Name: large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization
Uploaded: 2021-07-27T15:00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization at JoVE.com

M.B. è supportato dall'IMPRS-PMPG "Metabolismo primario e crescita delle piante". A.R.F. e S.A. riconoscono il sostegno finanziario del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'UE, del progetto PlantaSYST (SGA-CSA n. 739582 nell'ambito dell'FPA n. 664620) e del progetto INCREASE (GA 862862).

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Sia GC-MS che LC-MS sono strumenti ampiamente utilizzati per profilare miscele complesse di varie classi di metaboliti. La gestione di set di dati di grandi dimensioni con questi strumenti è intrinsecamente associata a una variazione non biologica, ad esempio la variazione analitica, che interferisce e distorce l'interpretazione dei risultati. Questo protocollo presenta una pipeline di estrazione robusta e ad alto rendimento per una profilazione metabolica completa per eliminare la variazione di origine non biologica e condurre studi "omici" su larga scala. I volumi e le concentrazioni utilizzati in questo protocollo sono stati aggiustati per le specie di leguminose in diversi tessuti. Tuttavia, questi parametri possono essere leggermente modificati e utilizzati anche per campioni metabolici su larga scala di altre specie vegetali.
Le15 estrazioni basate su MTBE precedentemente descritte possono essere utilizzate per analizzare metaboliti derivati, metaboliti semipolari e lipidi. Questo può essere ampliato per le estrazioni di proteine eormoni vegetali 39, che erano fuori dall'ambito di questo protocollo. Altri protocolli di estrazione si basano su miscele di diclorometano:etanolo40,41. Di questi protocolli di estrazione, il protocollo di estrazione MTBE:metanolo fornisce un'alternativa favorevole e meno pericolosa ai protocolli di estrazione esistenti a base di cloroformio42 e non si traduce in un pellet proteico come interfase tra la fase polare e lipidica. Inoltre, i metodi MTBE sono già stati utilizzati in diversi studi per vari campioni biologici 43,44,45.
Questo protocollo discute diversi passaggi cruciali che potrebbero portare a potenziali variazioni durante la gestione di un gran numero di campioni, ad esempio durante la raccolta12,13, l'estrazione14 e la randomizzazione46. Inoltre, ci sono ulteriori questioni che non sono state discusse in questo protocollo che devono essere considerate per garantire dati metabolomici di alta qualità, ad esempio l'effetto matrice e la soppressione degli ioni14.
