Name: large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization
Uploaded: 2021-07-27T15:00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization at JoVE.com

M.B. est soutenu par l’IMPRS-PMPG 'Primary Metabolism and Plant Growth'. A.R.F. et S.A. reconnaissent le soutien financier du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’UE, du projet PlantaSYST (SGA-CSA n° 739582 sous FPA n° 664620) et du projet INCREASE (GA 862862).

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

GC-MS et LC-MS sont des outils largement utilisés pour profiler des mélanges complexes de diverses classes de métabolites. La manipulation de grands ensembles de données à l’aide de ces outils est intrinsèquement associée à une variation non biologique, p. ex. une variation analytique, qui interfère et biaise l’interprétation des résultats. Ce protocole présente un pipeline d’extraction robuste et à haut débit pour un profilage métabolique complet afin d’éliminer la variation d’origine non biologique et de mener des études « omiques » à grande échelle. Les volumes et les concentrations utilisés dans ce protocole ont été ajustés pour tenir compte des espèces de légumineuses dans différents tissus. Cependant, ces paramètres peuvent être légèrement modifiés et utilisés pour des échantillons métaboliques à grande échelle provenant d’autres espèces végétales.
Les15 extractions à base de MTBE décrites précédemment peuvent être utilisées pour analyser les métabolites dérivés, les métabolites semi-polaires et les lipides. Cela peut être étendu pour les extractions de protéines et d’hormones végétales39, qui étaient hors du champ d’application de ce protocole. D’autres protocoles d’extraction reposent sur des mélanges dichlorométhane:éthanol40,41. Parmi ces protocoles d’extraction, le protocole d’extraction MTBE:méthanol offre une alternative favorable et moins dangereuse aux protocoles d’extraction existants à base de chloroforme42 et n’aboutit pas à une pastille de protéine comme interphase entre les phases polaire et lipidique. En outre, les méthodes MTBE ont déjà été utilisées dans plusieurs études pour divers échantillons biologiques 43,44,45.
Ce protocole traite de plusieurs étapes cruciales qui pourraient entraîner des variations potentielles lors de la manipulation d’un grand nombre d’échantillons, par exemple lors de la récolte12,13, de l’extraction14, ainsi que de la randomisation46. De plus, il y a d’autres questions qui n’ont pas été abordées dans ce protocole et qui doivent être prises en compte pour assurer des données métabolomiques de haute qualité, par exemple l’effet de matrice et la suppression des ions14.
