Name: large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization
Uploaded: 2021-07-27T15:00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization at JoVE.com

M.B. wird durch das IMPRS-PMPG 'Primary Metabolism and Plant Growth' unterstützt. A.R.F. und S.A. würdigen die finanzielle Unterstützung des EU-Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020, des Projekts PlantaSYST (SGA-CSA Nr. 739582 unter FPA Nr. 664620) und des Projekts INCREASE (GA 862862).

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Sowohl GC-MS als auch LC-MS sind weit verbreitete Werkzeuge zur Profilierung komplexer Mischungen verschiedener Metabolitenklassen. Der Umgang mit großen Datensätzen mit diesen Werkzeugen ist inhärent mit einer nicht-biologischen Variation verbunden, z. B. analytischer Variation, die die Interpretation der Ergebnisse stört und verzerrt. Dieses Protokoll stellt eine robuste Hochdurchsatz-Extraktionspipeline für eine umfassende metabolische Profilierung dar, um Variationen nicht-biologischen Ursprungs zu eliminieren und groß angelegte "Omics" -Studien durchzuführen. Die in diesem Protokoll verwendeten Volumina und Konzentrationen wurden für Hülsenfruchtarten in verschiedenen Geweben angepasst. Diese Parameter können jedoch leicht modifiziert und auch für großflächige Stoffwechselproben anderer Pflanzenarten verwendet werden.
Die zuvor15 beschriebenen MTBE-basierten Extraktionen können verwendet werden, um derivatisierte Metaboliten, semipolare Metaboliten und Lipide zu analysieren. Dies kann für Protein- und Pflanzenhormonextraktionen39 erweitert werden, die außerhalb des Geltungsbereichs dieses Protokolls lagen. Andere Extraktionsprotokolle beruhen auf Dichlormethan:Ethanol-Gemischen40,41. Von diesen Extraktionsprotokollen bietet das MTBE:methanol-Extraktionsprotokoll eine günstige und weniger gefährliche Alternative zu den bestehenden Chloroform-basierten Extraktionsprotokollen42 und führt nicht zu einem Proteinpellet als Interphase zwischen der polaren und der Lipidphase. Darüber hinaus wurden MTBE-Methoden bereits in mehreren Studien für verschiedene biologische Probenverwendet 43,44,45.
Dieses Protokoll diskutiert mehrere entscheidende Schritte, die bei der Handhabung einer großen Anzahl von Proben zu potenziellen Variationen führen können, z. B. während der Ernte 12,13, der Extraktion 14 sowie der Randomisierung46. Darüber hinaus gibt es zusätzliche Fragen, die in diesem Protokoll nicht diskutiert wurden, die berücksichtigt werden müssen, um qualitativ hochwertige metabolomische Daten zu gewährleisten, z. B. Matrixeffekt und Ionensuppression14.
