Name: large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization
Uploaded: 2021-07-27T15:00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization at JoVE.com

M.B. נתמך על ידי IMPRS-PMPG 'חילוף חומרים ראשוני וגידול צמחים'. A.R.F. ו- S.A. מכירים בתמיכה הכספית של תוכנית המחקר והחדשנות של האיחוד האירופי Horizon 2020, פרויקט PlantaSYST (מס ' SGA-CSA מס '739582 תחת FPA מס ' 664620), ופרויקט הגדלת (GA 862862).

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

הן GC-MS והן LC-MS הם כלים הנמצאים בשימוש נרחב ליצירת פרופילים של תערובות מורכבות של מחלקות מטבוליט שונות. טיפול במערכי נתונים גדולים באמצעות כלים אלה קשור מטבעו לווריאציה לא ביולוגית, למשל, שונות אנליטית, אשר מפריעה ומוטה את הפרשנות של התוצאות. פרוטוקול זה מציג צינור מיצוי חזק ותפוקה גבוהה ליצירת פרופיל מטבולי מקיף כדי למנוע וריאציות של מקור לא ביולוגי ולערוך מחקרי "אומיקה" בקנה מידה גדול. הנפחים והריכוזים המשמשים בפרוטוקול זה הותאמו למיני קטניות ברקמות שונות. עם זאת, ניתן לשנות מעט פרמטרים אלה ולהשתמש בהם גם לדגימות מטבוליות בקנה מידה גדול ממיני צמחים אחרים.
ניתן להשתמש ב-15 המיצויים המבוססים על MTBE שתוארו קודם לכן כדי לנתח מטבוליטים נגזרים, מטבוליטים קוטביים למחצה וליפידים. ניתן להרחיב זאת עבור מיצויי חלבונים והורמונים צמחיים39, שהיו מחוץ לתחום פרוטוקול זה. פרוטוקולי מיצוי אחרים מסתמכים על תערובות דיכלורומתאן:אתנול40,41. מבין פרוטוקולי המיצוי הללו, פרוטוקול מיצוי MTBE:methanol מספק חלופה חיובית ופחות מסוכנת לפרוטוקולי המיצוי הקיימים המבוססים על כלורופורם42 ואינו גורם לכדור חלבון כאינטרפאזה בין שלב הקוטב לשלב השומנים. יתר על כן, שיטות MTBE כבר שימשו במספר מחקרים עבור דגימות ביולוגיות שונות 43,44,45.
פרוטוקול זה דן במספר שלבים חיוניים שעשויים להוביל לשונות פוטנציאלית תוך כדי טיפול במספר רב של דגימות, למשל, במהלךקצירת 12,13, מיצוי14, כמו גם אקראיות46. יתר על כן, ישנם נושאים נוספים שלא נדונו בפרוטוקול זה שיש לקחת בחשבון כדי להבטיח נתונים מטבוליים באיכות גבוהה, למשל, אפקט מטריצה ודיכוי יונים14.
