Name: large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization
Uploaded: 2021-07-27T15:00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization at JoVE.com

M.B. wordt ondersteund door de IMPRS-PMPG 'Primary Metabolism and Plant Growth'. A.R.F. en S.A. erkennen de financiële steun van het HORIZON 2020 Onderzoeks- en Innovatieprogramma van de EU, project PlantaSYST (SGA-CSA nr. 739582 onder FPA nr. 664620) en project INCREASE (GA 862862).

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Zowel GC-MS als LC-MS zijn veelgebruikte hulpmiddelen voor het profileren van complexe mengsels van verschillende metabolietklassen. Het verwerken van grote datasets met deze tools is inherent geassocieerd met een niet-biologische variatie, bijvoorbeeld analytische variatie, die de interpretatie van de resultaten verstoort en vertekent. Dit protocol presenteert een robuuste en high-throughput extractiepijplijn voor uitgebreide metabole profilering om variatie van niet-biologische oorsprong te elimineren en grootschalige "omics" -studies uit te voeren. De volumes en concentraties die in dit protocol worden gebruikt, zijn aangepast voor peulvruchtensoorten in verschillende weefsels. Deze parameters kunnen echter enigszins worden gewijzigd en ook worden gebruikt voor grootschalige metabole monsters van andere plantensoorten.
De eerder15 beschreven MTBE-gebaseerde extracties kunnen worden gebruikt om gederivatiseerde metabolieten, semipolaire metabolieten en lipiden te analyseren. Dit kan worden uitgebreid voor eiwit- en plantenhormoonextracties39, die buiten het toepassingsgebied van dit protocol vielen. Andere extractieprotocollen zijn gebaseerd op dichloormethaan:ethanolmengsels40,41. Van deze extractieprotocollen biedt het MTBE:methanol extractieprotocol een gunstig en minder gevaarlijk alternatief voor de bestaande op chloroform gebaseerde extractieprotocollen42 en resulteert het niet in een eiwitpellet als interfase tussen de polaire en lipidefase. Bovendien zijn MTBE-methoden al gebruikt in verschillende studies voor verschillende biologische monsters 43,44,45.
Dit protocol bespreekt verschillende cruciale stappen die kunnen leiden tot potentiële variatie bij het verwerken van een groot aantal monsters, bijvoorbeeld tijdens het oogstenvan 12,13, extractie14 en randomisatie46. Bovendien zijn er aanvullende kwesties die niet in dit protocol zijn besproken en waarmee rekening moet worden gehouden om metabolomische gegevens van hoge kwaliteit te garanderen, bijvoorbeeld matrixeffect en ionenonderdrukking14.