La puissance des méthodes de normalisation basées sur le CQ dépend intrinsèquement du nombre d’échantillons de CQ dans chaque lot. Comme mentionné précédemment, bien que l’augmentation du nombre augmenterait la puissance, la variation intra-lot des QC est relativement marginale par rapport à la variation inter-lots dans ces systèmes analytiques, comme illustré à la figure 3. Dans l’ensemble, il existe d’autres méthodes de normalisation basées sur le CQ, telles que l’élimination des erreurs systémiques à l’aide de la forêt aléatoire (SERRF), qui se sont avérées surpassant la plupart des autres méthodes de normalisation telles que le ratio par lots, la normalisation à l’aide d’une sélection optimale de plusieurs étalons internes (NOMIS) et la normalisation probabiliste du quotient (PQN)47 . Cependant, SERRF s’appuie sur plusieurs échantillons de CQ dans chaque lot, par exemple, un échantillon sur dix, ce qui n’est pas réalisable lors de la manipulation d’un grand nombre d’échantillons. Le principal avantage de la normalisation basée sur le CQ par rapport à d’autres méthodes basées sur des données ou des normes internes est qu’elle conserve la variation biologique essentielle tout en tenant compte de la variation technique indésirable28. Les lecteurs peuvent se référer à cette revue sur le traitement de la variation28.
L’un des principaux problèmes dans GWAS est le taux de faux positifs, qui provient principalement du lien entre les sites causaux et non causaux48,49. Deuxièmement, les approches de correction statistique conservatrices, par exemple Bonferroni et FDR, corrigent le nombre de tests indépendants, qui n’est pas égal au nombre de SNP analysés dans GWAS en raison du lien entre les SNP proches50,51 Par conséquent, le nombre réel de tests indépendants est souvent plus faible. Une autre façon de réduire le seuil statistique conservateur serait de réduire le nombre de SNP testés utilisés pour les GWAS en fonction de la désintégration des liens sur des régions génomiques définies52. La plate-forme métabolomique à haut débit intégrée à GWAS décrite dans ce protocole a un large éventail d’applications. En particulier, il facilitera l’amélioration de la sélection des cultures en modifiant la composition métabolite/lipidique pour les niveaux souhaités industriellement et nutritionnellement. Dans l’ensemble, la métabolomique a fourni un aperçu approfondi de l’architecture génétique d’une pléthore de métabolites et de la diversification métabolique qui s’est produite lors de la domestication des cultures au cours des dernières décennies, indiquant le vaste potentiel de la sélection associée à la métabolomique53. Les approches de biologie moléculaire pour la validation QTL en aval comprennent la génération de lignées mutantes CRISPR/Cas954, de lignées d’insertion d’ADN-T55, de lignes de surexpression stables et/ou transitoires56, de VIGS, d’approches métabolomiques ex vivo 57 à côté de l’approche conventionnelle pour générer des populations croisées F2 ainsi que la validation croisée dans différentes populations.
En effectuant la correction nécessaire pour les variations analytiques décrites ci-dessus, plusieurs approches intégrées peuvent être effectuées en plus des GWAS, telles que l’analyse de corrélation métabolite-métabolite, métabolite-lipide, l’analyse de corrélation aux données phénomiques pour faire la lumière sur des traits plus complexes et / ou l’analyse de co-expression pour démêler davantage la base des systèmes biologiques58.