Die Leistungsfähigkeit von QC-basierten Normalisierungsmethoden hängt von Natur aus von der Anzahl der QC-Proben in jeder Charge ab. Wie bereits erwähnt, ist die Intra-Batch-Variation der QCs im Vergleich zur Inter-Batch-Variation in diesen Analysesystemen relativ marginal, obwohl eine Erhöhung der Anzahl die Leistung erhöhen würde, wie in Abbildung 3 dargestellt. Insgesamt gibt es andere QC-basierte Normalisierungsmethoden, wie z. B. die systemische Fehlerbeseitigung mit Random Forest (SERRF), von denen gezeigt wurde, dass sie die meisten anderen Normalisierungsmethoden übertreffen, wie z. B. das Batch-Wise-Ratio, die Normalisierung mit einer optimalen Auswahl mehrerer interner Standards (NOMIS) und die probabilistische Quotientennormalisierung (PQN)47. . SERRF stützt sich jedoch auf mehrere QC-Proben in jeder Charge, z. B. jede zehnte Probe, was bei der Handhabung einer großen Anzahl von Proben nicht möglich ist. Der Hauptvorteil der QC-basierten Normalisierung gegenüber anderen datengesteuerten oder internen standardbasierten Methoden besteht darin, dass sie die wesentliche biologische Variation beibehält und gleichzeitig unerwünschte technische Variationen berücksichtigt28. Leser können sich auf diese Rezension zum Umgang mit Variation28 beziehen.
Ein Hauptproblem in GWAS ist die Rate der falsch positiven Ergebnisse, die hauptsächlich auf die Verknüpfung von kausalen und nicht-kausalen Stellen zurückzuführen sind48,49. Zweitens korrigieren die konservativen statistischen Korrekturansätze, z. B. Bonferroni und FDR, die Anzahl der unabhängigen Tests, die aufgrund der Verknüpfung zwischen benachbarten SNPs nicht gleich der Anzahl der untersuchten SNPs in GWAS ist50,51 Daher ist die tatsächliche Anzahl der unabhängigen Tests oft geringer. Eine andere Möglichkeit, den konservativen statistischen Schwellenwert zu reduzieren, wäre die Verringerung der Anzahl der getesteten SNPs, die für GWAS verwendet werden, basierend auf dem Linkage-Zerfall über definierte genomische Regionen52. Die in diesem Protokoll beschriebene GWAS-integrierte Hochdurchsatz-Metabolomik-Plattform bietet ein breites Anwendungsspektrum. Insbesondere wird es Verbesserungen in der Pflanzenzüchtung erleichtern, indem die Metaboliten-Lipid-Zusammensetzung für industriell und ernährungsphysiologisch gewünschte Werte verändert wird. Insgesamt hat die Metabolomik einen tiefen Einblick in die genetische Architektur einer Vielzahl von Metaboliten und die metabolische Diversifizierung gegeben, die während der Domestizierung von Pflanzen in den letzten Jahrzehnten aufgetreten sind, was auf das enorme Potenzial der Metabolomik-assoziierten Züchtung hinweist53. Die molekularbiologischen Ansätze für die nachgelagerte QTL-Validierung umfassen die Generierung von CRISPR/Cas9-Mutantenlinien54, T-DNA-Insertionslinien 55, stabilen und/oder transienten Überexpressionslinien 56, VIGS, Ex-vivo-Metabolomik-Ansätzen 57 neben dem konventionellen Ansatz zur Generierung von Cross-F2-Populationen sowie Kreuzvalidierung in verschiedenen Populationen.
Durch die Durchführung der notwendigen Korrektur für die analytischen Variationen wie oben beschrieben, können neben GWAS mehrere integrierte Ansätze durchgeführt werden, wie z.B. Metabolit-Metabolit-, Metabolit-Lipid-Korrelationsanalyse, Korrelationsanalyse zu phänomischen Daten, um Licht auf komplexere Merkmale zu werfen, und/oder Co-Expressionsanalyse, um die Grundlage biologischer Systeme weiter zu entschlüsseln58.