De kracht van op QC gebaseerde normalisatiemethoden is inherent afhankelijk van het aantal QC-monsters in elke batch. Zoals eerder vermeld, hoewel het verhogen van het aantal het vermogen zou vergroten, is de intra-batchvariatie van de QC's relatief marginaal in vergelijking met inter-batchvariatie in deze analytische systemen, zoals geïllustreerd in figuur 3. Over het algemeen zijn er andere op QC gebaseerde normalisatiemethoden, zoals systemische foutverwijdering met behulp van random forest (SERRF), waarvan is aangetoond dat ze beter presteren dan de meeste andere normalisatiemethoden, zoals batch-wise-ratio, normalisatie met behulp van een optimale selectie van meerdere interne standaarden (NOMIS) en probabilistische quotiëntnormalisatie (PQN)47 . SERRF vertrouwt echter op meerdere QC-monsters in elke batch, bijvoorbeeld elk tiende monster, wat niet haalbaar is bij het verwerken van grote aantallen monsters. Het belangrijkste voordeel van QC-gebaseerde normalisatie ten opzichte van andere datagestuurde of interne standaardgebaseerde methoden is dat het de essentiële biologische variatie behoudt en tegelijkertijd ongewenste technische variatie opvangt28. Lezers kunnen verwijzen naar deze recensie over de omgang met variatie28.
Een belangrijk probleem in GWAS is het aantal fout-positieven, die voornamelijk voortkomen uit de koppeling van causale en niet-causale sites48,49. Ten tweede corrigeren de conservatieve statistische correctiebenaderingen, bijvoorbeeld Bonferroni en FDR, correct voor het aantal onafhankelijke tests, dat niet gelijk is aan het aantal geteste SNP's in GWAS vanwege de koppeling tussen nabije SNP's50,51 Daarom is het werkelijke aantal onafhankelijke tests vaak lager. Een andere manier om de conservatieve statistische drempel te verlagen, zou zijn om het aantal geteste SNP's dat wordt gebruikt voor GWAS te verminderen op basis van koppelingsverval over gedefinieerde genomische regio's52. Het GWAS-geïntegreerde high-throughput metabolomics-platform dat in dit protocol wordt beschreven, heeft een breed scala aan toepassingen. In het bijzonder zal het verbeteringen in de gewasveredeling vergemakkelijken door de metaboliet / lipidesamenstelling te veranderen voor industrieel en nutritioneel gewenste niveaus. Over het algemeen heeft metabolomics een diepgaand inzicht gegeven in de genetische architectuur van een overvloed aan metabolieten en metabole diversificatie die plaatsvond tijdens de domesticatie van gewassen in de afgelopen decennia, wat wijst op het enorme potentieel van metabolomics-geassocieerde veredeling53. De moleculair biologische benaderingen voor downstream QTL-validatie omvatten de generatie van CRISPR/Cas9-mutantlijnen54, T-DNA-insertielijnen55, stabiele en/of transiënte overexpressielijnen56, VIGS, ex vivo metabolomics-benaderingen57 naast de conventionele benadering bij het genereren van cross F2-populaties en kruisvalidatie in verschillende populaties.
Door de noodzakelijke correctie uit te voeren voor de analytische variaties zoals hierboven beschreven, kunnen naast GWAS verschillende geïntegreerde benaderingen worden uitgevoerd, zoals metaboliet-metaboliet, metaboliet-lipidencorrelatieanalyse, correlatieanalyse tot fenomische gegevens om licht te werpen op complexere eigenschappen, en /of co-expressieanalyse om de basis van biologische systemen verder te ontrafelen58.

