Name: large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization
Uploaded: 2021-07-27T15:00:00
Duration: 8 min 27 s
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एमबी आईएमपीआरएस-पीएमपीजी 'प्राथमिक चयापचय और पौधे विकास' द्वारा समर्थित है। एआरएफ और एसए यूरोपीय संघ क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम, परियोजना प्लांटासिस्ट (एफपीए संख्या 664620 के तहत एसजीए-सीएसए नंबर 739582), और परियोजना वृद्धि (जीए 862862) की वित्तीय सहायता को स्वीकार करते हैं।

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

जीसी-एमएस और एलसी-एमएस दोनों विभिन्न मेटाबोलाइट वर्गों के जटिल मिश्रण की रूपरेखा तैयार करने के लिए व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले उपकरण हैं। इन उपकरणों के साथ बड़े डेटासेट को संभालना स्वाभाविक रूप से एक गैर-जैविक भिन्नता से जुड़ा हुआ है, उदाहरण के लिए, विश्लेषणात्मक भिन्नता, जो परिणामों की व्याख्या में हस्तक्षेप और पूर्वाग्रह करती है। यह प्रोटोकॉल गैर-जैविक मूल की भिन्नता को खत्म करने और बड़े पैमाने पर "ओमिक्स" अध्ययन करने के लिए व्यापक चयापचय प्रोफाइलिंग के लिए एक मजबूत और उच्च-थ्रूपुट निष्कर्षण पाइपलाइन प्रस्तुत करता है। इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त मात्रा और सांद्रता विभिन्न ऊतकों में फलियां प्रजातियों के लिए समायोजित किए गए थे। हालांकि, इन मापदंडों को थोड़ा संशोधित किया जा सकता है और अन्य पौधों की प्रजातियों से बड़े पैमाने पर चयापचय नमूनों के लिए भी उपयोग किया जा सकता है।
पहलेवर्णित 15 एमटीबीई-आधारित निष्कर्षण का उपयोग व्युत्पन्न चयापचयों, अर्ध-ध्रुवीय चयापचयों और लिपिड का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। यह प्रोटीन और संयंत्र हार्मोन निष्कर्षण39, जो इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर थे के लिए विस्तारित किया जा सकता है। अन्य निष्कर्षण प्रोटोकॉल डाइक्लोरोमेथेन पर भरोसा करते हैं: इथेनॉल मिश्रण40,41। इन निष्कर्षण प्रोटोकॉल में से, एमटीबीई: मेथनॉल निष्कर्षण प्रोटोकॉल मौजूदा क्लोरोफॉर्म-आधारित निष्कर्षण प्रोटोकॉल42 के लिए एक अनुकूल और कम खतरनाक विकल्प प्रदान करता है और ध्रुवीय और लिपिड चरणों के बीच एक इंटरफ़ेज़ के रूप में प्रोटीन गोली में परिणाम नहीं देता है। इसके अलावा, एमटीबीई विधियों का उपयोग पहले से ही विभिन्न जैविक नमूनों43,44,45 के लिए कई अध्ययनों में किया गया है।
यह प्रोटोकॉल कई महत्वपूर्ण चरणों पर चर्चा करता है जो बड़ी संख्या में नमूनों को संभालते समय संभावित भिन्नता का कारण बन सकते हैं, उदाहरण के लिए,कटाई 12,13, निष्कर्षण14, साथ ही यादृच्छिकीकरण46 के दौरान। इसके अलावा, ऐसे अतिरिक्त मुद्दे हैं जिन पर इस प्रोटोकॉल में चर्चा नहीं की गई है जिन्हें उच्च गुणवत्ता वाले चयापचय डेटा को सुनिश्चित करने के लिए विचार किया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए, मैट्रिक्स प्रभाव और आयन दमन14.