Groß angelegte "Omics"-Ansätze haben die Analyse komplexer biologischer Systeme 1,2,3 und ein besseres Verständnis der Verbindung zwischen Genotypen und den resultierenden Phänotypen 4 ermöglicht. Die Metabolomik mit ultrahochleistungsfähiger Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (UHPLC-MS) und GC-MS ermöglichte den Nachweis einer Vielzahl von Metabolitenmerkmalen, von denen nur einige bis zu einem gewissen Grad annotiert sind, was zu einem hohen Anteil unbekannter Metaboliten führte. Komplexe Wechselwirkungen können untersucht werden, indem großflächige Metabolomik mit der zugrunde liegenden genotypischen Variation einer vielfältigen Populationkombiniert wird 5. Die Handhabung großer Probensätze ist jedoch inhärent mit analytischen Variationen verbunden, was die Bewertung der metabolischen Varianz für weitere nachgelagerte Prozesse verzerrt. Insbesondere basieren die Hauptprobleme, die zu analytischen Variationen führen, auf der Maschinenleistung und der instrumentellen Drift im Laufe der Zeit6. Die Integration von Batch-to-Batch-Variationen ist eine Herausforderung und besonders problematisch bei der Analyse großflächiger strukturierter Pflanzenpopulationen. Es wurden mehrere Normalisierungsverfahren vorgeschlagen, um nicht-biologische Variationen zu korrigieren, z. B. die Verwendung interner, externer und isotopenmarkierter interner Standards, um analytische Fehler zu korrigieren, von denen jeder von Natur aus mit bekannten Problemen und Fallstricken verbunden ist 7,8,9,10.
Neben der analytischen Variation variiert die Wahl der Extraktionsprotokolle im Allgemeinen je nach Analysemethode. Letztendlich ist es wünschenswert, die Material- und Arbeitskosten sowie die Notwendigkeit, mehrere Aliquots derselben Probe für verschiedene analytische Prozesse zu verwenden, durch die Durchführung von phasentrennungsbasierten Extraktionsmethoden zu reduzieren. Diese Methoden wurden zuerst unter Verwendung von Chloroform eingeführt: Methanol / Wasserlösungsmittel zur Fraktionierung polarer und hydrophober Verbindungen11.
Dieses Protokoll beschreibt eine schnelle Hochdurchsatzpipeline für eine Multi-Omics-Plattform, um sowohl polare Metaboliten als auch Lipide in Hülsenfrüchten zu profilieren. Darüber hinaus wird gezeigt, wie diese Datensätze für analytische Variationen angemessen korrigiert und normalisiert werden können, bevor genotypische Informationen integriert werden, um quantitative Merkmalsloci (QTL) von Metaboliten durch die Durchführung von GWAS zu erkennen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (17:0 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850360P</td>
			<td>Internal standard for lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>FAME solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovitexin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>38953-85-4</td>
			<td>Internal standard for metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lignoceric Acid Methylester</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2442-49-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13684102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyamin -hydrochlorid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>593-56-6</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl laurate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-82-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl myristate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>124-10-7</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl palmitate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-39-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl stearate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-61-8</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl tert-butyl ether (MTBE)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13890602</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-caprat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>110-42-9</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcaprylat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-11-5</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyldocosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>929-77-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyleicosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1120-28-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-hexacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5802-82-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-octacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>55682-92-3</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-pelargonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1731-84-6</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamid (MSTFA)</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>24589-78-4</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>110-86-1</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribitol</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>22566-17-2</td>
			<td>Internal standard for derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triacontanoic Acid Methyl Ester</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>629-83-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>23214102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius Corporation</td>
			<td>14 557 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-35ms, 30 m, 0,25 mm, 0,25 &#181;m</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>123-3832</td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC-MS system</td>
			<td>Leco Pegasus HT TOF-MS (LECO Corporation)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding Balls, Stainless Steel</td>
			<td>OPS DIAGNOSTICS</td>
			<td>GBSS 196-2500-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Q Exactive Focus (Q Exactive&#8482; Focus Hybrid Quadrupol-Orbitrap&#8482; 
			Massenspektrometer, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf, model 5427R</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.7 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002878</td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RP High Strength Silica (HSS) T3 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.8 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003539</td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf Thermomixer 5436</td>
			<td>2050-100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>USC 300 TH</td>
			<td>142-0084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinding mixer mill</td>
			<td>Retsch, Mixer Mill MM 300</td>
			<td>20.746.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC system</td>
			<td>Waters Acquity UPLC system (Waters)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators</td>
			<td>7.008.500.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Vortex-Genie 2, Model G560</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetAlign</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MzMine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;data.table&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;fujiplot&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pleiotrpoic map</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;genetics&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;Ime4&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BLUPs calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;LDheatmap&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>LD plots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;MASS&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;rMVP&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GWAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 4.0.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS Genedata</td>
			<td>Expressionist</td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>OPTON-30965</td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization

Sowohl die Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) als auch die Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) sind weit verbreitete Metabolomik-Ansätze zum Nachweis und zur Quantifizierung von Hunderttausenden von Metabolitenmerkmalen. Die Anwendung dieser Techniken auf eine große Anzahl von Proben unterliegt jedoch komplexeren Wechselwirkungen, insbesondere bei genomweiten Assoziationsstudien (GWAS). Dieses Protokoll beschreibt einen optimierten Stoffwechselablauf, der eine effiziente und schnelle Probenvorbereitung mit der Analyse einer großen Anzahl von Proben für Hülsenfrüchtearten kombiniert. Diese leicht modifizierte Extraktionsmethode wurde ursprünglich für die Analyse von pflanzlichen und tierischen Geweben entwickelt und basiert auf der Extraktion in Methyl-tert-butylether: Methanollösungsmittel, um den Einfang von polaren und Lipidmetaboliten zu ermöglichen. Darüber hinaus bieten wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Reduzierung analytischer Variationen, die für die Hochdurchsatzbewertung der metabolischen Varianz in GWAS unerlässlich sind.

Erfolgreiche Metabolomics-GWAS-Experimente sollten mit einem geeigneten experimentellen Design beginnen, gefolgt von der Probenentnahme, -extraktion, -datenerfassung und -verarbeitung, wie in Abbildung 1 dargestellt. In diesem Protokoll wurde die MTBE-Methode15 verwendet, um Hunderte von Metaboliten zu extrahieren und zu analysieren, die zu mehreren Verbindungsklassen gehören. Die Chromatographie hängt stark von den Eigenschaften der verwendeten Säule sowie von Elutionspuffermischungen ab. Abbildung 2 zeigt Chromatogramme von QC-Proben und zeigt das Elutionsmuster einiger wichtiger Lipidklassen in diesem analytischen System. Die für jede Plattform angewandten Farbverläufe sind in Tabelle 1 aufgeführt. Großer Wert wurde auf den Umgang mit systemischen Fehlern in Großexperimenten gelegt. Die Durchführung von großflächigen Metabolomics ist inhärent mit systemischen Fehlern verbunden. Zur Demonstration analysierten wir lipidomische Daten über mehrere häufige Bohnenarten. Die ergänzende Tabelle 1 enthält die extrahierten lipidomischen Rohdaten, die nach der Chromatogrammverarbeitung mit der in der Materialtabelle angegebenen Software erhalten wurden. Die Befolgung dieses Protokolls ermöglichte es uns, wichtige Probleme im Umgang mit Omics-Daten zu umgehen, insbesondere bei der Verarbeitung großer Stichprobensätze. Das Normalisierungsverfahren führt zu einer genauen Korrektur von chargenweisen Analysefehlern, wie in Abbildung 3 dargestellt. Obwohl eine Erhöhung der Anzahl der QC-Proben die Stärke der Normalisierung erhöhen würde, ist dies aufgrund von Kosten- und Zeitbeschränkungen nicht immer möglich. Für Hochdurchsatz-Metabolomik-GWAS mit nicht zielgerichteten metabolischen Merkmalen ist es wichtig, eine höhere Anzahl von Merkmals-Marker-Assoziationen angemessen darzustellen. Eine pleiotrope Karte38, die mehrere GWAS-Ergebnisse kombiniert, könnte verwendet werden, um die genomischen Regionen hervorzuheben, mit denen mehrere Merkmale verknüpft sind (Abbildung 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig01.jpg"> Abbildung 1: Flussdiagramm des metabolomics-basierten GWAS in Pflanzen. Mehrere Schritte vom Versuchsaufbau bis zum Nachweis von QTL sind im linken Bereich dargestellt. Im rechten Bereich werden mehrere Zahlen