Grootschalige "omics"-benaderingen hebben de analyse van complexe biologische systemen 1,2,3 en verder begrip van het verband tussen genotypen en de resulterende fenotypen mogelijk gemaakt4. Metabolomics met behulp van ultra-high-performance vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (UHPLC-MS) en GC-MS maakten de detectie mogelijk van een overvloed aan metabolietkenmerken, waarvan slechts enkele tot op zekere hoogte zijn geannoteerd, wat resulteert in een hoog percentage onbekende metabolieten. Complexe interacties kunnen worden onderzocht door grootschalige metabolomica te combineren met de onderliggende genotypische variatie van een diverse populatie5. Het hanteren van grote monstersets is echter inherent geassocieerd met analytische variaties, waardoor de evaluatie van metabole variantie voor verdere downstreamprocessen wordt verstoord. In het bijzonder zijn belangrijke problemen die leiden tot analytische variaties gebaseerd op machineprestaties en instrumentele drift in de loop van tijd6. De integratie van batch-to-batch variatie is een uitdaging en vooral problematisch bij het analyseren van grootschalige gestructureerde plantenpopulaties. Meerdere normalisatieprocedures werden voorgesteld om te corrigeren voor niet-biologische variaties, bijvoorbeeld het gebruik van interne, externe en isotoop-gelabelde interne normen om te corrigeren voor analytische fouten, waarvan elk inherent geassocieerd is met bekende problemen en valkuilen 7,8,9,10.
Naast analytische variatie varieert de keuze van extractieprotocollen over het algemeen afhankelijk van de analysemethode. Uiteindelijk is het gewenst om materiaal- en arbeidskosten te verlagen, evenals de noodzaak om meerdere aliquots van hetzelfde monster te gebruiken voor verschillende analytische processen door op fasescheiding gebaseerde extractiemethoden uit te voeren. Deze methoden werden voor het eerst geïntroduceerd met behulp van chloroform: methanol/ wateroplosmiddelen om polaire en hydrofobe verbindingen te fractioneren11.
Dit protocol beschrijft een snelle high-throughput pijplijn voor een multi-omics platform om zowel polaire metabolieten als lipiden in peulvruchtensoorten te profileren. Verder laat het zien hoe die datasets op de juiste manier kunnen worden gecorrigeerd voor analytische variatie en genormaliseerd voordat genotypische informatie wordt geïntegreerd om metaboliet kwantitatieve eigenschap loci (QTL) te detecteren door GWAS uit te voeren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (17:0 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850360P</td>
			<td>Internal standard for lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>FAME solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovitexin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>38953-85-4</td>
			<td>Internal standard for metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lignoceric Acid Methylester</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2442-49-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13684102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyamin -hydrochlorid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>593-56-6</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl laurate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-82-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl myristate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>124-10-7</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl palmitate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-39-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl stearate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-61-8</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl tert-butyl ether (MTBE)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13890602</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-caprat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>110-42-9</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcaprylat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-11-5</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyldocosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>929-77-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyleicosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1120-28-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-hexacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5802-82-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-octacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>55682-92-3</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-pelargonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1731-84-6</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamid (MSTFA)</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>24589-78-4</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>110-86-1</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribitol</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>22566-17-2</td>
			<td>Internal standard for derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triacontanoic Acid Methyl Ester</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>629-83-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>23214102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius Corporation</td>
			<td>14 557 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-35ms, 30 m, 0,25 mm, 0,25 &#181;m</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>123-3832</td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC-MS system</td>
			<td>Leco Pegasus HT TOF-MS (LECO Corporation)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding Balls, Stainless Steel</td>
			<td>OPS DIAGNOSTICS</td>
			<td>GBSS 196-2500-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Q Exactive Focus (Q Exactive&#8482; Focus Hybrid Quadrupol-Orbitrap&#8482; 
			Massenspektrometer, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf, model 5427R</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.7 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002878</td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RP High Strength Silica (HSS) T3 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.8 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003539</td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf Thermomixer 5436</td>
			<td>2050-100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>USC 300 TH</td>
			<td>142-0084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinding mixer mill</td>
			<td>Retsch, Mixer Mill MM 300</td>
			<td>20.746.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC system</td>
			<td>Waters Acquity UPLC system (Waters)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators</td>
			<td>7.008.500.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Vortex-Genie 2, Model G560</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetAlign</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MzMine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;data.table&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;fujiplot&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pleiotrpoic map</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;genetics&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;Ime4&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BLUPs calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;LDheatmap&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>LD plots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;MASS&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;rMVP&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GWAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 4.0.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS Genedata</td>
			<td>Expressionist</td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>OPTON-30965</td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization

Zowel gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) als vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) zijn veelgebruikte metabolomics-benaderingen om honderdduizenden metabolietkenmerken te detecteren en te kwantificeren. De toepassing van deze technieken op een groot aantal monsters is echter onderhevig aan complexere interacties, met name voor genoombrede associatiestudies (GWAS). Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde metabole workflow, die een efficiënte en snelle monstervoorbereiding combineert met de analyse van een groot aantal monsters voor peulvruchten. Deze licht gewijzigde extractiemethode is in eerste instantie ontwikkeld voor de analyse van plantaardige en dierlijke weefsels en is gebaseerd op extractie in methyltert-butylether: methanoloplosmiddel om polaire en lipidemetabolieten te kunnen vangen. Daarnaast bieden we een stapsgewijze handleiding voor het verminderen van analytische variaties, die essentieel zijn voor de high-throughput evaluatie van metabole variantie in GWAS.

Succesvolle metabolomics GWAS-experimenten moeten beginnen met een goed experimenteel ontwerp, gevolgd door monsterverzameling, extractie, gegevensverzameling en verwerking, zoals geïllustreerd in figuur 1. In dit protocol werd de MTBE-methode15 gebruikt om honderden metabolieten te extraheren en te analyseren die tot verschillende samengestelde klassen behoren. Chromatografie is sterk afhankelijk van de eigenschappen van de gebruikte kolom en van elutiebuffermengsels. Figuur 2 toont chromatogrammen van QC-monsters, wat het elutiepatroon van enkele belangrijke lipidenklassen in dit analysesysteem aangeeft. De toegepaste gradiënten voor elk platform zijn weergegeven in tabel 1. Sterke nadruk werd gelegd op het omgaan met systeemfouten in grootschalige experimenten. Het uitvoeren van grootschalige metabolomics is inherent geassocieerd met systemische fouten. Voor demonstratie analyseerden we lipidomische gegevens over verschillende veel voorkomende bonensoorten. Aanvullende tabel 1 bevat de geëxtraheerde ruwe lipidomische gegevens die zijn verkregen na chromatogramverwerking met behulp van de software die is aangegeven in de tabel met materialen. Het volgen van dit protocol stelde ons in staat om grote problemen bij het omgaan met omics-gegevens te omzeilen, vooral tijdens het verwerken van grote steekproefsets. De normalisatieprocedure levert een nauwkeurige correctie op van batchgewijze analytische fouten, zoals aangetoond in figuur 3. Hoewel het verhogen van het aantal QC-monsters de kracht van de normalisatie zou vergroten, is dit niet altijd haalbaar vanwege kosten- en tijdsbeperkingen. Voor high-throughput metabolomics GWAS met niet-gerichte metabole kenmerken is het essentieel om hogere aantallen trait-marker associatie op de juiste manier te illustreren. Een pleiotrope kaart38 die meerdere GWAS-resultaten combineert, kan worden gebruikt om de genomische regio's te markeren waaraan verschillende kenmerken zijn gekoppeld (figuur 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig01.jpg"> Figuur 1: Stroomdiagram van de op metabolomica gebaseerde GWAS in planten. Verschillende stappen vanaf het experimentele ontwerp tot de detectie van QTL worden weergegeven in het linkerdeelvenster. In het rechterdeelvenster worden meerdere figuren weergegeven die verschillende stappen ondersteunen die in het linkerdeelvenster worden genoemd. Vanaf de rechterboven wordt (1) een voorgestelde reeks monsters getoond voor LC-MS, (2) pre- en post-genormaliseerde scoreplots van PCA, inclusief een representatieve functieverdeling voor- en nabewerking, met rood dat QC-monsterintensiteiten aangeeft, en (3) een Manhattan-plot met significante associaties waarnaar LD- en haplotypeverdelingen werden gegenereerd. Afkortingen: GWAS = genoombrede associatiestudies; QTL = kwantitatieve eigenschap loci; PCA = analyse van de hoofdcomponenten; QC = kwaliteitscontrole; LD = koppelingsdisequilibrium; MS = massaspectrometrie; LC-MS = vloeistofchromatografie-massaspectrometrie; GC-MS = gaschromatografie-massaspectrometrie; LOESS = lokaal geschatte scatterplot smoothing; MLM/MLMM = gemengd lineair model/multi-locus gemengd-model. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig02.jpg"> Figuur 2: Chromatogramverwerking. Twee QC-chromatogrammen (base peak; lipidegegevens) uit verschillende batches tonen de batchgewijze variatie voor bepaalde lipideklassen in de gepoolde QC-monsters. Vier belangrijke lipidenklassen worden aangegeven met hun respectieve elutievensters in het interne LC-MS-systeem. De chromatogrammen werden geëxporteerd uit MzMine21. Afkortingen: QC = kwaliteitscontrole; LC-MS = vloeistofchromatografie-massaspectrometrie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig03.jpg"> Figuur 3: Correctie van systematische fouten. Belangrijkste componentanalyse van verworven lipidomische gegevens, pre- (links, ruwe gegevens) en postcorrectie voor systemische fouten (rechts, batch löss). De onderste panelen illustreren de