क्यूसी-आधारित सामान्यीकरण विधियों की शक्ति स्वाभाविक रूप से प्रत्येक बैच में क्यूसी नमूनों की संख्या पर निर्भर करती है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, हालांकि संख्या में वृद्धि से शक्ति में वृद्धि होगी, क्यूसी की इंट्रा-बैच भिन्नता इन विश्लेषणात्मक प्रणालियों में अंतर-बैच भिन्नता की तुलना में अपेक्षाकृत मामूली है, जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है। कुल मिलाकर, अन्य क्यूसी-आधारित सामान्यीकरण विधियां हैं, जैसे कि यादृच्छिक वन (एसईआरआरएफ) का उपयोग करके प्रणालीगत त्रुटि हटाने, जिन्हें बैच-वार-अनुपात, कई आंतरिक मानकों (एनओएमआईएस) के इष्टतम चयन का उपयोग करके सामान्यीकरण, और संभाव्य भागफल सामान्यीकरण (पीक्यूएन) 47 जैसे अधिकांश अन्य सामान्यीकरण विधियों को मात देने के लिए दिखाया गया है। . हालांकि, एसईआरआरएफ प्रत्येक बैच में कई क्यूसी नमूनों पर निर्भर करता है, उदाहरण के लिए, प्रत्येक दसवें नमूने, जो बड़ी संख्या में नमूनों को संभालते समय संभव नहीं है। अन्य डेटा-चालित या आंतरिक मानक-आधारित विधियों पर क्यूसी-आधारित सामान्यीकरण का मुख्य लाभ यह है कि यह अवांछित तकनीकी भिन्नता को समायोजित करते हुए आवश्यक जैविक भिन्नता को बरकरार रखताहै। पाठक भिन्नता28 की हैंडलिंग पर इस समीक्षा का उल्लेख कर सकते हैं।
जीडब्ल्यूएएस में एक मुख्य मुद्दा झूठी सकारात्मकता की दर है, जो ज्यादातर कारण और गैर-कारण साइटों48,49 के लिंकेज के कारण उत्पन्न होती है। दूसरा, रूढ़िवादी सांख्यिकीय सुधार दृष्टिकोण, उदाहरण के लिए, बोनफेरोनी और एफडीआर, स्वतंत्र परीक्षणों की संख्या के लिए सही है, जो समीपस्थ एसएनपी50,51 के बीच संबंध के कारण जीडब्ल्यूएएस में परख एसएनपी की संख्या के बराबर नहीं है इसलिए, स्वतंत्र परीक्षणों की वास्तविक संख्या अक्सर कम होती है। रूढ़िवादी सांख्यिकीय सीमा को कम करने का एक और तरीका परिभाषित जीनोमिक क्षेत्रों52 पर लिंकेज क्षय के आधार पर जीडब्ल्यूएएस के लिए उपयोग किए जाने वाले परीक्षण किए गए एसएनपी की संख्या को कम करना होगा। इस प्रोटोकॉल में वर्णित जीडब्ल्यूएएस-एकीकृत उच्च-थ्रूपुट मेटाबोलॉमिक्स प्लेटफॉर्म में अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला है। विशेष रूप से, यह औद्योगिक और पौष्टिक रूप से वांछित स्तरों के लिए मेटाबोलाइट / लिपिड संरचना को बदलकर फसल प्रजनन में सुधार की सुविधा प्रदान करेगा। कुल मिलाकर, चयापचय ने पिछले दशकों में फसल पालतू बनाने के दौरान हुए चयापचयों और चयापचय विविधीकरण की अधिकता की आनुवंशिक वास्तुकला में गहराई से अंतर्दृष्टि प्रदान की है, जो चयापचय से जुड़े प्रजनन53 की विशाल क्षमता को दर्शाता है। डाउनस्ट्रीम क्यूटीएल सत्यापन के लिए आणविक जैविक दृष्टिकोण में सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 उत्परिवर्ती लाइनों54, टी-डीएनए सम्मिलन लाइनों55, स्थिर और / या क्षणिक ओवरएक्सप्रेशन लाइनों56, वीआईजीएस, पूर्व विवो मेटाबोलॉमिक्स दृष्टिकोण57 की पीढ़ी शामिल है क्रॉस एफ 2 आबादी उत्पन्न करने के साथ-साथ विभिन्न आबादी में क्रॉस सत्यापन।
ऊपर वर्णित विश्लेषणात्मक विविधताओं के लिए आवश्यक सुधार करके, जीडब्ल्यूएएस के अलावा कई एकीकृत दृष्टिकोण किए जा सकतेहैं, जैसे कि मेटाबोलाइट-मेटाबोलाइट, मेटाबोलाइट-लिपिड सहसंबंध विश्लेषण, अधिक जटिल लक्षणों पर प्रकाश डालने के लिए फेनोमिक डेटा के लिए सहसंबंध विश्लेषण, और /