angezeigt, um mehrere Schritte zu unterstützen, die im linken Bereich erwähnt werden. Ausgehend von rechts oben wird (1) eine vorgeschlagene Sequenz von Stichproben für LC-MS, (2) vor- und nachnormalisierte Score-Diagramme von PCA, einschließlich einer repräsentativen Merkmalsverteilung vor und nach der Verarbeitung, mit roter Angabe der QC-Probenintensitäten, und (3) ein Manhattan-Diagramm mit signifikanten Assoziationen, zu denen LD- und Haplotyp-Verteilungen generiert wurden, angezeigt. Abkürzungen: GWAS = genomweite Assoziationsstudien; QTL = quantitative Trait Loci; PCA = Hauptkomponentenanalyse; QC = Qualitätskontrolle; LD = Verknüpfungsungleichgewicht; MS = Massenspektrometrie; LC-MS = Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie; GC-MS = Gaschromatographie-Massenspektrometrie; LOESS = lokal geschätzte Streudiagrammglättung; MLM/MLMM = gemischtes lineares Modell/Multi-Locus-Mischmodell. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig02.jpg"> Abbildung 2: Chromatogrammverarbeitung. Zwei QC-Chromatogramme (Base Peak; Lipiddaten) aus verschiedenen Chargen zeigen die chargenweise Variation für bestimmte Lipidklassen in den gepoolten QC-Proben. Vier Hauptlipidklassen sind mit ihren jeweiligen Elutionsfenstern im hauseigenen LC-MS-System angegeben. Die Chromatogramme wurden aus MzMine21 exportiert. Abkürzungen: QC = Qualitätskontrolle; LC-MS = Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig03.jpg"> Abbildung 3: Korrektur des systematischen Fehlers. Hauptkomponentenanalyse der erfassten lipidomischen Daten, Pre- (links, Rohdaten) und Nachkorrektur für systemische Fehler (rechts, Batch-Löss). Die unteren Panels veranschaulichen die Feature-Verteilung (Cluster_00005) über die Proben (n=650) und Chargen (n=10) vor (links) und nach (rechts) Korrektur für analytische Variationen. Abkürzungen: PCA = Principal Component Analysis; QC = Qualitätskontrolle; LOESS = lokal geschätzte Streudiagrammglättung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig04.jpg"> Abbildung 4: Pleiotrope Karte, die die kombinierten GWAS-Ergebnisse veranschaulicht. Die pleiotrope Karte hebt Regionen im gesamten Genom hervor, die mit mehreren Merkmalen assoziiert sind. Die Zahlen auf den äußeren Ringen zeigen die entsprechenden Chromosomen an. Jeder Kreis repräsentiert ein individuelles Merkmal mit seinen signifikant assoziierten SNPs. Die Farben repräsentieren verschiedene zusammengesetzte Klassen (grau = zusammengesetzte Klasse 1; grün = zusammengesetzte Klasse 2; lila = zusammengesetzte Klasse 3; gelb = zusammengesetzte Klasse 4). Im Falle von Inter-Compound-Klassenassoziationen mit derselben genomischen Region werden Gene hervorgehoben. Der innere graue Kreis zeigt die Summe aller signifikanten SNPs, die mit einer bestimmten genomischen Position assoziiert sind. Die in dieser Abbildung gezeigten Assoziationen werden nur zur Veranschaulichung künstlich erzeugt. Abkürzungen: GWAS = genomweite Assoziationsstudien; SNPs = Einzelnukleotid-Polymorphismen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="5">UHPLC-MS-Einstellungen für Lipide</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zeit [min]</td>
			<td>Elutionsmittel A bis B [%]*</td>
			<td colspan="3">Information</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>45% A</td>