La potenza dei metodi di normalizzazione basati su QC dipende intrinsecamente dal numero di campioni QC in ciascun lotto. Come accennato in precedenza, sebbene l'aumento del numero aumenterebbe la potenza, la variazione intra-batch dei QC è relativamente marginale rispetto alla variazione tra lotti in questi sistemi analitici, come illustrato nella Figura 3. Nel complesso, ci sono altri metodi di normalizzazione basati su QC, come la rimozione degli errori sistemici utilizzando la foresta casuale (SERRF), che hanno dimostrato di superare la maggior parte degli altri metodi di normalizzazione come il rapporto batch-wise, la normalizzazione utilizzando una selezione ottimale di più standard interni (NOMIS) e la normalizzazione probabilistica del quoziente (PQN)47 . Tuttavia, SERRF si basa su più campioni QC in ogni lotto, ad esempio ogni decimo campione, il che non è fattibile durante la gestione di un gran numero di campioni. Il vantaggio principale della normalizzazione basata sul controllo di qualità rispetto ad altri metodi basati su dati o interni basati su standard è che mantiene la variazione biologica essenziale mentre accoglie la variazione tecnica indesiderata28. I lettori possono fare riferimento a questa recensione sulla gestione della variazione28.
Un problema principale in GWAS è il tasso di falsi positivi, che hanno origine principalmente a causa del collegamento di siti causali e non causali 48,49. In secondo luogo, gli approcci conservativi di correzione statistica, ad esempio Bonferroni e FDR, sono corretti per il numero di test indipendenti, che non è uguale al numero di SNP analizzati in GWAS a causa del collegamento tra SNP prossimi50,51 Pertanto, il numero effettivo di test indipendenti è spesso inferiore. Un altro modo per ridurre la soglia statistica conservativa sarebbe quello di ridurre il numero di SNP testati utilizzati per GWAS in base al decadimento del linkage su regioni genomiche definite52. La piattaforma metabolomica ad alto throughput integrata GWAS descritta in questo protocollo ha una vasta gamma di applicazioni. In particolare, faciliterà i miglioramenti nell'allevamento delle colture modificando la composizione metabolita/lipidica per i livelli desiderati industrialmente e nutrizionalmente. Nel complesso, la metabolomica ha fornito una visione approfondita dell'architettura genetica di una pletora di metaboliti e della diversificazione metabolica che si è verificata durante l'addomesticamento delle colture negli ultimi decenni, indicando il vasto potenziale dell'allevamento associato alla metabolomica53. Gli approcci biologici molecolari per la validazione QTL a valle includono la generazione di linee mutanti CRISPR/Cas954, linee di inserzione T-DNA55, linee di sovraespressione stabili e/o transitorie56, VIGS, approcci metabolomici ex vivo 57 accanto all'approccio convenzionale nella generazione di popolazioni F2 incrociate e convalida incrociata in diverse popolazioni.
Eseguendo la correzione necessaria per le variazioni analitiche come descritto sopra, oltre al GWAS possono essere eseguiti diversi approcci integrati, come metabolita-metabolita, analisi di correlazione metabolita-lipide, analisi di correlazione con dati fenomici per far luce su tratti più complessi e / o analisi di co-espressione per svelare ulteriormente le basi dei sistemi biologici58.