functieverdeling (Cluster_00005) over de monsters (n = 650) en batches (n = 10) pre- (links) en post (rechts) correctie voor analytische variatie. Afkortingen: PCA = principal component analysis; QC = kwaliteitscontrole; LOESS = lokaal geschatte scatterplot smoothing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig04.jpg"> Figuur 4: Pleiotrope kaart die de gecombineerde GWAS-resultaten illustreert. De pleiotrope kaart markeert regio's in het hele genoom die geassocieerd zijn met verschillende eigenschappen. De getallen op de buitenste ringen geven de overeenkomstige chromosomen aan. Elke circlet vertegenwoordigt een individuele eigenschap met zijn significant geassocieerde SNP's. De kleuren vertegenwoordigen verschillende samengestelde klassen (grijs = samengestelde klasse 1; groen = samengestelde klasse 2; paars = samengestelde klasse 3; geel = samengestelde klasse 4). In het geval van inter-samengestelde klasse associaties met hetzelfde genomische gebied, worden genen gemarkeerd. De binnenste grijze cirkel toont de som van alle significante SNP's geassocieerd met een specifieke genomische positie. De associaties die in deze figuur worden weergegeven, worden alleen kunstmatig gegenereerd ter illustratie. Afkortingen: GWAS = genoombrede associatiestudies; SNP's = single-nucleotide polymorfismen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="5">UHPLC-MS-instellingen voor lipiden</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tijd [min]</td>
			<td>Eluent A tot B [%]*</td>
			<td colspan="3">Informatie</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>45% A</td>
			<td colspan="3">Eluent A: 1% 1M NH 4-Acetaat, 0,1% azijnzuur in water (UHPLC-kwaliteit)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 4.00</td>
			<td>LG 45% - 25% A</td>
			<td colspan="3">Eluent B: 1% 1M NH 4-Acetaat, 0,1% azijnzuur in acetonitril/2-propanol 7:3 (UHPLC-kwaliteit)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4.00 - 12.00</td>
			<td>LG 25% - 11% A</td>
			<td colspan="3">
Debiet: 400 μL/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>12.00 - 15.00</td>
			<td>LG 11% - 0% A</td>
			<td colspan="3">
Injectievolume: 2 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 19.50</td>
			<td>cw 0% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.50-19.51</td>
			<td>0% - 45% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.51-24.00</td>
			<td>EQ 45%</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">UHPLC-MS/MS-instellingen voor polaire en semipolaire metabolieten</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tijd [min]</td>
			<td>Eluent A en B [%]*</td>
			<td colspan="3">Informatie</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>99% A</td>
			<td colspan="3">Eluent A: 0,1% mierenzuur in water (UHPLC-kwaliteit)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 11.00</td>
			<td>LG 99% -60% A</td>
			<td colspan="3">Eluent B: 0,1% mierenzuur in acetonitril (UHPLC-kwaliteit)</td>
		</tr>
<tr>
<td>11.00 - 13.00</td>
			<td>LG 60% - 30% A</td>
			<td colspan="3">
Debiet: 400 μL/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>13.00 - 15.00</td>
			<td>LG 30% - 1% A</td>
			<td colspan="3">
Injectievolume: 3 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 16.00</td>
			<td>cw 1% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>16.00 - 17.00</td>
			<td>LG 1% - 99% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>17.00 - 20.00</td>
			<td>eq 99% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">GC-MS-instellingen voor gederivatiseerde metabolieten</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tijd [min]</td>
			<td>Temperatuur [°C]</td>
			<td colspan="3">Informatie</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 2.00</td>
			<td>85</td>
			<td colspan="3">
Draaggas: Helium</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.00 - 18.66</td>
			<td>LG 80 - 330</td>
			<td colspan="3">
Debiet: 2 ml/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>18.66 - 24.66</td>
			<td>CW 330</td>
			<td colspan="3">
Temperatuurgradiënt: 15 °C/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>24.66</td>
			<td>snelle koeling</td>
			<td colspan="3">
Injectievolume: 1 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Verloopinstellingen voor elk van de analyseplatforms7. Afkortingen: lg = lineaire gradiënt; cw = kolom wassen; eq = evenwicht; UHPLC-MS = ultra-high-performance vloeistofchromatografie-massaspectrometrie; UHPLC-MS/MS = ultra-high-performance vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie; GC-MS = gaschromatografie-massaspectrometrie. * = procentuele waarde komt overeen met eluent A; de resterende procentuele waarde komt overeen met eluent B.
Aanvullende tabel 1: Ruwe lipidomics-gegevens. Geeft de piekintensiteiten aan voor elk van de gedetecteerde clusters over elk monster. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/Supplementary%20Table%201%20.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization at JoVE.com