बड़े पैमाने पर "ओमिक्स" दृष्टिकोण ने जटिल जैविक प्रणालियों 1,2,3 के विश्लेषण और जीनोटाइप और परिणामस्वरूप फेनोटाइप4 के बीच लिंक की आगे की समझ को सक्षम किया है। अल्ट्रा-हाई-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (यूएचपीएलसी-एमएस) और जीसी-एमएस का उपयोग करके मेटाबोलॉमिक्स ने मेटाबोलाइट सुविधाओं की अधिकता का पता लगाने में सक्षम बनाया, जिनमें से केवल कुछ को एक निश्चित डिग्री तक एनोटेट किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप अज्ञात चयापचयों का उच्च अनुपात होता है। एक विविध आबादी के अंतर्निहित जीनोटाइपिक भिन्नता के साथ बड़े पैमाने पर चयापचयों के संयोजन से जटिल इंटरैक्शन का पता लगाया जा सकताहै 5. हालांकि, बड़े नमूना सेटों को संभालना स्वाभाविक रूप से विश्लेषणात्मक विविधताओं से जुड़ा हुआ है, आगे की डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं के लिए चयापचय विचरण के मूल्यांकन को विकृत करता है। विशेष रूप से, विश्लेषणात्मक विविधताओं के लिए अग्रणी प्रमुख मुद्दे मशीन के प्रदर्शन और समय के साथ वाद्य बहाव पर आधारितहैं 6. बैच-टू-बैच भिन्नता का एकीकरण चुनौतीपूर्ण है और बड़े पैमाने पर संरचित पौधों की आबादी का विश्लेषण करते समय विशेष रूप से समस्याग्रस्त है। गैर-जैविक विविधताओं के लिए सही करने के लिए कई सामान्यीकरण प्रक्रियाओं का सुझाव दिया गया था, उदाहरण के लिए, विश्लेषणात्मक त्रुटियों के लिए सही करने के लिए आंतरिक, बाहरी और आइसोटोप-लेबल वाले आंतरिक मानकों का उपयोग, जिनमें से प्रत्येक स्वाभाविक रूप से ज्ञात समस्याओं और नुकसान 7,8,9,10 से जुड़ा हुआ है।
विश्लेषणात्मक भिन्नता के अलावा, निष्कर्षण प्रोटोकॉल की पसंद आम तौर पर विश्लेषणात्मक विधि के आधार पर भिन्न होती है। आखिरकार, यह सामग्री और श्रम लागत को कम करने के साथ-साथ चरण पृथक्करण-आधारित निष्कर्षण विधियों का प्रदर्शन करके विभिन्न विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं के लिए एक ही नमूने के कई विभाज्य का उपयोग करने की आवश्यकता को कम करने के लिए वांछित है। इन विधियों को पहली बार क्लोरोफॉर्म का उपयोग करके पेश किया गया था: ध्रुवीय और हाइड्रोफोबिकयौगिकों को विभाजित करने के लिए मेथनॉल /
यह प्रोटोकॉल फलियां प्रजातियों में ध्रुवीय चयापचयों और लिपिड दोनों को प्रोफाइल करने के लिए एक बहु-ओमिक्स प्लेटफॉर्म के लिए एक तेज़ उच्च-थ्रूपुट पाइपलाइन का वर्णन करता है। इसके अलावा, यह दिखाता है कि जीडब्ल्यूएएस प्रदर्शन करके मेटाबोलाइट मात्रात्मक विशेषता लोकी (क्यूटीएल) का पता लगाने के लिए जीनोटाइपिक जानकारी को एकीकृत करने से पहले उन डेटासेट को विश्लेषणात्मक भिन्नता के लिए उचित रूप से कैसे ठीक किया जा सकता है और सामान्यीकृत किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (17:0 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850360P</td>
			<td>Internal standard for lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>FAME solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovitexin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>38953-85-4</td>
			<td>Internal standard for metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lignoceric Acid Methylester</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2442-49-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13684102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyamin -hydrochlorid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>593-56-6</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl laurate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-82-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl myristate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>124-10-7</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl palmitate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-39-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl stearate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-61-8</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl tert-butyl ether (MTBE)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13890602</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-caprat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>110-42-9</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcaprylat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-11-5</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyldocosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>929-77-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyleicosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1120-28-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-hexacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5802-82-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-octacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>55682-92-3</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-pelargonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1731-84-6</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamid (MSTFA)</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>24589-78-4</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>110-86-1</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribitol</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>22566-17-2</td>
			<td>Internal standard for derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triacontanoic Acid Methyl Ester</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>629-83-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>23214102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius Corporation</td>
			<td>14 557 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-35ms, 30 m, 0,25 mm, 0,25 &#181;m</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>123-3832</td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC-MS system</td>
			<td>Leco Pegasus HT TOF-MS (LECO Corporation)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding Balls, Stainless Steel</td>
			<td>OPS DIAGNOSTICS</td>
			<td>GBSS 196-2500-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Q Exactive Focus (Q Exactive&#8482; Focus Hybrid Quadrupol-Orbitrap&#8482; 
			Massenspektrometer, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf, model 5427R</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.7 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002878</td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RP High Strength Silica (HSS) T3 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.8 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003539</td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf Thermomixer 5436</td>
			<td>2050-100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>USC 300 TH</td>
			<td>142-0084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinding mixer mill</td>
			<td>Retsch, Mixer Mill MM 300</td>
			<td>20.746.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC system</td>
			<td>Waters Acquity UPLC system (Waters)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators</td>
			<td>7.008.500.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Vortex-Genie 2, Model G560</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetAlign</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MzMine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;data.table&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;fujiplot&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pleiotrpoic map</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;genetics&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;Ime4&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BLUPs calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;LDheatmap&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>LD plots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;MASS&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;rMVP&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GWAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 4.0.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS Genedata</td>
			<td>Expressionist</td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>OPTON-30965</td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization

गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-एमएस) और तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) दोनों व्यापक रूप से सैकड़ों हजारों मेटाबोलाइट विशेषताओं का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए चयापचय दृष्टिकोण का उपयोग किया जाता है। हालांकि, बड़ी संख्या में नमूनों के लिए इन तकनीकों का अनुप्रयोग अधिक जटिल इंटरैक्शन के अधीन है, विशेष रूप से जीनोम-वाइड एसोसिएशन स्टडीज (जीडब्ल्यूएएस) के लिए। यह प्रोटोकॉल फलियां फसल प्रजातियों के लिए नमूनों की एक बड़ी संख्या के विश्लेषण के साथ एक कुशल और तेजी से नमूना तैयारी को जोड़ती है, जो एक अनुकूलित चयापचय वर्कफ़्लो का वर्णन करता है। यह थोड़ा संशोधित निष्कर्षण विधि शुरू में पौधे और जानवरों के ऊतकों के विश्लेषण के लिए विकसित की गई थी और मिथाइल टर्ट-ब्यूटाइल ईथर में निष्कर्षण पर आधारित है: ध्रुवीय और लिपिड चयापचयों के कब्जे की अनुमति देने के लिए मेथनॉल विलायक। इसके अलावा, हम विश्लेषणात्मक विविधताओं को कम करने के लिए एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रदान करते हैं, जो जीडब्ल्यूएएस में चयापचय विचरण के उच्च-थ्रूपुट मूल्यांकन के लिए आवश्यक हैं।