Les approches « omiques » à grande échelle ont permis l’analyse de systèmes biologiques complexes 1,2,3 et une meilleure compréhension du lien entre les génotypes et les phénotypes qui en résultent4. La métabolomique utilisant la chromatographie liquide ultra-haute performance-spectrométrie de masse (UHPLC-MS) et la GC-MS a permis la détection d’une pléthore de caractéristiques métabolites, dont seules certaines sont annotées dans une certaine mesure, ce qui entraîne une forte proportion de métabolites inconnus. Les interactions complexes peuvent être explorées en combinant la métabolomique à grande échelle avec la variation génotypique sous-jacente d’une population diversifiée5. Cependant, la manipulation de grands ensembles d’échantillons est intrinsèquement associée à des variations analytiques, ce qui fausse l’évaluation de la variance métabolique pour d’autres processus en aval. Plus précisément, les problèmes majeurs conduisant à des variations analytiques sont basés sur les performances de la machine et la dérive instrumentale au fil du temps6. L’intégration de la variation d’un lot à l’autre est difficile et particulièrement problématique lors de l’analyse de populations végétales structurées à grande échelle. De multiples procédures de normalisation ont été suggérées pour corriger les variations non biologiques, p. ex., l’utilisation de normes internes, externes et isotopiques pour corriger les erreurs analytiques, dont chacune est intrinsèquement associée à des problèmes et des pièges connus 7,8,9,10.
En plus de la variation analytique, le choix des protocoles d’extraction varie généralement en fonction de la méthode d’analyse. En fin de compte, il est souhaité de réduire les coûts de matériaux et de main-d’œuvre ainsi que la nécessité d’utiliser plusieurs aliquotes du même échantillon pour divers processus analytiques en effectuant des méthodes d’extraction basées sur la séparation de phase. Ces méthodes ont d’abord été introduites en utilisant du chloroforme : des solvants méthanol/eau pour fractionner les composés polaires et hydrophobes11.
Ce protocole décrit un pipeline rapide à haut débit pour une plate-forme multi-omique permettant de profiler à la fois les métabolites polaires et les lipides chez les espèces de légumineuses. En outre, il montre comment ces ensembles de données peuvent être corrigés de manière appropriée pour la variation analytique et normalisés avant d’intégrer des informations génotypiques pour détecter les loci de caractères quantitatifs des métabolites (QTL) en effectuant GWAS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (17:0 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850360P</td>
			<td>Internal standard for lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>FAME solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovitexin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>38953-85-4</td>
			<td>Internal standard for metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lignoceric Acid Methylester</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2442-49-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13684102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyamin -hydrochlorid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>593-56-6</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl laurate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-82-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl myristate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>124-10-7</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl palmitate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-39-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl stearate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-61-8</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl tert-butyl ether (MTBE)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13890602</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-caprat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>110-42-9</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcaprylat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-11-5</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyldocosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>929-77-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyleicosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1120-28-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-hexacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5802-82-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-octacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>55682-92-3</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-pelargonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1731-84-6</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamid (MSTFA)</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>24589-78-4</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>110-86-1</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribitol</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>22566-17-2</td>
			<td>Internal standard for derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triacontanoic Acid Methyl Ester</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>629-83-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>23214102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius Corporation</td>
			<td>14 557 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-35ms, 30 m, 0,25 mm, 0,25 &#181;m</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>123-3832</td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC-MS system</td>
			<td>Leco Pegasus HT TOF-MS (LECO Corporation)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding Balls, Stainless Steel</td>
			<td>OPS DIAGNOSTICS</td>
			<td>GBSS 196-2500-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Q Exactive Focus (Q Exactive&#8482; Focus Hybrid Quadrupol-Orbitrap&#8482; 
			Massenspektrometer, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf, model 5427R</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.7 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002878</td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RP High Strength Silica (HSS) T3 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.8 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003539</td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf Thermomixer 5436</td>
			<td>2050-100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>USC 300 TH</td>
			<td>142-0084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinding mixer mill</td>
			<td>Retsch, Mixer Mill MM 300</td>
			<td>20.746.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC system</td>
			<td>Waters Acquity UPLC system (Waters)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators</td>
			<td>7.008.500.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Vortex-Genie 2, Model G560</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetAlign</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MzMine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;data.table&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;fujiplot&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pleiotrpoic map</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;genetics&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;Ime4&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BLUPs calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;LDheatmap&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>LD plots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;MASS&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;rMVP&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GWAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 4.0.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS Genedata</td>
			<td>Expressionist</td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>OPTON-30965</td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization

La chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS) et la chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS) sont des approches métabolomiques largement utilisées pour détecter et quantifier des centaines de milliers de caractéristiques métabolites. Cependant, l’application de ces techniques à un grand nombre d’échantillons est sujette à des interactions plus complexes, en particulier pour les études d’association à l’échelle du génome (GWAS). Ce protocole décrit un flux de travail métabolique optimisé, qui combine une préparation efficace et rapide des échantillons avec l’analyse d’un grand nombre d’échantillons pour les espèces de cultures de légumineuses. Cette méthode d’extraction légèrement modifiée a été initialement développée pour l’analyse des tissus végétaux et animaux et est basée sur l’extraction dans l’éther méthyl-tert-butylique : solvant méthanol pour permettre la capture des métabolites polaires et lipidiques. En outre, nous fournissons un guide étape par étape pour réduire les variations analytiques, qui sont essentielles pour l’évaluation à haut débit de la variance métabolique dans GWAS.

Les expériences GWAS métabolomiques réussies devraient commencer par un plan expérimental approprié, suivi de la collecte, de l’extraction, de l’acquisition et du traitement des échantillons, comme illustré à la figure 1. Dans ce protocole, la méthode MTBE15 a été utilisée pour extraire et analyser des centaines de métabolites appartenant à plusieurs classes de composés. La chromatographie dépend fortement des propriétés de la colonne utilisée ainsi que des mélanges tampons d’élution. La figure 2 montre les chromatogrammes des échantillons de CQ, indiquant le profil d’élution de certaines classes de lipides majeures dans ce système analytique. Les gradients appliqués pour chaque plate-forme sont donnés dans le tableau 1. L’accent a été mis sur la gestion des erreurs systémiques dans les expériences à grande échelle. La réalisation de métabolomiques à grande échelle est intrinsèquement associée à des erreurs systémiques. À des fins de démonstration, nous avons analysé les données lipidomiques de plusieurs espèces de haricots communs. Le tableau supplémentaire 1 fournit les données lipidomiques brutes extraites obtenues après le traitement du chromatogramme à l’aide du logiciel indiqué dans le tableau des matériaux. Le respect de ce protocole nous a permis de contourner les problèmes majeurs liés au traitement des données omiques, en particulier lors de la manipulation de grands ensembles d’échantillons. La procédure de normalisation permet de corriger avec précision les erreurs analytiques par lots, comme le montre la figure 3. Bien que l’augmentation du nombre d’échantillons de CQ augmenterait la puissance de la normalisation, cela n’est pas toujours réalisable en raison des contraintes de coût et de temps. Pour les GWAS métabolomiques à haut débit avec des caractéristiques métaboliques non ciblées, il est essentiel d’illustrer de manière appropriée un nombre plus élevé d’associations trait-marqueur. Une carte pléiotropique38 combinant plusieurs résultats GWAS pourrait être utilisée pour mettre en évidence les régions génomiques auxquelles plusieurs traits sont liés (Figure 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig01.jpg"> Figure 1 : Organigramme du GWAS à base de métabolomique chez les plantes. Plusieurs étapes allant de la conception expérimentale jusqu’à la détection de QTL sont affichées dans le panneau de gauche. Dans le panneau de droite, plusieurs figures sont affichées pour prendre en charge plusieurs étapes mentionnées dans le panneau de gauche. En partant du haut à droite, (1) une séquence suggérée d’échantillons est montrée pour LC-MS, (2) des diagrammes de score pré- et post-normalisés de PCA, y compris une distribution représentative des caractéristiques avant et après le traitement, avec le rouge indiquant les intensités de l’échantillon QC, et (3) un diagramme de Manhattan avec des associations significatives auxquelles des distributions LD et haplotypes ont été générées. Abréviations : GWAS = études d’association à l’échelle du génome; QTL = loci de caractères quantitatifs; APC = analyse en composantes principales; QC = contrôle de la qualité; LD = déséquilibre de liaison; MS = spectrométrie de masse; LC-MS = chromatographie liquide-spectrométrie de masse; GC-MS = chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse; LOESS = lissage du nuage de points estimé localement; MLM/MLMM = modèle linéaire mixte/modèle mixte multi-locus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig02.jpg"> Figure 2 : Traitement du chromatogramme. Deux chromatogrammes QC (pic de base; données lipidiques) de différents lots démontrent la variation par lot pour certaines classes de lipides dans les échantillons QC regroupés. Quatre grandes classes de lipides sont indiquées avec leurs fenêtres d’élution respectives dans le système LC-MS interne. Les chromatogrammes ont été exportés à partir de MzMine21. Abréviations : QC = contrôle de la qualité; LC-MS = chromatographie liquide-spectrométrie de masse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig03.jpg"> Figure 3 : Correction d’une erreur systématique. Analyse en composantes principales des données lipidomiques