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

In dit protocol presenteren we een geoptimaliseerde workflow, die een efficiënte en snelle monstervoorbereiding van veel monsters combineert. Daarnaast bieden we een stapsgewijze handleiding om analytische variaties te verminderen voor high-throughput evaluatie van metabole GWAS-studies.

Grootschalige multi-omics Genome-wide Association Studies (Mo-GWAS): richtlijnen voor monstervoorbereiding en normalisatie

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

Het onderzoeken van een grotere populatie komt met een machine-gedreven variatie, die hierdoor de werkelijke variatie die voortkomt uit natuurlijke diversiteit. Hier demonstreren we een methode om de technische variatie voor downstream integratieanalyse te verminderen. De voordelen van deze techniek omvatten een op gezichtsscheiding gebaseerde extractie, waarbij de analyse van verschillende metabolieten op het respectieve analytische platform wordt uitgevoerd, terwijl de systemische fout wordt verwijderd en de biologische variantie wordt gehandhaafd.Zodra de genotypische en fenotypische informatie is verkregen, kan deze methode worden toegepast op elke diverse natuurlijke populatie in elk koninkrijk van het leven. Om te beginnen, neem je oogstbuizen van 20 milliliter, voeg je twee metalen kralen met een diameter van vijf millimeter en twee acht millimeter toe voor homogeniseren en label je de buizen. Vul vervolgens een dewar met vloeibare stikstof, onmiddellijk na het snijden van verse blad- en wortelweefselmonsters in vloeibare stikstof door flash freezing.Bewaar de geoogste biologische monsters op 80 graden celsius voor verdere verwerking. Koel de buishouders voor in vloeibare stikstof. Maal vervolgens de weefsels op 25 hertz gedurende één minuut om een homogeen poeder te verkrijgen.Herhaal het bevriezen en malen als het weefsel niet homogeen is gemalen. Weeg 50 milligram vers plantmateriaal in een voorgekoelde gelabelde microcentrifugebuizen van twee millimeter veilig slot, zodat plantmateriaal bevroren blijft tijdens het weegproces. Voeg een milliliter voorgekoeld extractiemengsel 1 tot 50 milligram aliquot van het monster toe en vortex de buis kort voordat u het op ijs houdt.Incubeer de monsters op een orbitale shaker op 800 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius, gevolgd door ultrasoonapparaat in een ijsgekoeld ultrasoonapparaatbad gedurende 10 minuten. Gebruik een meerkanaals pipet om ook 500 microliter extractiemengsel aan de monsters toe te voegen en meng de extracten door middel van korte vortexing en centrifugeer het mengsel vervolgens op 11, 200 keer G gedurende 5 minuten bij vier graden Celsius. Breng na centrifugatie 500 microliter van de gescheiden bovenste lipidebevattende fase over naar een vooraf gelabelde 1,5 milliliter veilige slotmicrocentrifugebuis, verwijder de rest van de bovenste fase.In afzonderlijke, 1,5-milliliter veilige slotmicrocentrifugebuizen dragen 150 microliter van de onderste semipolaire fase vier GCMS en 300 microliter van de semipolaire fase vier U-H-P-L-C MS-analyse over. Gebruik een vacuümconcentrator voor oplosmiddelverdamping om alle geëxtraheerde fracties te concentreren zonder verhitting en bewaar de gedroogde fracties bij 20 graden Celsius. Om het monster voor te bereiden op ultrahoge prestaties, worden vloeistofchromatografie, massaspectrometrie of H-P-L-C MS de gedroogde semipolaire fracties opnieuw gesuspendeerd in 180 microliter van een mengsel van methanol en water.Soniceer vervolgens de semipolaire fase gedurende 2 minuten, gevolgd door centrifugatie op 11, 200 keer G gedurende één minuut. Breng na centrifugatie 90 microliter van het supernatant over naar een glazen injectieflacon en injecteer twee microliter van de extracten in het gegoten LCMS-monster. Voer de metabolietfractionering uit op een omgekeerde fase C18-kolom die op 40 graden Celsius wordt gehouden, en een stroom van 400 microliter per minuut met geleidelijke veranderingen van effluent A en B, verkrijg de massaspectra van de test blanco en kwaliteitscontrolemonsters in negatieve ionisatiemodus met een massabereik van 102 1500 