			<td colspan="3">Elutionsmittel A: 1% 1M NH4-Acetat, 0,1% Essigsäure in Wasser (UHPLC-Qualität)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 4.00</td>
			<td>lg 45% - 25% A</td>
			<td colspan="3">Elutionsmittel B: 1% 1M NH4-Acetat, 0,1% Essigsäure in Acetonitril/2-Propanol 7:3 (UHPLC-Qualität)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4.00 - 12.00</td>
			<td>lg 25% - 11% A</td>
			<td colspan="3">
Durchflussmenge: 400 μL/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>12.00 - 15.00</td>
			<td>lg 11% - 0% A</td>
			<td colspan="3">
Injektionsvolumen: 2 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 19.50</td>
			<td>cw 0% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.50-19.51</td>
			<td>0% - 45% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.51-24.00</td>
			<td>EQ 45%</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">UHPLC-MS/MS-Einstellungen für polare und semipolare Metaboliten</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zeit [min]</td>
			<td>Elutionsmittel A und B [%]*</td>
			<td colspan="3">Information</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>99% A</td>
			<td colspan="3">Elutionsmittel A: 0,1% Ameisensäure in Wasser (UHPLC-Qualität)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 11.00</td>
			<td>lg 99% -60% A</td>
			<td colspan="3">Elutionsmittel B: 0,1% Ameisensäure in Acetonitril (UHPLC-Qualität)</td>
		</tr>
<tr>
<td>11.00 - 13.00</td>
			<td>lg 60% - 30% A</td>
			<td colspan="3">
Durchflussmenge: 400 μL/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>13.00 - 15.00</td>
			<td>lg 30% - 1% A</td>
			<td colspan="3">
Injektionsvolumen: 3 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 16.00</td>
			<td>cw 1% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>16.00 - 17.00</td>
			<td>lg 1% - 99% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>17.00 - 20.00</td>
			<td>EQ 99% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">GC-MS-Einstellungen für derivatisierte Metaboliten</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zeit [min]</td>
			<td>Temperatur [°C]</td>
			<td colspan="3">Information</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 2.00</td>
			<td>85</td>
			<td colspan="3">
Trägergas: Helium</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.00 - 18.66</td>
			<td>LG 80 - 330</td>
			<td colspan="3">
Durchflussmenge: 2 ml/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>18.66 - 24.66</td>
			<td>CW 330</td>
			<td colspan="3">
Temperaturgradient: 15 °C/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>24.66</td>
			<td>schnelle Abkühlung</td>
			<td colspan="3">
Injektionsvolumen: 1 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Gradienteneinstellungen für jede der Analyseplattformen7. Abkürzungen: lg = linearer Gradient; cw = Säulenwaschung; eq = Gleichgewicht; UHPLC-MS = Ultra-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie; UHPLC-MS/MS = Ultrahochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie; GC-MS = Gaschromatographie-Massenspektrometrie. * = Prozentwert entspricht Elutionsmittel A; Der verbleibende Prozentwert entspricht dem Elucent B.
Ergänzende Tabelle 1: Rohe Lipidomik-Daten. Gibt die Spitzenintensitäten für jeden der erkannten Cluster über jede Stichprobe an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/Supplementary%20Table%201%20.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

