt i denne protokol, blev justeret for bælgplantearter i forskellige væv. Disse parametre kan dog ændres lidt og bruges også til store metaboliske prøver fra andre plantearter.
De tidligere15 beskrevne MTBE-baserede ekstraktioner kan bruges til at analysere derivatiserede metabolitter, halvpolære metabolitter og lipider. Dette kan udvides til protein- og plantehormonekstraktioner39, som ikke var omfattet af denne protokol. Andre ekstraktionsprotokoller er afhængige af dichlormethan:ethanolblandinger40,41. Af disse ekstraktionsprotokoller giver MTBE: methanolekstraktionsprotokollen et gunstigt og mindre farligt alternativ til de eksisterende chloroformbaserede ekstraktionsprotokoller42 og resulterer ikke i en proteinpellet som en interfase mellem polære og lipidfaser. Desuden er MTBE-metoder allerede blevet anvendt i flere undersøgelser for forskellige biologiske prøver 43,44,45.
Denne protokol diskuterer flere afgørende trin, der kan føre til potentiel variation under håndtering af et stort antal prøver, f.eks. under høst12,13, ekstraktion14 samt randomisering46. Desuden er der yderligere spørgsmål, der ikke er blevet diskuteret i denne protokol, der skal overvejes for at sikre metabolomiske data af høj kvalitet, f.eks. matrixeffekt og ionundertrykkelse14.
Effekten af QC-baserede normaliseringsmetoder afhænger i sagens natur af antallet af QC-prøver i hver batch. Som tidligere nævnt er QC'ernes variation relativt marginal sammenlignet med variationen mellem batcher i disse analysesystemer, som illustreret i figur 3, selv om antallet ville øge effekten. Samlet set er der andre QC-baserede normaliseringsmetoder, såsom systemisk fejlfjernelse ved hjælp af tilfældig skov (SERRF), som har vist sig at overgå de fleste af de andre normaliseringsmetoder såsom batch-wise-ratio, normalisering ved hjælp af et optimalt udvalg af flere interne standarder (NOMIS) og probabilistisk kvotientnormalisering (PQN)47 . SERRF er imidlertid afhængig af flere QC-prøver i hver batch, f.eks. hver tiende prøve, hvilket ikke er muligt under håndtering af et stort antal prøver. Den største fordel ved QC-baseret normalisering i forhold til andre datadrevne eller interne standardbaserede metoder er, at den bevarer den væsentlige biologiske variation, samtidig med at den imødekommer uønsket teknisk variation28. Læsere kan henvise til denne anmeldelse om håndtering af variation28.
Et hovedproblem i GWAS er antallet af falske positiver, der hovedsagelig stammer fra forbindelsen mellem kausale og ikke-kausale steder 48,49. For det andet korrigerer de konservative statistiske korrektionsmetoder, f.eks. Bonferroni og FDR, for antallet af uafhængige tests, som ikke er lig med antallet af analyserede SNP'er i GWAS på grund af sammenhængen mellem nærmeste SNP'er50,51 Derfor er det faktiske antal uafhængige tests ofte lavere. En anden måde at reducere den konservative statistiske tærskel på ville være at reducere antallet af testede SNP'er, der anvendes til GWAS baseret på koblingshenfald over definerede genomiske regioner52. Den GWAS-integrerede metabolomics-platform med høj kapacitet, der er beskrevet i denne protokol, har en bred vifte af applikationer. Det vil især lette forbedringer i afgrødeforædling ved at ændre metabolit/lipidsammensætningen for industrielt og ernæringsmæssigt ønskede niveauer. Samlet set har metabolomics givet en dybdegående indsigt i den genetiske arkitektur af en overflod af metabolitter og metabolisk diversificering, der opstod under afgrøde domesticering i løbet af de sidste årtier, hvilket indikerer det store potentiale i metabolomics-associeret avl53. De molekylærbiologiske tilgange til downstream QTL-validering omfatter generering af CRISPR/Cas9-mutantlinjer54, T-DNA-indsættelseslinjer55, stabile og/eller forbigående overekspressionslinjer56, VIGS, ex vivo metabolomics nærmer sig57 ved siden af den konventionelle tilgang til generering af kryds F2-populationer samt krydsvalidering i forskellige populationer.
Ved at udføre den nødvendige korrektion for de analytiske variationer som beskrevet ovenfor kan der udføres flere integrerede tilgange ud over GWAS, såsom metabolit-metabolit, metabolit-lipid-korrelationsanalyse, korrelationsanalyse til fænomendata for at kaste lys over mere komplekse træk og / eller co-ekspressionsanalyse for yderligere at opklare grundlaget for biologiske systemer58.