העוצמה של שיטות נורמליזציה מבוססות QC תלויה מטבעה במספר דגימות QC בכל אצווה. כפי שצוין קודם לכן, למרות שהגדלת המספר תגדיל את ההספק, השונות התוך-אצווה של ה-QCs היא שולית יחסית בהשוואה לשונות בין-אצווה במערכות אנליטיות אלה, כפי שמודגם באיור 3. בסך הכל, ישנן שיטות נורמליזציה אחרות המבוססות על QC, כגון הסרת שגיאות מערכתית באמצעות יער אקראי (SERRF), אשר הוכחו כבעלות ביצועים טובים יותר מרוב שיטות הנורמליזציה האחרות כגון יחס מבחינת אצווה, נורמליזציה באמצעות בחירה אופטימלית של תקנים פנימיים מרובים (NOMIS), ונורמליזציה של מניין הסתברותי (PQN)47 . עם זאת, SERRF מסתמך על מספר דגימות QC בכל אצווה, למשל, כל דגימה עשירית, דבר שאינו אפשרי בעת טיפול במספר רב של דגימות. היתרון העיקרי של נורמליזציה מבוססת QC על פני שיטות מבוססות נתונים או מבוססות תקן פנימיות אחרות הוא שהיא שומרת על השונות הביולוגית החיונית תוך התאמה לשונות טכנית לא רצויה28. הקוראים יכולים להתייחס לסקירה זו על הטיפול בווריאציה28.
אחת הבעיות העיקריות ב-GWAS היא שיעור התוצאות החיוביות הכוזבות, שמקורן בעיקר בשל קישור של אתרים סיבתיים ולא סיבתיים 48,49. שנית, גישות התיקון הסטטיסטי השמרניות, למשל, Bonferroni ו- FDR, נכונות למספר הבדיקות הבלתי תלויות, שאינו שווה למספר ה- SNPs שנבדקו ב- GWAS בשל הקישור בין SNPs קרובים50,51 לכן, המספר בפועל של בדיקות עצמאיות הוא לעתים קרובות נמוך יותר. דרך נוספת להפחית את הסף הסטטיסטי השמרני תהיה להפחית את מספר ה-SNPs שנבדקו המשמשים ל-GWAS בהתבסס על דעיכת קישור על פני אזורים גנומיים מוגדרים52. לפלטפורמת המטבולומיקה המשולבת בתפוקה גבוהה של GWAS המתוארת בפרוטוקול זה יש מגוון רחב של יישומים. בפרט, זה יקל על שיפורים בגידול יבולים על ידי שינוי הרכב המטבוליט/שומנים לרמות הרצויות מבחינה תעשייתית ותזונתית. באופן כללי, המטבולומיקה סיפקה תובנה מעמיקה לגבי הארכיטקטורה הגנטית של שפע של מטבוליטים וגיוון מטבולי שהתרחשו במהלך ביות היבולים בעשורים האחרונים, מה שמצביע על הפוטנציאל העצום של רבייה הקשורה למטבולומיקה53. הגישות הביולוגיות המולקולריות לאימות QTL במורד הזרם כוללות יצירת קווים מוטנטיים של CRISPR/Cas954, קווי החדרת T-DNA55, קווי ביטוי יתר יציבים ו/או ארעיים56, VIGS, מטבוליזם ex vivo מתקרב57 לצד הגישה המקובלת ביצירת אוכלוסיות F2 צולבות וכן אימות צולב באוכלוסיות שונות.
על ידי ביצוע התיקון הדרוש עבור הווריאציות האנליטיות כפי שתוארו לעיל, ניתן לבצע מספר גישות משולבות בנוסף ל- GWAS, כגון מטבוליט-מטבוליט, ניתוח מתאם מטבוליט-ליפידים, ניתוח מתאם לנתונים פנומיים כדי לשפוך אור על תכונות מורכבות יותר, ו / או ניתוח ביטויים משותפים כדי לפענח עוד יותר את הבסיס של מערכות ביולוגיות58.