massa/ladingsverhouding.Voer voor de semipolaire metabolietenmonsters een gepoold QC-monster uit in gegevensafhankelijke tandemmassaspectrometrie in negatieve en positieve ionisatiemodi. Gebruik de verkregen massaspectra voor de annotatie. Voer de normalisatie van de gegevensset uit door de verdeling van de interne standaard te controleren.Normaliseer de gegevens door te corrigeren voor het signaal van enkele of meerdere interne standaarden. Corrigeer vervolgens de piekintensiteiten die zijn verkregen uit het chromatogram over het exacte monstergewicht. Voor het corrigeren van de intensiteitsdrift over multi-batch-series, voert u op QC gebaseerde correctiemethoden uit, zoals lokaal geschatte scatterplot-smoothing met behulp van R.Voordat u genoombrede associatiestudies of GWAS uitvoert, filtert u de genotypische gegevens voor kleine allelfrequenties van minder dan 5% en een ontbrekend percentage van meer dan 10% met behulp van kwast.Dit voorkomt laagfrequente bias. Om de vertekening afkomstig van de omgevingsfactoren te elimineren, gebruikt u het R-pakket LME vier en berekent u de beste lineaire, onbevooroordeelde voorspellingen of blops voor elk genormaliseerd kenmerk over de experimentele herhalingen. Gebruik blops van elke functie afzonderlijk om GWAS uit te voeren met het rMVP-pakket in R.De lipidomische gegevens over verschillende veel voorkomende bonensoorten worden weergegeven op basis van de ruwe basispiekchromatogrammen van twee QC-monsters uit verschillende batches.Een variatie in de signaalintensiteiten werd waargenomen voor bepaalde lipidenklassen. De systeemfout werd duidelijker toen de belangrijkste componentanalyse werd uitgevoerd op de onbewerkte gegevens. De normalisatieprocedure, inclusief de lokaal geschatte scatterplot smoothing, leidde tot de clustering van de QC-monsters.Bij het ontleden in de afzonderlijke clusters werden machinegestuurde fouten in batch zeven en acht duidelijk voorafgaand aan normalisatie, die werd gecorrigeerd. De post-genormaliseerde en getransformeerde individuele metabolomische clusters werden gebruikt voor GWAS, wat resulteerde in verschillende kenmerkmarkerassociaties. In de representatieve analyse worden verschillende samengestelde klassen in verschillende kleuren gemarkeerd, terwijl de markers geassocieerd met meerdere samengestelde klassen worden aangegeven met het dichtstbijzijnde gen.Datanormalisatie en -transformatie zijn een van de belangrijkste stappen. Zorg ervoor dat de juiste correctie is uitgevoerd om te corrigeren voor systeemfouten en zorg voor normaliteit in de verdeling. Door de correctie voor de analytische variatie uit te voeren, kunnen verschillende integratiebenaderingen worden uitgevoerd, zoals metabole correlatieanalyse en integratie in fenomische gegevens om licht te werpen op complexe eigenschappen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genoom-brede kwantificering van vertaling in de ontluikende gist door het ribosoom profilering

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plaat gebaseerde grootschalige teelt van Caenorhabditis elegans: bereiding van de monsters voor de studie van de metabole veranderingen bij Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Monster voorbereiding voor Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Label-vrije Immunoprecipitation massaspectrometrie workflow voor grootschalige nucleaire interactome profilering

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Sample Voorbereiding voor Proteomics Facility Indiening en latere data-analyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Een monstervoorbereidingspijplijn voor microkristallen op de VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Voorbereiding van hoge temperatuur monsterroosters voor Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Monstervoorbereiding en relatieve kwantificering met behulp van reductieve methylering van amines voor peptidomics-studies

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Monstervoorbereiding met behulp van een lipide monolaagmethode voor elektronenkristallografische studies

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...