Storstilede "omics"-tilgange har gjort det muligt at analysere komplekse biologiske systemer 1,2,3 og yderligere forståelse af sammenhængen mellem genotyper og de resulterende fænotyper4. Metabolomics ved hjælp af ultra-højtydende væskekromatografi-massespektrometri (UHPLC-MS) og GC-MS muliggjorde påvisning af en overflod af metabolitegenskaber, hvoraf kun nogle er kommenteret til en vis grad, hvilket resulterer i en høj andel af ukendte metabolitter. Komplekse interaktioner kan udforskes ved at kombinere storskala metabolomics med den underliggende genotypiske variation af en forskelligartet population5. Håndtering af store prøvesæt er imidlertid i sagens natur forbundet med analytiske variationer, hvilket forvrænger evalueringen af metabolisk varians for yderligere downstream-processer. Specifikt er store problemer, der fører til analytiske variationer, baseret på maskinens ydeevne og instrumentelle drift over tid6. Integrationen af batch-til-batch-variation er udfordrende og især problematisk, når man analyserer store strukturerede plantepopulationer. Flere normaliseringsprocedurer blev foreslået for at korrigere for ikke-biologiske variationer, f.eks. brugen af interne, eksterne og isotopmærkede interne standarder for at korrigere for analytiske fejl, hvoraf hver især i sagens natur er forbundet med kendte problemer og faldgruber 7,8,9,10.
Ud over analytisk variation varierer valget af ekstraktionsprotokoller generelt afhængigt af analysemetoden. I sidste ende ønskes det at reducere materiale- og lønomkostninger samt nødvendigheden af at anvende flere alikvoter af den samme prøve til forskellige analytiske processer ved at udføre faseadskillelsesbaserede ekstraktionsmetoder. Disse metoder blev først introduceret ved anvendelse af chloroform: methanol/vandopløsningsmidler til fraktionering af polære og hydrofobe forbindelser11.
Denne protokol beskriver en hurtig rørledning med høj kapacitet til en multi-omics-platform til profilering af både polære metabolitter og lipider i bælgplantearter. Endvidere viser det, hvordan disse datasæt kan korrigeres korrekt for analytisk variation og normaliseres, før genotypiske oplysninger integreres for at detektere metabolit kvantitative træk loci (QTL) ved at udføre GWAS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (17:0 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850360P</td>
			<td>Internal standard for lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>FAME solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovitexin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>38953-85-4</td>
			<td>Internal standard for metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lignoceric Acid Methylester</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2442-49-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13684102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyamin -hydrochlorid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>593-56-6</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl laurate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-82-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl myristate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>124-10-7</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl palmitate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-39-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl stearate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-61-8</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl tert-butyl ether (MTBE)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13890602</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-caprat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>110-42-9</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcaprylat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-11-5</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyldocosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>929-77-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyleicosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1120-28-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-hexacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5802-82-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-octacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>55682-92-3</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-pelargonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1731-84-6</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamid (MSTFA)</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>24589-78-4</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>110-86-1</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribitol</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>22566-17-2</td>
			<td>Internal standard for derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triacontanoic Acid Methyl Ester</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>629-83-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>23214102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius Corporation</td>
			<td>14 557 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-35ms, 30 m, 0,25 mm, 0,25 &#181;m</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>123-3832</td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC-MS system</td>
			<td>Leco Pegasus HT TOF-MS (LECO Corporation)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding Balls, Stainless Steel</td>
			<td>OPS DIAGNOSTICS</td>
			<td>GBSS 196-2500-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Q Exactive Focus (Q Exactive&#8482; Focus Hybrid Quadrupol-Orbitrap&#8482; 
			Massenspektrometer, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf, model 5427R</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.7 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002878</td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RP High Strength Silica (HSS) T3 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.8 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003539</td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf Thermomixer 5436</td>
			<td>2050-100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>USC 300 TH</td>
			<td>142-0084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinding mixer mill</td>
			<td>Retsch, Mixer Mill MM 300</td>
			<td>20.746.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC system</td>
			<td>Waters Acquity UPLC system (Waters)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators</td>
			<td>7.008.500.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Vortex-Genie 2, Model G560</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetAlign</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MzMine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;data.table&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;fujiplot&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pleiotrpoic map</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;genetics&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;Ime4&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BLUPs calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;LDheatmap&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>LD plots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;MASS&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;rMVP&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GWAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 4.0.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS Genedata</td>
			<td>Expressionist</td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>OPTON-30965</td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization

Både gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS) og væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) er almindeligt anvendte metabolomics-tilgange til at detektere og kvantificere hundredtusindvis af metabolitfunktioner. Anvendelsen af disse teknikker på et stort antal prøver er imidlertid underlagt mere komplekse interaktioner, især for genom-dækkende associeringsundersøgelser (GWAS). Denne protokol beskriver en optimeret metabolisk arbejdsgang, som kombinerer et effektivt og hurtigt prøveforberedelse med analysen af et stort antal prøver til bælgplanteafgrøder. Denne let modificerede ekstraktionsmetode blev oprindeligt udviklet til analyse af plante- og dyrevæv og er baseret på ekstraktion i methyltert-butylether: methanolopløsningsmiddel for at muliggøre indfangning af polære og lipidmetabolitter. Derudover giver vi en trinvis vejledning til reduktion af analytiske variationer, som er afgørende for high-throughput evaluering af metabolisk varians i GWAS.

Vellykkede metabolomics GWAS-eksperimenter bør begynde med et korrekt eksperimentelt design efterfulgt af prøveindsamling, ekstraktion, dataindsamling og behandling, som illustreret i figur 1. I denne protokol blev MTBE-metoden15 anvendt til at ekstrahere og analysere hundredvis af metabolitter, der tilhører flere sammensatte klasser. Kromatografi afhænger meget af egenskaberne af den anvendte søjle såvel som elueringsbufferblandinger. Figur 2 viser kromatogrammer af QC-prøver, hvilket indikerer elueringsmønsteret for nogle større lipidklasser i dette analytiske system. De anvendte gradienter for hver platform er angivet i tabel 1. Der blev lagt stor vægt på håndtering af systemiske fejl i store eksperimenter. Udførelse af storskala metabolomics er iboende forbundet med systemiske fejl. Til demonstration analyserede vi lipidomiske data på tværs af flere almindelige bønnearter. Supplerende tabel 1 indeholder de ekstraherede rå lipidomiske data opnået efter kromatogrambehandling ved hjælp af den software, der er angivet i materialetabellen. Efter denne protokol gjorde det muligt for os at omgå store problemer i håndteringen af omics-data, især under håndtering af store prøvesæt. Normaliseringsproceduren giver en nøjagtig korrektion af batchvise analytiske fejl, som det fremgår af figur 3. Selvom en forøgelse af antallet af QC-prøver ville øge normaliseringseffekten, er dette ikke altid muligt på grund af omkostnings- og tidsbegrænsninger. For metabolomics GWAS med høj kapacitet med ikke-målrettede metaboliske egenskaber er det vigtigt at illustrere et højere antal trækmarkørforening korrekt. Et pleiotropisk kort38, der kombinerer flere GWAS-resultater, kan bruges til at fremhæve de genomiske regioner, som flere træk er knyttet til (figur 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig01.jpg"> Figur 1: Flowchart af den metabolomics-baserede GWAS i planter. Flere trin fra det eksperimentelle design op til detektion af QTL vises i venstre panel. I højre panel vises flere figurer for at understøtte flere trin, der er nævnt i venstre panel. Fra højre øverst vises (1) en foreslået sekvens af prøver for LC-MS, (2) præ- og postnormaliserede scorediagrammer af PCA, herunder en repræsentativ funktionsfordeling før og efterbehandling, med rød, der angiver QC-prøveintensiteter, og (3) et Manhattan-plot med betydelige foreninger, som LD- og haplotypefordelinger blev genereret til. Forkortelser: GWAS = genom-dækkende associeringsundersøgelser; QTL = kvantitativ egenskab loci; PCA = analyse af hovedkomponenter QC = kvalitetskontrol; LD = kobling uligevægt; MS = massespektrometri; LC-MS = væskekromatografi-massespektrometri; GC-MS = gaskromatografi-massespektrometri; LOESS = lokalt estimeret spredningsudjævning; MLM/MLMM = blandet lineær model/multi-locus blandet model. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig02.jpg"> Figur 2: Kromatogrambehandling. To QC-kromatogrammer (base peak; lipiddata) fra forskellige batcher demonstrerer den batchvise variation for visse lipidklasser i de samlede QC-prøver. Fire store lipidklasser er angivet med deres respektive elueringsvinduer i det interne LC-MS-system. Kromatogrammerne blev eksporteret fra MzMine21. Forkortelser: QC = kvalitetskontrol; LC-MS = væskekromatografi-massespektrometri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig03.jpg"> Figur 3: Korrektion af systematisk fejl. Hovedkomponentanalyse af erhvervede lipidomiske data, præ- (venstre, rådata) og efterkorrektion for systemiske fejl (højre, batch loess). De nederste paneler illustrerer funktionsfordelingen (Cluster_00005) over prøverne (n = 650) og batcherne (n = 10) før ( venstre) og post (højre) -korrektion for analytisk variation. Forkortelser: PCA = analyse af hovedkomponenter; QC = kvalitetskontrol; LOESS = lokalt estimeret spredningsudjævning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig04.jpg"> Figur 4: Pleiotropisk kort, der illustrerer de kombinerede GWAS-resultater. Det pleiotropiske kort fremhæver regioner i hele genomet, der er forbundet med flere træk. Tallene på de ydre ringe angiver de tilsvarende kromosomer. Hver cirkel repræsenterer et individuelt træk med dets signifikant tilknyttede SNP'er. Farverne repræsenterer forskellige sammensatte klasser (grå = forbindelsesklasse 1; grøn = forbindelsesklasse 2; lilla = sammensat klasse 3; gul = forbindelsesklasse 4). I tilfælde af inter-sammensatte klasseforeninger med samme genomiske region fremhæves gener. Den indre grå cirkel viser summen af alle signifikante SNP'er forbundet med en bestemt genomisk position. Foreningerne vist i denne figur er kunstigt genereret kun til illustration. Forkortelser: GWAS = genom-dækkende associeringsundersøgelser; SNP'er = enkeltnukleotidpolymorfier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="5">UHPLC-MS-indstillinger for lipider</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tidspunkt [min]</td>
			<td>Eluent A til B [%]*</td>
			<td colspan="3">Information</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>45% A</td>
			<td colspan="3">Eluent A: 1% 1M NH4-acetat, 0,1% eddikesyre i vand (UHPLC-kvalitet)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 4.00</td>
			<td>lg 45% - 25% A</td>
			<td colspan="3">Eluent B: 1% 1M NH4-acetat, 0,1% eddikesyre i acetonitril/2-propanol 7:3 (UHPLC-kvalitet)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4.00 - 12.00</td>
			<td>lg 25% - 11% A</td>
			<td colspan="3">
Strømningshastighed: 400 μL/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>12.00 - 15.00</td>
			<td>lg 11% - 0% A</td>
			<td colspan="3">
Injektionsvolumen: 2 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 19.50</td>
			<td>cw 0% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.50-19.51</td>
			<td>0% - 45% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.51-24.00</td>
			<td>eq 45%</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">UHPLC-MS/MS-indstillinger for polære og halvpolære metabolitter</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tidspunkt [min]</td>
			<td>Eluent A og B [%]*</td>
			<td colspan="3">Information</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>99% A</td>
			<td colspan="3">Eluent A: 0,1% myresyre i vand (UHPLC-kvalitet)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 11.00</td>
			<td>Lg 99% -60% A</td>
			<td colspan="3">Eluent B: 0,1% myresyre i acetonitril (UHPLC-kvalitet)</td>
		</tr>
<tr>
<td>11.00 - 13.00</td>
			<td>lg 60% - 30% A</td>
			<td colspan="3">
Strømningshastighed: 400 μL/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>13.00 - 15.00</td>
			<td>lg 30% - 1% A</td>
			<td colspan="3">
Injektionsvolumen: 3 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 16.00</td>
			<td>cw 1% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>16.00 - 17.00</td>
			<td>lg 1% - 99% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>17.00 - 20.00</td>
			<td>eq 99% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">GC-MS-indstillinger for derivatiserede metabolitter</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tidspunkt [min]</td>
			<td>Temperatur [°C]</td>
			<td colspan="3">Information</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 2.00</td>
			<td>85</td>
			<td colspan="3">
Bæregas: Helium</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.00 - 18.66</td>
			<td>Lg 80 - 330</td>
			<td colspan="3">
Strømningshastighed: 2 ml/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>18.66 - 24.66</td>
			<td>Se hele annoncen 330.000 2010 I går</td>
			<td colspan="3">
Temperaturgradient: 15 °C/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>24.66</td>
			<td>hurtig afkøling</td>
			<td colspan="3">
Injektionsvolumen: 1 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Gradientindstillinger for hver af analyseplatformene7. Forkortelser: lg = lineær gradient; cw = søjlevask; eq = ligevægt; UHPLC-MS = ultra-højtydende væskekromatografi-massespektrometri; UHPLC-MS/MS = ultra-højtydende væskekromatografi-tandem massespektrometri; GC-MS = gaskromatografi-massespektrometri. * = procentværdi svarer til eluent A; resterende procentværdi svarer til eluent B.
Supplerende tabel 1: Rå lipidomics data. Angiver spidsintensiteterne for hver af de påviste klynger over hver prøve. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/Supplementary%20Table%201%20.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization at JoVE.com