acquises, pré- (gauche, données brutes) et post-correction pour les erreurs systémiques (droite, lœss de lot). Les panneaux inférieurs illustrent la distribution des caractéristiques (Cluster_00005) sur les échantillons (n = 650) et les lots (n = 10) avant (à gauche) et après (à droite) pour la variation analytique. Abréviations : APC = analyse en composantes principales; QC = contrôle de la qualité; LOESS = lissage du nuage de points estimé localement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig04.jpg"> Figure 4 : Carte pléiotropique illustrant les résultats combinés du GWAS. La carte pléiotropique met en évidence des régions de l’ensemble du génome associées à plusieurs traits. Les chiffres sur les anneaux extérieurs indiquent les chromosomes correspondants. Chaque cercle représente un trait individuel avec ses SNP significativement associés. Les couleurs représentent différentes classes de composés (gris = classe de composé 1; vert = classe de composé 2; violet = classe de composé 3; jaune = classe de composé 4). Dans le cas d’associations de classes inter-composés avec la même région génomique, les gènes sont mis en évidence. Le cercle gris intérieur montre la somme de tous les SNP significatifs associés à une position génomique spécifique. Les associations présentées dans cette figure ne sont générées artificiellement qu’à titre d’illustration. Abréviations : GWAS = études d’association à l’échelle du génome; SNP = polymorphismes mononucléotidiques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="5">Paramètres UHPLC-MS pour les lipides</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temps [min]</td>
			<td>Éluant A à B [%]*</td>
			<td colspan="3">Information</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>45 % A</td>
			<td colspan="3">Éluant A : 1 % 1 M NH 4-acétate, 0,1 % d’acide acétique dans l’eau (grade UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 4.00</td>
			<td>lg 45% - 25% A</td>
			<td colspan="3">Éluant B : 1 % 1 M NH 4-acétate, 0,1 % d’acide acétique dans l’acétonitrile/2-propanol 7:3 (grade UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4.00 - 12.00</td>
			<td>lg 25% - 11% A</td>
			<td colspan="3">
Débit : 400 μL/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>12.00 - 15.00</td>
			<td>lg 11% - 0% A</td>
			<td colspan="3">
Volume d’injection : 2 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 19.50</td>
			<td>cw 0% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.50-19.51</td>
			<td>0 % - 45 % A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.51-24.00</td>
			<td>eq 45%</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">Paramètres UHPLC-MS/MS pour les métabolites polaires et semi-polaires</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temps [min]</td>
			<td>Éluant a et b [%]*</td>
			<td colspan="3">Information</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>99 % A</td>
			<td colspan="3">Éluant A : 0,1 % d’acide formique dans l’eau (grade UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 11.00</td>
			<td>lg 99% -60% A</td>
			<td colspan="3">Éluant B : 0,1 % d’acide formique dans l’acétonitrile (grade UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>11.00 - 13.00</td>
			<td>lg 60% - 30% A</td>
			<td colspan="3">
Débit : 400 μL/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>13.00 - 15.00</td>
			<td>lg 30% - 1% A</td>
			<td colspan="3">
Volume d’injection: 3 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 16.00</td>
			<td>cw 1% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>16.00 - 17.00</td>
			<td>lg 1% - 99% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>17.00 - 20.00</td>
			<td>eq 99% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">Paramètres GC-MS pour les métabolites dérivés</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temps [min]</td>
			<td>Température [°C]</td>
			<td colspan="3">Information</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 2.00</td>
			<td>85</td>
			<td colspan="3">
Gaz porteur : Hélium</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.00 - 18.66</td>
			<td>lg 80 - 330</td>
			<td colspan="3">
Débit : 2 mL/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>18.66 - 24.66</td>
			<td>cw 330</td>
			<td colspan="3">
Gradient de température : 15 °C/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>24.66</td>
			<td>refroidissement rapide</td>
			<td colspan="3">
Volume d’injection : 1 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Paramètres de gradient pour chacune des plates-formes analytiques7. Abréviations : lg = gradient linéaire ; cw = lavage de colonne; eq = équilibre; UHPLC-MS = chromatographie liquide ultra-haute performance-spectrométrie de masse; UHPLC-MS/MS = chromatographie liquide ultra-haute performance-spectrométrie de masse en tandem; GC-MS = chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse. * = la valeur en pourcentage correspond à l’éluant A; la valeur restante en pourcentage correspond à l’éluant B.
Tableau supplémentaire 1 : Données lipidomiques brutes. Indique les intensités maximales de chacun des clusters détectés sur chaque échantillon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/Supplementary%20Table%201%20.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