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Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

In diesem Protokoll stellen wir einen optimierten Workflow vor, der eine effiziente und schnelle Probenvorbereitung vieler Proben kombiniert. Darüber hinaus bieten wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Reduzierung analytischer Variationen für die Hochdurchsatzbewertung metabolischer GWAS-Studien.

Large-scale Multi-omics Genome-wide Association Studies (Mo-GWAS): Richtlinien für die Probenvorbereitung und Normalisierung

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

Die Untersuchung größerer Populationen kommt mit einer maschinengesteuerten Variation, die dadurch die tatsächliche Variation aus der natürlichen Vielfalt stammt. Hier demonstrieren wir eine Methode, um die technischen Variationen für die nachgelagerte Integrationsanalyse zu reduzieren. Zu den Vorteilen dieser Technik gehört eine auf Gesichtstrennung basierende Extraktion, die die Analyse verschiedener Metaboliten auf der jeweiligen analytischen Plattform ermöglicht, während der systemische Fehler beseitigt und die biologische Varianz erhalten bleibt.Sobald die genotypischen und phänotypischen Informationen erhalten sind, kann diese Methode auf jede vielfältige natürliche Bevölkerung in jedem Reich des Lebens angewendet werden. Um mit der Entnahme von 20-Milliliter-Ernterohren zu beginnen, fügen Sie zwei Metallperlen mit einem Durchmesser von acht Millimetern zum Homogenisieren hinzu und beschriften Sie die Rohre. Füllen Sie dann einen Dewar mit flüssigem Stickstoff auf, unmittelbar nach dem Schneiden von frischen Blatt- und Wurzelgewebeproben in flüssigem Stickstoff durch Einfrieren von Flammen.Lagern Sie die entnommenen biologischen Proben bei 80 Grad Celsius zur Weiterverarbeitung. Die Röhrchenhalter mit flüssigem Stickstoff vorkühlen. Als nächstes mahlen Sie das Gewebe bei 25 Hertz für eine Minute, um ein homogenes Pulver zu erhalten.Wiederholen Sie das Einfrieren und Mahlen, wenn das Gewebe nicht homogen gemahlen ist. Wiegen Sie 50 Milligramm frisches Pflanzenmaterial in einem vorgekühlten, etikettierten, zwei Millimeter sicheren Mikrozentrifugenröhrchen, um sicherzustellen, dass das Pflanzenmaterial während des Wiegevorgangs gefroren bleibt. Fügen Sie einen Milliliter vorgekühlte Extraktionsmischung 1 bis 50 Milligramm Aliquot der Probe hinzu und wirbeln Sie das Röhrchen kurz auf, bevor Sie es auf Eis halten.Inkubieren Sie die Proben auf einem Orbitalschüttler bei 800 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, gefolgt von einer Beschallung in einem eisgekühlten Beschallungsbad für 10 Minuten. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um den Proben auch 500 Mikroliter Extraktionsmischung hinzuzufügen und mischen Sie die Extrakte durch kurzes Vortexen, dann zentrifugieren Sie die Mischung bei 11.200 mal G für 5 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation werden 500 Mikroliter der abgetrennten oberen lipidhaltigen Phase in ein vormarkiertes 1,5-Milliliter-Safe-Lock-Mikrozentrifugenröhrchen überführt, wobei der Rest der oberen Phase entfernt wird.In separaten, 1,5-Milliliter-Safe-Lock-Mikrozentrifugenröhrchen übertragen 150 Mikroliter der unteren semipolaren Phase vier GCMS und 300 Mikroliter der semipolaren Phase vier U-H-P-L-C MS-Analyse. Verwenden Sie einen Vakuumkonzentrator für die Lösungsmittelverdampfung, um alle extrahierten Fraktionen ohne Erwärmung zu konzentrieren und die getrockneten Fraktionen bei 20 Grad Celsius zu lagern. Um die Probe für die ultrahohe Leistung vorzubereiten, suspendieren Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie oder H-P-L-C MS die getrockneten semipolaren Fraktionen in 180 Mikrolitern einer Mischung aus Methanol und Wasser erneut.Dann beschallen Sie die semipolare Phase für 2 Minuten, gefolgt von einer Zentrifugation bei 11.200 mal G für eine Minute. Nach der Zentrifugation 90 Mikroliter des Überstands in eine Glasdurchstechflasche geben und zwei Mikroliter der Extrakte in die gegossene LCMS-Probe injizieren. Führen Sie die Metabolitfraktionierung an einer umgekehrten Phase-C18-Säule durch, die bei 40 Grad Celsius gehalten wird, und einem Durchfluss von 400 Mikrolitern pro Minute mit allmählichen Änderungen der Abwässer A und B, erfassen Sie die Massenspektren der Testblind- und Qualitätskontrollproben im