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Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

इस प्रोटोकॉल में, हम एक अनुकूलित वर्कफ़्लो पेश करते हैं, जो कई नमूनों की एक कुशल और तेज़ नमूना तैयारी को जोड़ती है। इसके अलावा, हम चयापचय जीडब्ल्यूएएस अध्ययनों के उच्च-थ्रूपुट मूल्यांकन के लिए विश्लेषणात्मक विविधताओं को कम करने के लिए एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रदान करते हैं।

बड़े पैमाने पर मल्टी-ओमिक्स जीनोम-वाइड एसोसिएशन स्टडीज (एमओ-जीडब्ल्यूएएस): नमूना तैयारी और सामान्यीकरण के लिए दिशानिर्देश

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

बड़ी आबादी की जांच एक मशीन-चालित भिन्नता के साथ आती है, जो इसके द्वारा प्राकृतिक विविधता से उत्पन्न वास्तविक भिन्नता है। यहां हम डाउनस्ट्रीम एकीकरण विश्लेषण के लिए तकनीकी भिन्नता को कम करने के लिए एक विधि प्रदर्शित करते हैं। इस तकनीक के फायदों में एक चेहरा पृथक्करण-आधारित निष्कर्षण शामिल है, जो प्रणालीगत त्रुटि को हटाने और जैविक विचरण को बनाए रखते हुए संबंधित विश्लेषणात्मक मंच पर विभिन्न चयापचयों का विश्लेषण प्रदान करता है।एक बार जीनोटाइपिक और फेनोटाइपिक जानकारी प्राप्त हो जाने के बाद, इस पद्धति को जीवन के किसी भी राज्य में किसी भी विविध प्राकृतिक आबादी पर लागू किया जा सकता है। 20-मिलीलीटर कटाई ट्यूब लेना शुरू करने के लिए, दो पांच मिलीमीटर, और दो आठ मिलीमीटर व्यास धातु मोती को समरूप बनाने और ट्यूबों को लेबल करने के लिए जोड़ें। फिर, फ्लैश फ्रीजिंग द्वारा तरल नाइट्रोजन में फसल ताजा पत्ती और जड़ ऊतक के नमूनों को काटने के तुरंत बाद, तरल नाइट्रोजन के साथ एक देवर भरें।आगे की प्रक्रिया के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर कटे हुए जैविक नमूनों को स्टोर करें। तरल नाइट्रोजन में ट्यूब धारकों को पूर्व-ठंडा करें। अगला, एक सजातीय पाउडर प्राप्त करने के लिए एक मिनट के लिए 25 हर्ट्ज पर ऊतकों को पीस लें।ठंड को दोहराएं, और पीसने के लिए यदि ऊतक सजातीय रूप से जमीन नहीं है। प्री-कूल्ड लेबल वाले दो मिलीमीटर सुरक्षित लॉक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में 50 मिलीग्राम ताजा पौधे सामग्री का वजन करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि वजन प्रक्रिया के दौरान पौधे की सामग्री जमे हुए रहे। नमूने के 1 से 50 मिलीग्राम विभाज्य पूर्व-ठंडा निष्कर्षण मिश्रण का एक मिलीलीटर जोड़ें, और बर्फ पर रखने से पहले ट्यूब को संक्षेप में भंवर करें।चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 800 गुना जी पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर नमूनों सेते हैं, 10 मिनट के लिए बर्फ ठंडा सोनिकेशन स्नान में सोनिकेशन के बाद। नमूनों के लिए निष्कर्षण मिश्रण के 500 माइक्रोलीटर भी जोड़ने के लिए एक मल्टी-चैनल विंदुक का उपयोग करें और संक्षिप्त भंवर द्वारा अर्क मिश्रण करें, फिर मिश्रण को चार डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 11, 200 गुना जी पर अपकेंद्रित्र करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, अलग-अलग ऊपरी लिपिड युक्त चरण के 500 माइक्रोलीटर को पूर्व-लेबल वाले 1.5 मिलीलीटर सुरक्षित लॉक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, बाकी ऊपरी चरण को हटा दें।अलग-अलग में, 1.5-मिलीलीटर सुरक्षित लॉक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब निचले अर्ध-ध्रुवीय चरण चार जीसीएमएस के 150 माइक्रोलीटर और अर्ध-ध्रुवीय चरण चार यू-एच-पी-एल-सी एमएस विश्लेषण के 300 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करते हैं। हीटिंग के बिना सभी निकाले गए अंशों को केंद्रित करने और सूखे अंशों को 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए विलायक वाष्पीकरण के लिए एक वैक्यूम कंसंट्रेटर का उपयोग करें। अल्ट्रा-हाई परफॉर्मेंस, लिक्विड क्रोमैटोग्राफी, मास स्पेक्ट्रोमेट्री, या एच-पी-एल-सी एमएस के लिए नमूना तैयार करने के लिए मेथनॉल और पानी के मिश्रण के 180 माइक्रोलीटर में सूखे अर्ध-ध्रुवीय अंशों को फिर से निलंबित करें।