Approcci "omici" su larga scala hanno permesso l'analisi di sistemi biologici complessi 1,2,3 e un'ulteriore comprensione del legame tra genotipi e fenotipi risultanti4. La metabolomica che utilizza la cromatografia liquida ad altissime prestazioni-spettrometria di massa (UHPLC-MS) e GC-MS ha permesso il rilevamento di una pletora di caratteristiche metaboliche, di cui solo alcune sono annotate in una certa misura, risultando in un'alta percentuale di metaboliti sconosciuti. Le interazioni complesse possono essere esplorate combinando la metabolomica su larga scala con la variazione genotipica sottostante di una popolazione diversificata5. Tuttavia, la gestione di grandi set di campioni è intrinsecamente associata a variazioni analitiche, distorcendo la valutazione della varianza metabolica per ulteriori processi a valle. In particolare, i principali problemi che portano a variazioni analitiche si basano sulle prestazioni della macchina e sulla deriva strumentale nel tempo6. L'integrazione della variazione da lotto a lotto è impegnativa e particolarmente problematica quando si analizzano popolazioni di piante strutturate su larga scala. Sono state suggerite molteplici procedure di normalizzazione per correggere variazioni non biologiche, ad esempio l'uso di standard interni, esterni e isotopici per correggere errori analitici, di cui ciascuno è intrinsecamente associato a problemi e insidie noti 7,8,9,10.
Oltre alla variazione analitica, la scelta dei protocolli di estrazione varia generalmente a seconda del metodo analitico. In definitiva, si desidera ridurre i costi di materiale e manodopera, nonché la necessità di utilizzare più aliquote dello stesso campione per vari processi analitici eseguendo metodi di estrazione basati sulla separazione di fase. Questi metodi sono stati introdotti per la prima volta utilizzando cloroformio: metanolo / solventi acquosi per frazionare composti polari e idrofobici11.
Questo protocollo descrive una pipeline veloce ad alto rendimento per una piattaforma multi-omica per profilare sia i metaboliti polari che i lipidi nelle specie di legumi. Inoltre, mostra come tali set di dati possono essere opportunamente corretti per la variazione analitica e normalizzati prima di integrare informazioni genotipiche per rilevare i loci dei tratti quantitativi del metabolita (QTL) eseguendo GWAS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (17:0 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850360P</td>
			<td>Internal standard for lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>FAME solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovitexin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>38953-85-4</td>
			<td>Internal standard for metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lignoceric Acid Methylester</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2442-49-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13684102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyamin -hydrochlorid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>593-56-6</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl laurate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-82-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl myristate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>124-10-7</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl palmitate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-39-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl stearate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-61-8</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl tert-butyl ether (MTBE)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13890602</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-caprat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>110-42-9</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcaprylat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-11-5</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyldocosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>929-77-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyleicosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1120-28-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-hexacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5802-82-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-octacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>55682-92-3</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-pelargonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1731-84-6</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamid (MSTFA)</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>24589-78-4</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>110-86-1</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribitol</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>22566-17-2</td>
			<td>Internal standard for derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triacontanoic Acid Methyl Ester</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>629-83-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>23214102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius Corporation</td>
			<td>14 557 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-35ms, 30 m, 0,25 mm, 0,25 &#181;m</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>123-3832</td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC-MS system</td>
			<td>Leco Pegasus HT TOF-MS (LECO Corporation)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding Balls, Stainless Steel</td>
			<td>OPS DIAGNOSTICS</td>
			<td>GBSS 196-2500-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Q Exactive Focus (Q Exactive&#8482; Focus Hybrid Quadrupol-Orbitrap&#8482; 
			Massenspektrometer, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf, model 5427R</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.7 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002878</td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RP High Strength Silica (HSS) T3 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.8 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003539</td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf Thermomixer 5436</td>
			<td>2050-100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>USC 300 TH</td>
			<td>142-0084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinding mixer mill</td>
			<td>Retsch, Mixer Mill MM 300</td>
			<td>20.746.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC system</td>
			<td>Waters Acquity UPLC system (Waters)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators</td>
			<td>7.008.500.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Vortex-Genie 2, Model G560</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetAlign</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MzMine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;data.table&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;fujiplot&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pleiotrpoic map</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;genetics&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;Ime4&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BLUPs calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;LDheatmap&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>LD plots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;MASS&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;rMVP&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GWAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 4.0.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS Genedata</td>
			<td>Expressionist</td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>OPTON-30965</td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization

Sia la gascromatografia-spettrometria di massa (GC-MS) che la cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) sono approcci metabolomici ampiamente utilizzati per rilevare e quantificare centinaia di migliaia di caratteristiche metaboliche. Tuttavia, l'applicazione di queste tecniche a un gran numero di campioni è soggetta a interazioni più complesse, in particolare per gli studi di associazione genome-wide (GWAS). Questo protocollo descrive un flusso di lavoro metabolico ottimizzato, che combina una preparazione efficiente e veloce del campione con l'analisi di un gran numero di campioni per le specie di leguminose. Questo metodo di estrazione leggermente modificato è stato inizialmente sviluppato per l'analisi di tessuti vegetali e animali e si basa sull'estrazione in etere metil-terz-butilico: solvente metanolo per consentire la cattura di metaboliti polari e lipidici. Inoltre, forniamo una guida passo-passo per ridurre le variazioni analitiche, che sono essenziali per la valutazione ad alto rendimento della varianza metabolica nei GWAS.

Gli esperimenti GWAS di metabolomica di successo dovrebbero iniziare con un corretto disegno sperimentale, seguito da raccolta, estrazione, acquisizione ed elaborazione dei campioni, come illustrato nella Figura 1. In questo protocollo, il metodo MTBE15 è stato utilizzato per estrarre e analizzare centinaia di metaboliti appartenenti a diverse classi di composti. La cromatografia dipende molto dalle proprietà della colonna utilizzata e dalle miscele tampone di eluizione. La Figura 2 mostra cromatogrammi di campioni QC, indicando il modello di eluizione di alcune delle principali classi lipidiche in questo sistema analitico. Le pendenze applicate per ciascuna piattaforma sono indicate nella Tabella 1. Una forte enfasi è stata posta sulla gestione degli errori sistemici negli esperimenti su larga scala. L'esecuzione di metabolomica su larga scala è intrinsecamente associata a errori sistemici. Per dimostrazione, abbiamo analizzato i dati lipidomici in diverse specie di fagioli comuni. La Tabella 1 supplementare fornisce i dati lipidomici grezzi estratti ottenuti dopo l'elaborazione del cromatogramma utilizzando il software indicato nella Tabella dei materiali. Seguire questo protocollo ci ha permesso di aggirare i principali problemi nella gestione dei dati omici, in particolare durante la gestione di grandi set di campioni. La procedura di normalizzazione produce una correzione accurata degli errori analitici per lotto, come dimostrato nella Figura 3. Sebbene l'aumento del numero di campioni QC aumenterebbe la potenza della normalizzazione, ciò non è sempre fattibile a causa di vincoli di costo e di tempo. Per la metabolomica ad alto rendimento GWAS con caratteristiche metaboliche non mirate, è essenziale illustrare in modo appropriato un numero maggiore di associazioni tratto-marcatore. Una mappa pleiotropica38 che combina più risultati GWAS potrebbe essere utilizzata per evidenziare le regioni genomiche a cui sono collegati diversi tratti (Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig01.jpg"> Figura 1: Diagramma di flusso del GWAS basato sulla metabolomica nelle piante. Diversi passaggi a partire dalla progettazione sperimentale fino al rilevamento di QTL sono mostrati nel pannello di sinistra. Nel pannello di destra, vengono mostrate più figure per supportare diversi passaggi menzionati nel pannello di sinistra. Partendo dall'alto a destra, (1) viene mostrata una sequenza suggerita di campioni per LC-MS, (2) grafici di punteggi pre e post normalizzati di PCA, inclusa una distribuzione rappresentativa delle caratteristiche pre e post-elaborazione, con il rosso che indica le intensità del campione QC, e (3) un grafico di Manhattan con associazioni significative a cui sono state generate distribuzioni LD e aplotipiche. Abbreviazioni: GWAS = studi di associazione genome-wide; QTL = loci dei tratti quantitativi; PCA = analisi dei componenti principali; QC = controllo di qualità; LD = squilibrio di collegamento; MS = spettrometria di massa; LC-MS = cromatografia liquida-spettrometria di massa; GC-MS = gascromatografia-spettrometria di massa; LOESS = levigatura del grafico a dispersione stimato localmente; MLM/MLMM = modello lineare misto/modello misto multi-locus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig02.jpg"> Figura 2: Elaborazione del cromatogramma. Due cromatogrammi QC (picco di base; dati lipidici) di diversi lotti dimostrano la variazione batch-wise per alcune classi lipidiche nei campioni QC raggruppati. Quattro principali classi lipidiche sono indicate con le rispettive finestre di eluizione nel sistema LC-MS interno. I cromatogrammi sono stati esportati da MzMine21. Abbreviazioni: QC = controllo qualità; LC-MS = cromatografia liquida-spettrometria di massa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig03.jpg"> Figura 3: Correzione dell'errore sistematico. Analisi dei componenti principali dei dati lipidomici acquisiti, pre- (a sinistra, dati grezzi) e post-correzione per errori sistemici (destra, batch