negativen Ionisationsmodus mit einem Massenbereich von 102 1500 Massen-zu-Ladungs-Verhältnis.Führen Sie für die Proben der semipolaren Metaboliten eine gepoolte QC-Probe in der datenabhängigen Tandemmassenspektrometrie im negativen und positiven Ionisationsmodus durch. Verwenden Sie die erhaltenen Massenspektren für die Annotation. Führen Sie die Normalisierung des Datensatzes durch, indem Sie die Verteilung des internen Standards überprüfen.Normalisieren Sie die Daten, indem Sie das Signal einzelner oder mehrerer interner Standards korrigieren. Als nächstes korrigieren Sie die aus dem Chromatogramm erhaltenen Spitzenintensitäten über das genaue Probengewicht. Um die Intensitätsdrift über Multi-Batch-Serien zu korrigieren, führen Sie QC-basierte Korrekturmethoden wie lokal geschätzte Streudiagrammglättung mit R durch.Bevor Sie genomweite Assoziationsstudien oder GWAS durchführen, filtern Sie die genotypischen Daten auf kleinere Allelfrequenzen von weniger als 5% und eine fehlende Rate von mehr als 10% mit einer Quaste.Dadurch werden niederfrequente Verzerrungen vermieden. Um die Verzerrung zu eliminieren, die sich aus den Umweltfaktoren ergibt, verwenden Sie das R-Paket LME vier und berechnen Sie die besten linearen, unverzerrten Vorhersagen oder Blopps für jedes normalisierte Merkmal über die experimentellen Wiederholungen. Verwenden Sie Blips jedes Features einzeln, um GWAS mit dem rMVP-Paket in R durchzuführen.Die lipidomischen Daten über mehrere häufige Bohnenarten hinweg werden basierend auf den rohen Basis-Peak-Chromatogrammen von zwei QC-Proben aus verschiedenen Chargen gezeigt.Für bestimmte Lipidklassen wurde eine Variation der Signalintensitäten beobachtet. Der systemische Fehler wurde deutlicher, als die Hauptkomponentenanalyse an den Rohdaten durchgeführt wurde. Das Normalisierungsverfahren, einschließlich der lokal geschätzten Streudiagrammglättung, führte zum Clustering der QC-Stichproben.Beim Sezieren in die einzelnen Cluster wurden maschinengesteuerte Fehler in Batch sieben und acht vor der Normalisierung deutlich, die korrigiert wurde. Die postnormalisierten und transformierten individuellen metabolomischen Cluster wurden für GWAS verwendet, was zu mehreren Merkmalsmarkerassoziationen führte. In der repräsentativen Analyse werden verschiedene Verbindungsklassen in verschiedenen Farben hervorgehoben, während die Marker, die mehreren Verbindungsklassen zugeordnet sind, mit ihrem nächsten Gen angezeigt werden.Datennormalisierung und -transformation sind einer der wichtigsten Schritte. Stellen Sie sicher, dass eine ordnungsgemäße Korrektur durchgeführt wurde, um systemische Fehler zu korrigieren, und stellen Sie die Normalität der Verteilung sicher. Durch die Korrektur der analytischen Variation können mehrere Integrationsansätze durchgeführt werden, wie z.B. die metabolische Korrelationsanalyse und die Integration in phänomische Daten, um komplexe Merkmale zu beleuchten.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Forschung

Biochemie

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genomweite Quantifizierung der Übersetzung in der angehenden Hefe durch Ribosom Profilierung

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Platte-basierte Large-Scale Anbau von Caenorhabditis Elegans: Probenvorbereitung für die Studie von Stoffwechselveränderungen bei Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Probenvorbereitung für Probe Elektrospray-Ionen-Massenspektrometrie

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Etikettenfreier Immunpräzipitations-Massenspektrometrie-Workflow für großangelegtes Nuklear-Interactome-Profiling

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT-Beispielvorbereitung für proteomics Facility Submission und nachfolgende Datenanalyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Eine Probenvorbereitungspipeline für Mikrokristalle an der VMXm-Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Vorbereitung von Hochtemperatur-Probengittern für Kryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Probenvorbereitung und relative Quantifizierung mittels reduktiver Methylierung von Aminen für Peptidomik-Studien

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Probenvorbereitung mit einer Lipid-Monolayer-Methode für elektronenkristallographische Untersuchungen

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...