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Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Dans ce protocole, nous présentons un flux de travail optimisé, qui combine une préparation efficace et rapide des échantillons de nombreux échantillons. En outre, nous fournissons un guide étape par étape pour réduire les variations analytiques pour l’évaluation à haut débit des études GWAS métaboliques.

Études d’association multi-omiques à grande échelle à l’échelle du génome (Mo-GWAS): Lignes directrices pour la préparation et la normalisation des échantillons

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

L’étude d’une plus grande population s’accompagne d’une variation entraînée par la machine, qui est donc la variation réelle provenant de la diversité naturelle. Nous démontrons ici une méthode pour réduire la variation technique pour l’analyse d’intégration en aval. Les avantages de cette technique comprennent une extraction basée sur la séparation faciale, fournissant l’analyse de divers métabolites sur la plate-forme analytique respective, tout en supprimant l’erreur systémique et en maintenant la variance biologique.Une fois que les informations génotypiques et phénotypiques sont obtenues, cette méthode peut être appliquée à n’importe quelle population naturelle diversifiée dans n’importe quel royaume de la vie. Pour commencer, prenez des tubes de récolte de 20 millilitres, ajoutez deux billes métalliques de cinq millimètres et deux de huit millimètres de diamètre pour homogénéiser et étiquetez les tubes. Ensuite, remplissez un dewar avec de l’azote liquide, immédiatement après avoir coupé la récolte d’échantillons de feuilles fraîches et de tissus racinaires dans de l’azote liquide par congélation éclair.Conservez les échantillons biologiques récoltés à 80 degrés Celsius pour un traitement ultérieur. Pré-refroidir les porte-tubes dans de l’azote liquide. Ensuite, broyer les tissus à 25 hertz pendant une minute pour obtenir une poudre homogène.Répétez la congélation et le broyage si le tissu n’est pas broyé de manière homogène. Peser 50 milligrammes de matière végétale fraîche dans des tubes de microcentrifugation de sécurité pré-refroidis de deux millimètres, garantissant que la matière végétale reste congelée pendant le processus de pesée. Ajouter un millilitre de mélange d’extraction pré-refroidi de 1 à 50 milligrammes d’aliquote de l’échantillon, et vortexer brièvement le tube avant de le garder sur la glace.Incuber les échantillons sur un agitateur orbital à 800 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, suivi d’une sonication dans un bain de sonication refroidi par la glace pendant 10 minutes. Utilisez une pipette multicanal pour ajouter 500 microlitres de mélange d’extraction aux échantillons et mélangez les extraits par un bref vortex, puis centrifugez le mélange à 11 200 fois G pendant 5 minutes à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, transférer 500 microlitres de la phase supérieure séparée contenant des lipides dans un tube de microcentrifuge à verrouillage de sécurité pré-marqué de 1,5 millilitre, en retirant le reste de la phase supérieure.Dans des tubes de microcentrifugation séparés de 1,5 millilitre de sécurité, 150 microlitres de la phase semi-polaire inférieure quatre GCMS et 300 microlitres de la phase semi-polaire quatre U-H-P-L-C MS analyse. Utilisez un concentrateur sous vide pour l’évaporation du solvant afin de concentrer toutes les fractions extraites sans chauffage et stockez les fractions séchées à 20 degrés Celsius. Pour préparer l’échantillon à ultra-haute performance, la chromatographie liquide, la spectrométrie de masse ou H-P-L-C MS remettent en suspension les fractions semi-polaires séchées dans 180 microlitres d’un mélange de méthanol et d’eau.Soniquez ensuite la phase semi-polaire pendant 2 minutes, suivie d’une centrifugation à 11 200 fois G pendant une minute. Après centrifugation, transférer 90 microlitres du surnageant dans un flacon en verre et injecter deux microlitres d’extraits dans l’échantillon LCMS versé. Effectuer le fractionnement des métabolites sur une colonne de phase C18 inversée maintenue à 40 degrés Celsius, et un débit de 400 microlitres par minute avec des changements progressifs de l’effluent A et B, acquérir les spectres de masse du blanc d’essai et des échantillons de contrôle de la qualité en mode d’ionisation négative avec une plage de masse de 102 1500 rapport masse/charge.Pour les échantillons de métabolites semi-polaires, exécutez un échantillon de CQ groupé en spectrométrie de masse en tandem dépendante des