loess). I pannelli inferiori illustrano la distribuzione delle caratteristiche (Cluster_00005) sui campioni (n = 650) e i lotti (n = 10) pre- (sinistra) e post (destra) -correzione per la variazione analitica. Abbreviazioni: PCA = analisi dei componenti principali; QC = controllo di qualità; LOESS = levigatura del grafico a dispersione stimata localmente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig04.jpg"> Figura 4: Mappa pleiotropica che illustra i risultati combinati GWAS. La mappa pleiotropica evidenzia le regioni dell'intero genoma che sono associate a diversi tratti. I numeri sugli anelli esterni indicano i cromosomi corrispondenti. Ogni circlet rappresenta un tratto individuale con i suoi SNP significativamente associati. I colori rappresentano diverse classi composte (grigio = classe composta 1; verde = classe composta 2; viola = classe composta 3; giallo = classe composta 4). Nel caso di associazioni di classi inter-composte con la stessa regione genomica, i geni sono evidenziati. Il cerchio grigio interno mostra la somma di tutti gli SNP significativi associati a una specifica posizione genomica. Le associazioni mostrate in questa figura sono generate artificialmente solo a scopo illustrativo. Abbreviazioni: GWAS = studi di associazione genome-wide; SNP = polimorfismi a singolo nucleotide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="5">Impostazioni UHPLC-MS per i lipidi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo [min]</td>
			<td>Eluente da A a B [%]*</td>
			<td colspan="3">Informazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>45% A</td>
			<td colspan="3">Eluente A: 1% 1M NH4-Acetato, 0,1% acido acetico in acqua (grado UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 4.00</td>
			<td>lg 45% - 25% A</td>
			<td colspan="3">Eluente B: 1% 1M NH4-Acetato, 0,1% acido acetico in acetonitrile/2-propanolo 7:3 (grado UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4.00 - 12.00</td>
			<td>lg 25% - 11% A</td>
			<td colspan="3">
Portata: 400 μL/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>12.00 - 15.00</td>
			<td>lg 11% - 0% A</td>
			<td colspan="3">
Volume di iniezione: 2 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 19.50</td>
			<td>cw 0% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.50-19.51</td>
			<td>0% - 45% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.51-24.00</td>
			<td>eq 45%</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">Impostazioni UHPLC-MS/MS per metaboliti polari e semipolari</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo [min]</td>
			<td>Eluenti A e B [%]*</td>
			<td colspan="3">Informazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>99% A</td>
			<td colspan="3">Eluente A: 0,1% di acido formico in acqua (grado UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 11.00</td>
			<td>LG 99% -60% A</td>
			<td colspan="3">Eluente B: acido formico allo 0,1% in acetonitrile (grado UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>11.00 - 13.00</td>
			<td>lg 60% - 30% A</td>
			<td colspan="3">
Portata: 400 μL/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>13.00 - 15.00</td>
			<td>lg 30% - 1% A</td>
			<td colspan="3">
Volume di iniezione: 3 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 16.00</td>
			<td>cw 1% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>16.00 - 17.00</td>
			<td>lg 1% - 99% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>17.00 - 20.00</td>
			<td>eq 99% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">Impostazioni GC-MS per metaboliti derivatizzati</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo [min]</td>
			<td>Temperatura [°C]</td>
			<td colspan="3">Informazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 2.00</td>
			<td>85</td>
			<td colspan="3">
Gas di trasporto: Elio</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.00 - 18.66</td>
			<td>LG 80 - 330</td>
			<td colspan="3">
Portata: 2 mL/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>18.66 - 24.66</td>
			<td>cw 330</td>
			<td colspan="3">
Gradiente di temperatura: 15 °C/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>24.66</td>
			<td>raffreddamento rapido</td>
			<td colspan="3">
Volume di iniezione: 1 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Impostazioni del gradiente per ciascuna delle piattaforme analitiche7. Abbreviazioni: lg = gradiente lineare; cw = lavaggio delle colonne; eq = equilibrato; UHPLC-MS = cromatografia liquida ad altissime prestazioni-spettrometria di massa; UHPLC-MS/MS = cromatografia liquida ad altissime prestazioni-spettrometria di massa tandem; GC-MS = gascromatografia-spettrometria di massa. * = valore percentuale corrispondente all'eluente A; il valore percentuale rimanente corrisponde all'eluente B.
Tabella supplementare 1: Dati lipidomici grezzi. Indica le intensità di picco per ciascuno dei cluster rilevati su ciascun campione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/Supplementary%20Table%201%20.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization at JoVE.com