גישות "אומיקה" בקנה מידה גדול אפשרו ניתוח של מערכות ביולוגיות מורכבות 1,2,3 והבנה נוספת של הקשר בין גנוטיפים לבין הפנוטיפים שהתקבלו4. מטבוליקה באמצעות ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד (UHPLC-MS) ו- GC-MS אפשרה זיהוי של שפע של תכונות מטבוליט, שרק חלקן מבוארות במידה מסוימת, וכתוצאה מכך שיעור גבוה של מטבוליטים לא ידועים. ניתן לחקור אינטראקציות מורכבות על ידי שילוב של מטבוליקה בקנה מידה גדול עם השונות הגנוטיפית הבסיסית של אוכלוסייה מגוונת5. עם זאת, טיפול בערכות מדגמים גדולות קשור מטבעו לווריאציות אנליטיות, המעוותות את ההערכה של שונות מטבולית לתהליכים נוספים במורד הזרם. באופן ספציפי, בעיות מרכזיות המובילות לווריאציות אנליטיות מבוססות על ביצועי מכונה וסחף אינסטרומנטלי לאורך זמן6. השילוב של שונות בין אצווה לאצווה הוא מאתגר ובעייתי במיוחד כאשר מנתחים אוכלוסיות צמחים מובנות בקנה מידה גדול. הליכי נורמליזציה מרובים הוצעו כדי לתקן עבור וריאציות לא ביולוגיות, למשל, שימוש בתקנים פנימיים, חיצוניים ובעלי תווית איזוטופית כדי לתקן שגיאות אנליטיות, שכל אחת מהן קשורה מטבעה לבעיות ידועות ולמלכודות 7,8,9,10.
בנוסף לשונות אנליטית, הבחירה בפרוטוקולי חילוץ משתנה בדרך כלל בהתאם לשיטה האנליטית. בסופו של דבר, הוא רוצה להפחית את עלויות החומר והעבודה, כמו גם את הצורך להשתמש במספר aliquots של אותו מדגם עבור תהליכים אנליטיים שונים על ידי ביצוע שיטות מיצוי מבוססות הפרדת פאזה. שיטות אלה הוצגו לראשונה באמצעות כלורופורם: ממיסי מתנול/מים כדי לפצל תרכובות קוטביות והידרופוביות11.
פרוטוקול זה מתאר צינור מהיר בעל תפוקה גבוהה עבור פלטפורמה מרובת אומיקות כדי ליצור פרופיל הן של מטבוליטים קוטביים והן של שומנים במינים של קטניות. יתר על כן, הוא מראה כיצד ניתן לתקן את מערכי הנתונים הללו כראוי לשונות אנליטית ולנרמל אותם לפני שילוב מידע גנוטיפי כדי לזהות מוקדי תכונות כמותיות מטבוליטים (QTL) על ידי ביצוע GWAS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (17:0 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850360P</td>
			<td>Internal standard for lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>FAME solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovitexin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>38953-85-4</td>
			<td>Internal standard for metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lignoceric Acid Methylester</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2442-49-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13684102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyamin -hydrochlorid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>593-56-6</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl laurate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-82-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl myristate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>124-10-7</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl palmitate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-39-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl stearate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-61-8</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl tert-butyl ether (MTBE)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13890602</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-caprat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>110-42-9</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcaprylat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-11-5</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyldocosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>929-77-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyleicosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1120-28-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-hexacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5802-82-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-octacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>55682-92-3</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-pelargonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1731-84-6</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamid (MSTFA)</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>24589-78-4</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>110-86-1</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribitol</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>22566-17-2</td>
			<td>Internal standard for derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triacontanoic Acid Methyl Ester</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>629-83-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>23214102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius Corporation</td>
			<td>14 557 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-35ms, 30 m, 0,25 mm, 0,25 &#181;m</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>123-3832</td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC-MS system</td>
			<td>Leco Pegasus HT TOF-MS (LECO Corporation)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding Balls, Stainless Steel</td>
			<td>OPS DIAGNOSTICS</td>
			<td>GBSS 196-2500-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Q Exactive Focus (Q Exactive&#8482; Focus Hybrid Quadrupol-Orbitrap&#8482; 
			Massenspektrometer, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf, model 5427R</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.7 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002878</td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RP High Strength Silica (HSS) T3 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.8 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003539</td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf Thermomixer 5436</td>
			<td>2050-100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>USC 300 TH</td>
			<td>142-0084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinding mixer mill</td>
			<td>Retsch, Mixer Mill MM 300</td>
			<td>20.746.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC system</td>
			<td>Waters Acquity UPLC system (Waters)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators</td>
			<td>7.008.500.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Vortex-Genie 2, Model G560</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetAlign</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MzMine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;data.table&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;fujiplot&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pleiotrpoic map</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;genetics&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;Ime4&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BLUPs calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;LDheatmap&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>LD plots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;MASS&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;rMVP&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GWAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 4.0.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS Genedata</td>
			<td>Expressionist</td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>OPTON-30965</td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization

הן ספקטרומטריית כרומטומטריית מסה-כרומטוגרפיית גז (GC-MS) והן ספקטרומטריית מסה-כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS) הן גישות מטבוליות הנמצאות בשימוש נרחב כדי לזהות ולכמת מאות אלפי תכונות מטבוליט. עם זאת, היישום של טכניקות אלה על מספר רב של דגימות נתון לאינטראקציות מורכבות יותר, במיוחד עבור מחקרי אסוציאציה כלל-גנומיים (GWAS). פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה מטבולית אופטימלית, המשלבת הכנת דגימות יעילה ומהירה עם ניתוח של מספר רב של דגימות עבור מיני יבול קטניות. שיטת מיצוי שונה במקצת זו פותחה בתחילה לניתוח רקמות צמחים ובעלי חיים ומבוססת על מיצוי באתר מתיל טרט-בוטיל: ממס מתנול כדי לאפשר לכידה של מטבוליטים קוטביים ושומנים. בנוסף, אנו מספקים מדריך שלב אחר שלב להפחתת וריאציות אנליטיות, החיוניות להערכת התפוקה הגבוהה של שונות מטבולית ב- GWAS.

ניסויי GWAS מוצלחים במטבולומיקה צריכים להתחיל בתכנון ניסויי נכון, ולאחר מכן באיסוף דגימות, חילוץ, איסוף נתונים ועיבודם, כפי שמודגם באיור 1. בפרוטוקול זה, שיטת MTBE15 שימשה לחילוץ וניתוח של מאות מטבוליטים השייכים למספר מחלקות מורכבות. הכרומטוגרפיה תלויה מאוד בתכונות של העמודה המנוצלת, כמו גם בתערובות של מאגרי אלוטיון. איור 2 מראה כרומטוגרמות של דגימות QC, מה שמצביע על דפוס האלוטציה של כמה מחלקות ליפידים עיקריות במערכת אנליטית זו. מעברי הצבע החלים עבור כל פלטפורמה מופיעים בטבלה 1. דגש רב הושם על טיפול בטעויות מערכתיות בניסויים רחבי היקף. ביצוע מטבוליזם בקנה מידה גדול קשור מטבעו לשגיאות מערכתיות. לצורך הדגמה, ניתחנו נתונים ליפידומיים על פני כמה מיני שעועית נפוצים. טבלה משלימה 1 מספקת את הנתונים הליפידומיים הגולמיים שחולצו לאחר עיבוד הכרומטוגרמה באמצעות התוכנה המצוינת בטבלת החומרים. בעקבות פרוטוקול זה אפשרה לנו לעקוף בעיות מרכזיות בהתמודדות עם נתוני omics, במיוחד תוך טיפול בערכות דגימה גדולות. הליך הנורמליזציה מניב תיקון מדויק של שגיאות אנליטיות מבחינת אצווה, כפי שהודגם באיור 3. למרות שהגדלת מספר דגימות ה- QC תגדיל את עוצמת הנורמליזציה, זה לא תמיד אפשרי בשל אילוצי עלות וזמן. עבור מטבוליקה בתפוקה גבוהה GWAS עם תכונות מטבוליות לא ממוקדות, חיוני להמחיש מספר גבוה יותר של קשר בין סמן תכונות כראוי. מפה פליאוטרופית38 המשלבת תוצאות GWAS מרובות יכולה לשמש כדי להדגיש את האזורים הגנומיים שאליהם מקושרות מספר תכונות (איור 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig01.jpg"> איור 1: תרשים זרימה של GWAS מבוסס מטבוליקה בצמחים. מספר שלבים החל מתכנון הניסוי ועד לזיהוי QTL מוצגים בלוח השמאלי. בחלונית הימנית, מוצגים איורים מרובים התומכים במספר שלבים המוזכרים בחלונית השמאלית. החל מהחלק העליון הימני, (1) מוצג רצף מוצע של דגימות עבור LC-MS, (2) חלקות ניקוד לפני ואחרי מנורמל של PCA, כולל התפלגות תכונה מייצגת לפני ואחרי עיבוד, עם אדום המציין את עוצמות דגימת QC, ו-(3) מגרש במנהטן עם אסוציאציות משמעותיות שאליהן נוצרו התפלגויות LD והפלוטיפ. קיצורים: GWAS = מחקרי אסוציאציה כלל-גנומיים; QTL = תכונה כמותית loci; PCA = ניתוח רכיבים עיקריים; QC = בקרת איכות; LD = אי-שיווי משקל קישור; MS = ספקטרומטריית מסות; LC-MS = כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה; GC-MS = כרומטוגרפיית גז-ספקטרומטריית מסה; LOESS = החלקת פיזור משוערת מקומית; MLM/MLMM = מודל ליניארי מעורב/מודל מעורב מרובה לוקוסים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig02.jpg"> איור 2: עיבוד כרומטוגרמה. שתי כרומטוגרמות QC (שיא בסיס; נתוני שומנים) מאצוות שונות מדגימות את השונות מבחינת האצווה עבור מחלקות שומנים מסוימות בדגימות QC המאוגדות. ארבעה סוגי שומנים עיקריים מסומנים עם חלונות האלוטיון המתאימים שלהם במערכת LC-MS הפנימית. הכרומטוגרמות יוצאו מ-MzMine21. קיצורים: QC = בקרת איכות; LC-MS = כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig03.jpg"> איור 3: תיקון טעות שיטתית. ניתוח רכיבים עיקריים של נתונים ליפידומיים נרכשים, טרום- (שמאל, נתונים גולמיים) ולאחר תיקון עבור שגיאות מערכתיות (מימין, אצווה loess). הלוחות התחתונים ממחישים את התפלגות התכונה (Cluster_00005) על פני הדגימות (n=650) והאצוות (n=10) לפני התיקון (משמאל) ולאחר (ימין) לצורך וריאציה אנליטית. קיצורים: PCA = ניתוח רכיבים עיקריים; QC = בקרת איכות; LOESS = החלקת פיזור משוערת מקומית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig04.jpg"> איור 4: מפה פליאוטרופית הממחישה את התוצאות המשולבות של GWAS. המפה הפליאוטרופית מדגישה אזורים בגנום כולו הקשורים למספר תכונות. המספרים בטבעות החיצוניות מציינים את הכרומוזומים המתאימים. כל עיגול מייצג תכונה אינדיבידואלית עם ה- SNPs הקשורים אליה באופן משמעותי. הצבעים מייצגים מחלקות מורכבות שונות (אפור = מחלקה מורכבת 1; ירוק = מחלקה מורכבת 2; סגול = תרכובת מחלקה 3; צהוב = מחלקה מורכבת 4). במקרה של אסוציאציות בין-מורכבות עם אותו אזור גנומי, מודגשים גנים. העיגול האפור הפנימי מציג את סכום כל ה- SNPs המשמעותיים הקשורים למיקום גנומי מסוים. האסוציאציות המוצגות באיור זה נוצרות באופן מלאכותי רק להמחשה. קיצורים: GWAS = מחקרי אסוציאציה כלל-גנומיים; SNPs = פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="5">הגדרות UHPLC-MS עבור שומנים</td>
		</tr>
<tr>
<td>זמן [מינימום]</td>
			<td>Eluent A עד B [%]*</td>
			<td colspan="3">מידע</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>45% א</td>
			<td colspan="3">Eluent A: 1% 1M NH4-אצטט, 0.1% חומצה אצטית במים (ציון UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 4.00</td>
			<td>lg 45% - 25% A</td>
			<td colspan="3">Eluent B: 1% 1M NH4-אצטט, 0.1% חומצה אצטית באצטוניטריל/2-פרופנול 7:3 (ציון UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4.00 - 12.00</td>
			<td>lg 25% - 11% A</td>
			<td colspan="3">
קצב זרימה: 400 μL/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>12.00 - 15.00</td>