फिर अर्ध-ध्रुवीय चरण को 2 मिनट के लिए सोनिकेट करें, इसके बाद एक मिनट के लिए 11, 200 गुना जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला के 90 माइक्रोलीटर को एक ग्लास शीशी में स्थानांतरित करें और एलसीएमएस नमूने में अर्क के दो माइक्रोलीटर इंजेक्ट करें। 40 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित एक उलट चरण सी 18 कॉलम पर मेटाबोलाइट विभाजन करें, और प्रवाह ए और बी के क्रमिक परिवर्तनों के साथ प्रति मिनट 400 माइक्रोलीटर का प्रवाह, नकारात्मक आयनीकरण मोड में परीक्षण रिक्त और गुणवत्ता नियंत्रण नमूनों के द्रव्यमान स्पेक्ट्रा को चार्ज करने के लिए 102 1500 द्रव्यमान की द्रव्यमान सीमा के साथ प्राप्त करें।अर्ध-ध्रुवीय चयापचयों के नमूनों के लिए, नकारात्मक और सकारात्मक आयनीकरण मोड में डेटा-निर्भर अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री में एक पूल्ड क्यूसी नमूना चलाएं। एनोटेशन के लिए प्राप्त द्रव्यमान स्पेक्ट्रा का उपयोग करें। आंतरिक मानक के वितरण की जाँच करके डेटा सेट का सामान्यीकरण करें।एकल या एकाधिक आंतरिक मानकों के संकेत के लिए सही करके डेटा को सामान्य करें। अगला, सटीक नमूना वजन पर क्रोमैटोग्राम से प्राप्त चोटी की तीव्रता को सही करें। बहु-बैच श्रृंखला में तीव्रता बहाव को सही करने के लिए, क्यूसी-आधारित सुधार विधियों का प्रदर्शन करें जैसे कि स्थानीय रूप से अनुमानित स्कैटरप्लॉट चौरसाई का उपयोग करके आर जीनोम-वाइड एसोसिएशन अध्ययन या जीडब्ल्यूएएस करने से पहले, 5% से कम मामूली एलील आवृत्तियों के लिए जीनोटाइपिक डेटा को फ़िल्टर करें और लटकन का उपयोग करके 10% से अधिक की लापता दर।यह कम आवृत्ति पूर्वाग्रह से बचाएगा। पर्यावरणीय कारकों से उत्पन्न पूर्वाग्रह को खत्म करने के लिए आर पैकेज एलएमई चार का उपयोग करें और प्रयोगात्मक पुनरावृत्ति पर प्रत्येक सामान्यीकृत सुविधा के लिए सर्वोत्तम रैखिक, निष्पक्ष भविष्यवाणियों या ब्लोप्स की गणना करें। आर में आरएमवीपी पैकेज के साथ जीडब्ल्यूएएस करने के लिए व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक सुविधा के ब्लोप्स का उपयोग करें कई सामान्य बीन प्रजातियों में लिपिडोमिक डेटा विभिन्न बैचों से दो क्यूसी नमूनों के कच्चे बेस पीक क्रोमैटोग्राम के आधार पर दिखाया गया है।कुछ लिपिड वर्गों के लिए सिग्नल तीव्रता में भिन्नता देखी गई थी। प्रणालीगत त्रुटि अधिक स्पष्ट थी जब कच्चे डेटा पर प्रमुख घटक विश्लेषण किया गया था। स्थानीय रूप से अनुमानित स्कैटरप्लॉट चौरसाई सहित सामान्यीकरण प्रक्रिया ने क्यूसी नमूनों के क्लस्टरिंग का नेतृत्व किया।व्यक्तिगत समूहों में विच्छेदन करते समय, बैच सात और आठ में मशीन-चालित त्रुटियां सामान्यीकरण से पहले स्पष्ट हो गईं, जिसे ठीक किया गया था। पोस्ट सामान्यीकृत और परिवर्तित व्यक्तिगत चयापचय समूहों का उपयोग जीडब्ल्यूएएस के लिए किया गया था, जो कई विशेषता मार्कर संघों में उपज थी। प्रतिनिधि विश्लेषण में, विभिन्न यौगिक वर्गों को अलग-अलग रंगों में हाइलाइट किया जाता है, जबकि कई यौगिक वर्गों से जुड़े मार्करों को इसके निकटतम जीन के साथ इंगित किया जाता है।डेटा सामान्यीकरण और परिवर्तन सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक है। सुनिश्चित करें कि प्रणालीगत त्रुटि के लिए सही करने के लिए उचित सुधार किया गया है, और वितरण में सामान्यता सुनिश्चित करें। विश्लेषणात्मक भिन्नता के लिए सुधार करके, कई एकीकरण दृष्टिकोण किए जा सकते हैं, जैसे कि चयापचय सहसंबंध विश्लेषण और जटिल लक्षणों पर प्रकाश डालने के लिए फेनोमिक डेटा में एकीकरण।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