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

In questo protocollo, presentiamo un flusso di lavoro ottimizzato, che combina una preparazione efficiente e veloce del campione di molti campioni. Inoltre, forniamo una guida passo-passo per ridurre le variazioni analitiche per la valutazione ad alto rendimento degli studi GWAS metabolici.

Studi di associazione multiomica su larga scala (Mo-GWAS): linee guida per la preparazione e la normalizzazione dei campioni

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

Lo studio di una popolazione più ampia viene fornito con una variazione guidata dalla macchina, che da questo la variazione effettiva proviene dalla diversità naturale. Qui dimostriamo un metodo per ridurre la variazione tecnica per l'analisi dell'integrazione a valle. I vantaggi di questa tecnica includono un'estrazione basata sulla separazione facciale, che fornisce l'analisi di vari metaboliti sulla rispettiva piattaforma analitica, rimuovendo l'errore sistemico e mantenendo la varianza biologica.Una volta ottenute le informazioni genotipiche e fenotipiche, questo metodo può essere applicato a qualsiasi popolazione naturale diversificata in qualsiasi regno della vita. Per iniziare prendi tubi di raccolta da 20 millilitri, aggiungi due perline metalliche da cinque millimetri e due da otto millimetri di diametro per omogeneizzare ed etichettare i tubi. Quindi, riempire un dewar con azoto liquido, subito dopo aver tagliato raccogliere campioni di foglie fresche e tessuto radicale in azoto liquido mediante congelamento lampo.Conservare i campioni biologici raccolti a 80 gradi Celsius per un'ulteriore lavorazione. Pre-raffreddare i portatubi in azoto liquido. Quindi, macinare i tessuti a 25 hertz per un minuto per ottenere una polvere omogenea.Ripetere il congelamento e la macinazione se il tessuto non è macinato in modo omogeneo. Pesare 50 milligrammi di materiale vegetale fresco in un microcentrifuga di blocco sicuro pre-raffreddato con etichetta a due millimetri, assicurando che il materiale vegetale rimanga congelato durante il processo di pesatura. Aggiungere un millilitro di miscela di estrazione pre-raffreddata da 1 a 50 milligrammi di aliquota del campione e ruotare brevemente il tubo prima di mantenere il ghiaccio.Incubare i campioni su uno shaker orbitale a 800 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius, seguito da sonicazione in un bagno di sonicazione raffreddato a ghiaccio per 10 minuti. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere anche 500 microlitri di miscela di estrazione ai campioni e mescolare gli estratti mediante breve vortice, quindi centrifugare la miscela a 11.200 volte G per 5 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, trasferire 500 microlitri della fase superiore separata contenente lipidi in un tubo microcentrifuga di blocco sicuro pre-marcato da 1,5 millilitri, rimuovendo il resto della fase superiore.In tubi microcentrifuga a blocco sicuro separati da 1,5 millilitri trasferiscono 150 microlitri della fase semipolare inferiore quattro GCMS e 300 microlitri della fase semipolare quattro analisi U-H-P-L-C MS. Utilizzare un concentratore sottovuoto per l'evaporazione con solvente per concentrare tutte le frazioni estratte senza riscaldamento e conservare le frazioni essiccate a 20 gradi Celsius. Per preparare il campione per prestazioni ultra-elevate, cromatografia liquida, spettrometria di massa o H-P-L-C MS, sospendere nuovamente le frazioni semipolari essiccate in 180 microlitri di una miscela di metanolo e acqua.Quindi sonicare la fase semipolare per 2 minuti, seguita da centrifugazione a 11,200 volte G per un minuto. Dopo la centrifugazione, trasferire 90 microlitri del surnatante in una fiala di vetro e iniettare due microlitri degli estratti nel campione LCMS versato. Eseguire il frazionamento del metabolita su una colonna di fase C18 invertita mantenuta a 40 gradi Celsius e un flusso di 400 microlitri al minuto con variazioni graduali degli effluenti A e B, acquisire gli spettri di massa del bianco di prova e campioni di controllo qualità in modalità di ionizzazione negativa con un intervallo di massa di 102 1500 rapporto massa/carica.Per i campioni di metaboliti semipolari, eseguire un campione QC