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

I denne protokol præsenterer vi en optimeret arbejdsgang, som kombinerer en effektiv og hurtig prøveforberedelse af mange prøver. Derudover giver vi en trinvis vejledning til at reducere analytiske variationer til evaluering af metaboliske GWAS-undersøgelser med høj kapacitet.

Large-scale Multi-omics Genome-wide Association Studies (Mo-GWAS): Retningslinjer for prøveforberedelse og normalisering

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

Undersøgelse af større befolkning kommer med en maskindrevet variation, som ved dette den faktiske variation stammer fra naturlig mangfoldighed. Her demonstrerer vi en metode til at reducere den tekniske variation for downstream integrationsanalyse. Fordelene ved denne teknik inkluderer en ansigtsadskillelsesbaseret ekstraktion, der tilvejebringer analyse af forskellige metabolitter på den respektive analytiske platform, samtidig med at den systemiske fejl fjernes og den biologiske varians opretholdes.Når de genotypiske og fænotypiske oplysninger er opnået, kan denne metode anvendes på enhver forskelligartet naturlig befolkning i ethvert livsrige. For at begynde at tage 20 ml høstrør tilsættes to fem millimeter og to metalperler med en diameter på otte millimeter til homogenisering og mærke rørene. Fyld derefter en dewar med flydende nitrogen, umiddelbart efter at have skåret høst friske blad- og rodvævsprøver i flydende nitrogen ved flashfrysning.Opbevar de høstede biologiske prøver ved 80 grader celsius til videre behandling. Forkøl rørholderne i flydende nitrogen. Slib derefter vævene ved 25 hertz i et minut for at opnå et homogent pulver.Gentag frysning og slibning, hvis vævet ikke er homogent jordet. Væg 50 milligram frisk plantemateriale i et forkølet mærket to millimeter sikkert låsemikrocentrifugerør, der sikrer, at plantemateriale forbliver frosset under vejeprocessen. Der tilsættes en ml forkølet ekstraktionsblanding 1 til 50 milligram aliquot af prøven, og hvirvel røret kort, inden det opbevares på is.Inkuber prøverne på en orbitalryster ved 800 gange G i 10 minutter ved fire grader celsius efterfulgt af sonikering i et iskølet sonikeringsbad i 10 minutter. Brug en flerkanalspipette til også at tilsætte 500 mikroliter ekstraktionsblanding til prøverne og bland ekstrakterne ved kort hvirvelning, og centrifuger derefter blandingen ved 11.200 gange G i 5 minutter ved fire grader celsius. Efter centrifugering overføres 500 mikroliter af den adskilte øvre lipidholdige fase til et formærket 1,5 ml sikkert låsemikrocentrifugerør, fjernes resten af den øvre fase.I separate, 1,5 ml sikre låse mikrocentrifuge rør overføre 150 mikroliter af den nedre semi-polære fase fire GCMS og 300 mikroliter af den semi-polære fase fire U-H-P-L-C MS analyse. Brug en vakuumkoncentrator til fordampning af opløsningsmiddel til at koncentrere alle de ekstraherede fraktioner uden opvarmning og opbevar de tørrede fraktioner ved 20 grader celsius. For at forberede prøven til ultrahøj ydeevne suspenderer væskekromatografi, massespektrometri eller H-P-L-C MS de tørrede halvpolære fraktioner i 180 mikroliter af en blanding af methanol og vand.Derefter sonikeres den halvpolære fase i 2 minutter efterfulgt af centrifugering ved 11.200 gange G i et minut. Efter centrifugering overføres 90 mikroliter af supernatanten til et hætteglas med glas, og to mikroliter af ekstrakterne hældes i den hældte LCMS-prøve. Metabolitfraktioneringen udføres på en omvendt fase C18-søjle, der holdes ved 40 grader celsius, og en strøm på 400 mikroliter pr. minut med gradvise ændringer af spildevand A og B, optage massespektrene for testemnet og kvalitetskontrolprøverne i negativ ioniseringstilstand med et masseområde på 102 1500 masse til ladningsforhold.For prøverne af halvpolære metabolitter køres