données en modes d’ionisation négative et positive. Utilisez les spectres de masse obtenus pour l’annotation. Effectuez la normalisation de l’ensemble de données en vérifiant la distribution de la norme interne.Normalisez les données en corrigeant le signal d’une ou de plusieurs normes internes. Ensuite, corrigez les intensités de crête obtenues à partir du chromatogramme sur le poids exact de l’échantillon. Pour corriger la dérive d’intensité sur des séries multi-lots, effectuez des méthodes de correction basées sur le QC, telles que le lissage du nuage de points estimé localement à l’aide de R.Avant d’effectuer des études d’association à l’échelle du génome ou GWAS, filtrez les données génotypiques pour les fréquences d’allèles mineures inférieures à 5% et un taux manquant de plus de 10% en utilisant le gland.Cela évitera les biais de basse fréquence. Pour éliminer le biais provenant des facteurs environnementaux, utilisez le paquet R LME four et calculez les meilleures prédictions ou blops linéaires et impartiaux pour chaque caractéristique normalisée au cours des répétitions expérimentales. Utilisez des blops de chaque caractéristique individuellement pour effectuer GWAS avec le package rMVP dans R.Les données lipidomiques de plusieurs espèces de haricots communes sont affichées sur la base des chromatogrammes de pic de base bruts de deux échantillons QC de lots différents.Une variation de l’intensité du signal a été observée pour certaines classes lipidiques. L’erreur systémique était plus évidente lorsque l’analyse en composantes principales était effectuée sur les données brutes. La procédure de normalisation, y compris le lissage du nuage de points estimé localement, a conduit au regroupement des échantillons de CQ.Lors de la dissection dans les clusters individuels, les erreurs pilotées par machine dans les lots sept et huit sont devenues claires avant la normalisation, qui a été corrigée. Les amas métabolomiques individuels post-normalisés et transformés ont été utilisés pour le GWAS, ce qui a donné lieu à plusieurs associations de marqueurs de caractères. Dans l’analyse représentative, différentes classes de composés sont mises en évidence dans différentes couleurs, tandis que les marqueurs associés à plusieurs classes de composés sont indiqués avec son gène le plus proche.La normalisation et la transformation des données sont l’une des étapes les plus importantes. S’assurer qu’une correction appropriée a été effectuée pour corriger les erreurs systémiques et assurer la normalité de la distribution. En effectuant la correction de la variation analytique, plusieurs approches d’intégration peuvent être effectuées, telles que l’analyse de corrélation métabolique et l’intégration dans les données phénomiques pour faire la lumière sur des traits complexes.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Préparation de l’échantillon d’Identification basé sur la spectrométrie de masse des régions de liaison à l’ARN

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Recherche

Biochimie

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genome-wide Quantification de la traduction dans la levure de bière par Ribosome profilage

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Axée sur la plaque de culture à grande échelle de Caenorhabditis elegans: préparation des échantillons pour l’étude des modifications métaboliques dans le diabète

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Préparation d’échantillons pour la spectrométrie de masse d’ionisation de l’électrospray de sonde

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Flux de spectrométrie de masse d'immunoprécipitation sans étiquette pour le profilage de l'interaction nucléaire à grande échelle

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Préparation de l’échantillon TMT pour la soumission des installations de protéomique et l’analyse subséquente des données

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Un pipeline de préparation d’échantillons pour les microcristaux à la ligne de faisceau VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Préparation de grilles d’échantillons à haute température pour Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Préparation des échantillons et quantification relative à l’aide de la méthylation réductrice des amines pour les études peptidomiques

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Préparation d’échantillons à l’aide d’une méthode monocouche lipidique pour les études cristallographiques électroniques

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...