आरएनए-बाइंडिंग क्षेत्रों की सामूहिक स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित पहचान के लिए नमूना तैयारी

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Ribosome profiling द्वारा नवोदित खमीर में अनुवाद के जीनोम चौड़ा ठहराव

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

थाली आधारित Caenorhabditis एलिगेंसकी बड़े पैमाने पर खेती: मधुमेह में चयापचय परिवर्तन के अध्ययन के लिए नमूना तैयारी

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

जांच इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए नमूना तैयारी

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

बड़े पैमाने पर परमाणु इंटरैक्टूम प्रोफाइलिंग के लिए लेबल-फ्री इम्यूनोप्रिसिप्रिशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री वर्कफ्लो

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

प्रोटेओमिक्स सुविधा सबमिशन और बाद के डेटा विश्लेषण के लिए टीएमटी नमूना तैयारी

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

वीएमएक्सएम बीमलाइन में माइक्रोक्रिस्टल के लिए एक नमूना तैयारी पाइपलाइन

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

क्रायो-ईएम के लिए उच्च तापमान नमूना ग्रिड की तैयारी

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

नमूना तैयारी और सापेक्ष मात्रा Peptidomics अध्ययन के लिए Amines के रिडक्टिव मिथाइलेशन का उपयोग कर

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

इलेक्ट्रॉन क्रिस्टलोग्राफिक अध्ययन के लिए लिपिड मोनोलेयर विधि का उपयोग करके नमूना तैयारी

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...