aggregato in spettrometria di massa tandem dipendente dai dati in modalità di ionizzazione negativa e positiva. Utilizzare gli spettri di massa ottenuti per l'annotazione. Eseguire la normalizzazione del set di dati controllando la distribuzione dello standard interno.Normalizzare i dati correggendo il segnale di uno o più standard interni. Quindi, correggere le intensità di picco ottenute dal cromatogramma sul peso esatto del campione. Per correggere la deriva dell'intensità tra serie multi-batch, eseguire metodi di correzione basati su QC come l'smoothing dello scatterplot stimato localmente utilizzando R.Prima di eseguire studi di associazione a livello di genoma o GWAS, filtrare i dati genotipici per frequenze alleliche minori inferiori al 5% e un tasso mancante superiore al 10% utilizzando la nappa.Ciò eviterà la distorsione a bassa frequenza. Per eliminare il pregiudizio derivante dai fattori ambientali utilizzare il pacchetto R LME quattro e calcolare le migliori previsioni lineari e imparziali o blobp per ogni caratteristica normalizzata rispetto alle ripetizioni sperimentali. Utilizzare i blob di ciascuna funzionalità singolarmente per eseguire GWAS con il pacchetto rMVP in R.I dati lipidomici su diverse specie di fagioli comuni sono mostrati in base ai cromatogrammi di picco di base grezza di due campioni QC di lotti diversi.È stata osservata una variazione delle intensità del segnale per alcune classi lipidiche. L'errore sistemico è stato più evidente quando è stata eseguita l'analisi delle componenti principali sui dati grezzi. La procedura di normalizzazione, compresa la levigatura del grafico a dispersione stimata localmente, ha portato al raggruppamento dei campioni QC.Durante la dissezione nei singoli cluster, gli errori guidati dalla macchina nei lotti sette e otto sono diventati chiari prima della normalizzazione, che è stata corretta. I singoli cluster metabolomici post normalizzati e trasformati sono stati utilizzati per GWAS, producendo in diverse associazioni di marcatori di tratti. Nell'analisi rappresentativa, diverse classi di composti sono evidenziate in diversi colori, mentre i marcatori associati a più classi di composti sono indicati con il suo gene più vicino.La normalizzazione e la trasformazione dei dati sono uno dei passaggi più importanti. Assicurarsi che sia stata eseguita una correzione adeguata per correggere l'errore sistemico e garantire la normalità nella distribuzione. Eseguendo la correzione per la variazione analitica, è possibile eseguire diversi approcci di integrazione, come l'analisi della correlazione metabolica e l'integrazione in dati fenomici per far luce su tratti complessi.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Ricerca

Biochimica

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genome-wide quantificazione della traduzione nel lievito gemmante mediante profilatura, ribosoma

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Piastra-base di coltivazione su larga scala di Caenorhabditis elegans: preparazione del campione per la studio di alterazioni metaboliche nel diabete

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Preparazione del campione per la spettrometria di massa di ionizzazione elettrospray sonda

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Flusso di lavoro per spettrometria di massa per l'immunoprecipitazioni nucleari senza etichetta per la profilazione del contraglio nucleare su larga scala

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Preparazione del campione TMT per l'invio di strutture proteomiche e la successiva analisi dei dati

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Una pipeline di preparazione del campione per microcristalli presso la linea di fascio VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Preparazione di griglie di campionamento ad alta temperatura per crio-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Preparazione del campione e quantificazione relativa mediante metilazione riduttiva delle ammine per studi peptidomici

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Preparazione del campione utilizzando un metodo monostrato lipidico per studi cristallografici elettronici

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...