			<td>lg 11% - 0% A</td>
			<td colspan="3">
נפח הזרקה: 2 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 19.50</td>
			<td>cw 0% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.50-19.51</td>
			<td>0% - 45% א</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.51-24.00</td>
			<td>eq 45%</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">הגדרות UHPLC-MS/MS עבור מטבוליטים קוטביים וחצי-קוטביים</td>
		</tr>
<tr>
<td>זמן [מינימום]</td>
			<td>Eluent A ו-B [%]*</td>
			<td colspan="3">מידע</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>99% א</td>
			<td colspan="3">Eluent A: 0.1% חומצה פורמית במים (ציון UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 11.00</td>
			<td>lg 99% -60% A</td>
			<td colspan="3">Eluent B: 0.1% חומצה פורמית באצטוניטריל (ציון UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>11.00 - 13.00</td>
			<td>lg 60% - 30% A</td>
			<td colspan="3">
קצב זרימה: 400 μL/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>13.00 - 15.00</td>
			<td>lg 30% - 1% A</td>
			<td colspan="3">
נפח הזרקה: 3 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 16.00</td>
			<td>cw 1% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>16.00 - 17.00</td>
			<td>lg 1% - 99% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>17.00 - 20.00</td>
			<td>eq 99% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">הגדרות GC-MS עבור מטבוליטים נגזרים</td>
		</tr>
<tr>
<td>זמן [מינימום]</td>
			<td>טמפרטורה [°C]</td>
			<td colspan="3">מידע</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 2.00</td>
			<td>85</td>
			<td colspan="3">
גז מוביל: הליום</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.00 - 18.66</td>
			<td>lg 80 - 330</td>
			<td colspan="3">
קצב זרימה: 2 מ"ל לדקה</td>
		</tr>
<tr>
<td>18.66 - 24.66</td>
			<td>cw 330</td>
			<td colspan="3">
שיפוע טמפרטורה: 15 °C /min</td>
		</tr>
<tr>
<td>24.66</td>
			<td>קירור מהיר</td>
			<td colspan="3">
נפח הזרקה: 1 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: הגדרות מעבר צבע עבור כל אחת מהפלטפורמות האנליטיות7. קיצורים: lg = גרדיאנט ליניארי; cw = שטיפת עמודים; eq = שיווי משקל; UHPLC-MS = ספקטרומטריית כרומטוגרפיה נוזלית-מסה בעלת ביצועים גבוהים במיוחד; UHPLC-MS/MS = כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד- ספקטרומטריית מסה טנדם; GC-MS = כרומטוגרפיית גז-ספקטרומטריית מסה. * = ערך האחוז מתאים לאלוף A; ערך האחוז הנותר מתאים ל- B eluent.
טבלה משלימה 1: נתוני ליפידומיקה גולמית. מציין את עוצמות השיא עבור כל אחד מהאשכולות שזוהו מעל כל דגימה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/Supplementary%20Table%201%20.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization at JoVE.com