en samlet QC-prøve i dataafhængig tandemmassespektrometri i negative og positive ioniseringstilstande. Brug de opnåede massespektre til annotationen. Udfør normaliseringen af datasættet ved at kontrollere fordelingen af den interne standard.Normaliser dataene ved at korrigere for signalet om enkelte eller flere interne standarder. Derefter korrigeres de maksimale intensiteter opnået fra kromatogrammet over den nøjagtige prøvevægt. For at korrigere intensitetsdriften på tværs af multibatchserier skal du udføre QC-baserede korrektionsmetoder såsom lokalt estimeret scatterplot-udjævning ved hjælp af R.Før du udfører genom-dækkende associeringsundersøgelser eller GWAS, filtreres de genotypiske data for mindre allelfrekvenser mindre end 5% og en manglende hastighed på mere end 10% ved hjælp af kvast.Dette vil undgå lavfrekvent bias. For at eliminere den bias, der stammer fra miljøfaktorerne, skal du bruge R-pakken LME fire og beregne de bedste lineære, upartiske forudsigelser eller blops for hver normaliseret funktion over de eksperimentelle gentagelser. Brug blops af hver funktion individuelt til at udføre GWAS med rMVP-pakken i R.De lipidomiske data på tværs af flere almindelige bønnearter vises baseret på de rå base peak kromatogrammer af to QC-prøver fra forskellige batcher.En variation i signalintensiteten blev observeret for visse lipidklasser. Den systemiske fejl var mere tydelig, da hovedkomponentanalysen blev udført på rådata. Normaliseringsproceduren, herunder den lokalt estimerede scatterplot-udjævning, førte til klyngedannelsen af QC-prøverne.Ved dissekering i de enkelte klynger blev maskindrevne fejl i batch syv og otte tydelige før normalisering, hvilket blev rettet ud. De postnormaliserede og transformerede individuelle metabolomiske klynger blev brugt til GWAS, hvilket gav flere trækmarkørforeninger. I den repræsentative analyse fremhæves forskellige sammensatte klasser i forskellige farver, mens markørerne forbundet med flere sammensatte klasser er angivet med dets nærmeste gen.Datanormalisering og transformation er et af de vigtigste trin. Sørg for, at der er udført korrekt korrektion for at korrigere for systemiske fejl, og sikre normalitet i fordelingen. Ved at udføre korrektionen for den analytiske variation kan der udføres flere integrationsmetoder, såsom metabolisk korrelationsanalyse og integration i fænomendata for at kaste lys over komplekse træk.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Prøveforberedelse til massespektrometri-baseret identifikation af RNA-bindende regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genome-wide kvantificering af oversættelse i spirende gær af ribosomet profilering

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plade-baserede storstilet dyrkning af Caenorhabditis elegans: forberedelse af prøver til undersøgelse af stofskifteforandringer i Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Prøve forberedelse til Sonde Elektrospray Ionization Mass Spektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Label-fri Immunoprecipitation massespektrometri workflow for storstilet nuklear Interactome profilering

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Prøve forberedelse til Proteomics Facility Indsendelse og efterfølgende dataanalyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En prøveforberedelsespipeline til mikrokrystaller på VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Forberedelse af højtemperaturprøvegitre til Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Prøvepræparat og relativ kvantitet ved hjælp af reduktiv methylering af aminer til peptidomicsstudier

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Prøvepræparat ved hjælp af en Lipid Monolayer-metode til elektronkrygrafiske studier

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...