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

בפרוטוקול זה אנו מציגים זרימת עבודה ממוטבת, המשלבת הכנת דגימות יעילה ומהירה של דגימות רבות. בנוסף, אנו מספקים מדריך שלב אחר שלב להפחתת וריאציות אנליטיות להערכת תפוקה גבוהה של מחקרי GWAS מטבוליים.

מחקרי אסוציאציה רב-גנומית בקנה מידה גדול (Mo-GWAS): קווים מנחים להכנת דגימות ונורמליזציה

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

חקירת אוכלוסייה גדולה יותר מגיעה עם וריאציה מונחית מכונה, אשר על ידי כך הווריאציה בפועל שמקורה במגוון הטבעי. כאן אנו מדגימים שיטה להפחתת השונות הטכנית לניתוח אינטגרציה במורד הזרם. היתרונות של טכניקה זו כוללים מיצוי מבוסס הפרדת פנים, המספק ניתוח של מטבוליטים שונים על הפלטפורמה האנליטית המתאימה, תוך הסרת השגיאה המערכתית ושמירה על השונות הביולוגית.לאחר קבלת המידע הגנוטיפי והפנוטיפי, ניתן ליישם שיטה זו על כל אוכלוסייה טבעית מגוונת בכל ממלכת חיים. כדי להתחיל לקחת צינורות קציר של 20 מיליליטר, להוסיף שניים חמישה מילימטר, ושני חרוזי מתכת בקוטר שמונה מילימטר להומוגניזציה ולתייג את הצינורות. לאחר מכן, מלאו דיואר בחנקן נוזלי, מיד לאחר חיתוך דגימות עלים טריים של עלים ורקמות שורש בחנקן נוזלי על ידי הקפאת הבזק.אחסנו את הדגימות הביולוגיות שנקטפו בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס להמשך עיבוד. קירור מראש של מחזיקי הצינורות בחנקן נוזלי. לאחר מכן, לטחון את הרקמות ב 25 הרץ במשך דקה אחת כדי לקבל אבקה הומוגנית.חוזרים על הקפאה, וטחינה אם הרקמה אינה נטחנת באופן הומוגני. שקלו 50 מיליגרם של חומר צמחי טרי בצינורות מיקרו-צנטריפוג' עם תווית מקוררת מראש עם נעילה בטוחה לשני מילימטרים, המבטיחים שהחומר הצמחי יישאר קפוא במהלך תהליך השקילה. הוסיפו מיליליטר אחד של תערובת מיצוי מקוררת מראש 1 עד 50 מיליגרם אליקווט של הדגימה, וסובבו את הצינור לזמן קצר לפני שהם שומרים על קרח.דגירה של הדגימות על שייקר מסלולי ב-800 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן sonication באמבט סוניקציה מקורר קרח במשך 10 דקות. השתמשו בפיפטה רב-ערוצית כדי להוסיף 500 מיקרוליטרים של תערובת מיצוי גם לדגימות וערבבו את התמציות על ידי מערבולת קצרה, ואז צנטריפוגה בתערובת ב-11, 200 פעמים G למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, העברת 500 מיקרוליטרים של הפאזה המכילה שומנים עליונים מופרדים לצינור מיקרו-צנטריפוגה עם תווית מוקדמת של 1.5 מיליליטר, הוסרה שאר הפאזה העליונה.בנפרד, 1.5 מיליליטר בטוח נעילה צינורות microcentrifuge להעביר 150 microliters של פאזה חצי קוטבית תחתונה ארבעה GCMS ו 300 microliters של פאזה חצי קוטבית ארבעה U-H-P-L-C MS ניתוח. השתמשו ברכז ואקום לאידוי ממסים כדי לרכז את כל השברים המופקים ללא חימום ולאחסן את השברים המיובשים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. כדי להכין את הדגימה לביצועים גבוהים במיוחד, כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסות או H-P-L-C MS משעים מחדש את השברים הקוטביים למחצה המיובשים ב-180 מיקרוליטרים של תערובת של מתנול ומים.לאחר מכן צליל את הפאזה הקוטבית למחצה במשך 2 דקות, ואחריה צנטריפוגה ב 11, 200 פעמים G במשך דקה אחת. לאחר צנטריפוגה, מעבירים 90 מיקרוליטרים של הסופרנאטנט לבקבוקון זכוכית ומזריקים שני מיקרוליטרים של התמציות לתוך דגימת ה-LCMS שנמזגה. בצע את פיצול המטבוליטים בעמודת שלב C18 הפוכה המוחזקת ב-40 מעלות צלזיוס, וזרימה של 400 מיקרוליטרים לדקה עם שינויים הדרגתיים של שפכים A ו-B, רכשו את ספקטרום המסה של דגימות הבדיקה הריקות ובקרת האיכות במצב יינון שלילי עם טווח מסה של 102 1500 מסה ליחס מטען.עבור דגימות מטבוליטים קוטביים למחצה, הפעל דגימת QC מאוגדת בספקטרומטריית מסות טנדם תלוית נתונים במצבי יינון שליליים וחיוביים. השתמש בספקטרום המסה המתקבל עבור הביאור. בצע את הנורמליזציה של ערכת הנתונים על-ידי בדיקת התפלגות התקן הפנימי.נרמל את הנתונים על ידי תיקון האות של תקנים פנימיים בודדים או מרובים. לאחר מכן, תקן את עוצמות השיא המתקבלות מהכרומטוגרמה על פני משקל הדגימה המדויק. לתיקון סחף העוצמה על פני סדרות מרובות אצווה, בצע שיטות תיקון מבוססות QC כגון החלקת פיזור משוערת מקומית באמצעות R.לפני ביצוע מחקרי שיוך כלל-גנומיים או GWAS, סנן את הנתונים הגנוטיפיים עבור תדרי אלל קלים הנמוכים מ-5% ושיעור חסר של יותר מ-10% באמצעות ציצית.זה ימנע הטיה בתדר נמוך. כדי למנוע את ההטיה שמקורה בגורמים הסביבתיים, השתמש בחבילת R LME four וחשב את התחזיות או התחזיות הליניאריות והבלתי משוחדות הטובות ביותר עבור כל תכונה מנורמלת על פני החזרות הניסוייות. השתמש ב-blops של כל תכונה בנפרד כדי לבצע GWAS עם חבילת rMVP ב-R.הנתונים הליפידומיים על פני מספר מיני שעועית נפוצים מוצגים על סמך כרומטוגרמות שיא הבסיס הגולמיות של שתי דגימות QC מאצוות שונות.שינוי בעוצמות האות נצפתה בשיעורי ליפידים מסוימים. השגיאה המערכתית הייתה ברורה יותר כאשר ניתוח הרכיבים העיקריים בוצע על הנתונים הגולמיים. הליך הנורמליזציה, כולל החלקת הפיזור המוערכת באופן מקומי, הוביל להתקבצות של דגימות ה-QC.בעת ניתוח לאשכולות הבודדים, שגיאות מונחות מכונה באצווה 7 ו-8 התבררו לפני הנורמליזציה, שתוקנה. האשכולות המטבולומיים האינדיבידואליים המנורמלים והמשתנים שימשו עבור GWAS, והניבו מספר אסוציאציות של סמני תכונות. בניתוח הייצוגי, מחלקות תרכובות שונות מודגשות בצבעים שונים, בעוד שהסמנים הקשורים למחלקות מורכבות מרובות מסומנים עם הגן הקרוב ביותר שלו.נורמליזציה ושינוי צורה של נתונים הם אחד השלבים החשובים ביותר. ודא שבוצע תיקון תקין כדי לתקן שגיאה מערכתית ולהבטיח נורמליות בהתפלגות. על ידי ביצוע התיקון עבור השונות האנליטית, ניתן לבצע מספר גישות אינטגרציה, כגון ניתוח מתאם מטבולי ואינטגרציה בנתונים פנומיים כדי לשפוך אור על תכונות מורכבות.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

מבוסס על צלחת Large-scale טיפוח Caenorhabditis elegans: הכנת הדוגמא על המחקר של שינויים מטבוליים בחולי סוכרת

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

הכנה לדוגמא לתרסיס אלקטרונון מהמוני ספקטרומטר מונמטריה

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Immunoprecipitation ללא תווית של זרימת עבודה בהיקפים גדולים של החברה ליצירת פרופיל רב-ממדי של Interactome גרעינית

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

הכנה לדוגמא להגשת מתקנים פרוטאומניקס וניתוח נתונים שלאחר מכן

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

צינור הכנה לדוגמה עבור מיקרוקריסטלים בקו הקרן VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

הכנת רשתות דגימה בטמפרטורה גבוהה עבור Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

הכנה לדוגמה וכמות יחסית באמצעות מתילציה מופחתת של אמינים למחקרי פפטידומית

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

הכנה לדוגמה באמצעות שיטת חד שכבתית שומנים למחקרים קריסטלוגרפיים אלקטרונים

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...