Name: large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization
Uploaded: 2021-07-27T15:00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization at JoVE.com

M.B.はIMPRS-PMPG「一次代謝と植物成長」によってサポートされています。A.R.F.とSAは、EU Horizon 2020 Research and Innovation Programme、Project PlantaSYST(SGA-CSA NO. 739582 UNDER FPA No. 664620)、およびProject INCREASE(GA 862862)の財政的支援を認める。

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

GC-MSとLC-MSはどちらも、さまざまな代謝産物クラスの複雑な混合物をプロファイリングするために広く使用されているツールです。これらのツールで大規模なデータセットを処理することは、本質的に非生物学的変動、例えば分析的変動と関連しており、結果の解釈を妨げ、偏らせる。このプロトコルは、非生物学的起源の変動を排除し、大規模な「オミックス」研究を実施するための包括的な代謝プロファイリングのための堅牢でハイスループットな抽出パイプラインを提供します。このプロトコールで使用した体積および濃度を、異なる組織におけるマメ科植物種について調整した。しかし、これらのパラメータはわずかに変更することができ、他の植物種からの大規模な代謝サンプルにも使用することができる。
前述の15のMTBEベースの抽出は、誘導体化代謝産物、半極性代謝産物、および脂質を分析するために使用することができる。これは、このプロトコールの範囲外であったタンパク質および植物ホルモン抽出39について拡張することができる。他の抽出プロトコルは、ジクロロメタンに依存しています:エタノール混合物40,41。これらの抽出プロトコルのうち、MTBE:メタノール抽出プロトコルは、既存のクロロホルムベースの抽出プロトコル42に代わる有利で危険性の低い代替手段を提供し、極性相と脂質相の間の中間相としてタンパク質ペレットを生じさせない。さらに、MTBE法は、様々な生物学的試料43、44、45についてのいくつかの研究において既に使用されている。
このプロトコルは、例えば、収穫12、13、抽出14、および無作為化46の間など、多数のサンプルを処理している間に潜在的な変動につながる可能性のあるいくつかの重要なステップについて議論する。さらに、高品質のメタボロミクスデータ、例えば、マトリックス効果およびイオン抑制14を確実にするために考慮されなければならない、このプロトコルでは議論されていない追加の問題がある。
QC ベースの正規化方法の検出力は、本質的に各バッチ内の QC サンプルの数に依存します。前述のように、数値を増やすと検出力は増加しますが、 図 3 に示すように、QC のバッチ内変動は、これらの分析システムのバッチ間変動と比較して比較的ごくわずかです。全体として、ランダムフォレスト(SERRF)を使用した全身エラー除去など、他のQCベースの正規化方法があり、バッチごとの比率、複数の内部標準の最適な選択を使用した正規化(NOMIS)、確率的商正規化(PQN)などの他の正規化方法のほとんどを上回ることが示されています47.しかし、SERRFは各バッチの複数のQCサンプル、例えば10分の1サンプルに依存しており、多数のサンプルを処理している間は実現不可能です。他のデータ駆動型または内部標準ベースの方法に対するQCベースの正規化の主な利点は、望ましくない技術的変動28に対応しながら、本質的な生物学的変動を保持することである。読者は、バリエーション28の取り扱いに関するこのレビューを参照することができます。
GWASの主な問題の1つは偽陽性の割合であり、これは主に因果関係サイトと非因果関係サイトの連鎖に起因する48,49。第2に、保存的統計的補正アプローチ、例えば、ボンフェローニおよびFDRは、近接SNPs間の結合に起因するGWASにおけるアッセイされたSNPsの数と等しくない独立試験の数について補正する50,51したがって、独立試験の実際の数は、しばしばより低くなる。保存的統計的閾値を減少させる別の方法は、定義されたゲノム領域52にわたる連鎖崩壊に基づいてGWASに使用される試験SNPの数を減らすことであろう。このプロトコルに記載されているGWAS統合ハイスループットメタボロミクスプラットフォームには、幅広いアプリケーションがあります。特に、代謝産物/脂質組成を工業的および栄養的に望ましいレベルに変更することにより、作物育種の改善を促進する。全体として、メタボロミクスは、過去数十年にわたって作物の家畜化中に起こった多数の代謝産物の遺伝的構造と代謝の多様化に関する深い洞察を提供しており、メタボロミクス関連の育種の広大な可能性を示しています53。下流QTL検証のための分子生物学的アプローチには、CRISPR/Cas9変異株54、T-DNA挿入ライン55、安定および/または一過性過剰発現ライン56、VIGS、エキソビボメタボロミクスアプローチ57の生成が含まれ、クロスF2集団の生成における従来のアプローチならびに異なる集団における交差バリデーションに類似している。
上記のような分析的変動に対して必要な補正を行うことによって、GWASに加えて、代謝物−代謝産物、代謝産物−脂質相関分析、より複雑な形質に光を当てるための現象データへの相関分析、および/または生物学的系の基礎をさらに解明するための共発現分析など、いくつかの統合的アプローチを行うことができる58。

大規模な「オミクス」アプローチは、複雑な生物学的システム1,2,3の分析を可能にし、遺伝子型と結果として生じる表現型との間のリンクのさらなる理解を可能にした4。超高速液体クロマトグラフィー質量分析(UHPLC-MS)とGC-MSを用いたメタボロミクスは、代謝産物の特徴の莫大な数の検出を可能にしたが、そのうち一部のみがある程度注釈が付けられており、その結果、未知の代謝産物の割合が高い。複雑な相互作用は、大規模なメタボロミクスと多様な集団の根底にある遺伝子型変動を組み合わせることによって探索することができる5。しかし、大きなサンプルセットを処理することは本質的に分析的変動に関連しており、さらなる下流プロセスに対する代謝分散の評価を歪めます。具体的には、分析の変動につながる主な問題は、機械の性能と時間の経過に伴う機器のドリフトに基づいています6。バッチ間の変動の統合は困難であり、大規模に構造化されたプラント集団を分析する際に特に問題になります。非生物学的変動、例えば、分析エラーを補正するための内部、外部、および同位体標識内部標準の使用を補正するために複数の正規化手順が提案され、それぞれが本質的に既知の問題および落とし穴と関連している7,8,9,10。
分析上の変動に加えて、抽出プロトコルの選択は、一般に、分析方法に応じて変化する。最終的には、相分離ベースの抽出方法を実行することにより、材料コストと人件費を削減し、さまざまな分析プロセスに同じサンプルの複数のアリコートを使用する必要性を減らすことが望まれています。これらの方法は、クロロホルム(極性および疎水性化合物11を分画するためのメタノール/水溶媒)を使用して最初に導入されました。
このプロトコルは、マメ科植物種の極性代謝産物と脂質の両方をプロファイリングするためのマルチオミクスプラットフォームのための高速ハイスループットパイプラインを記述しています。さらに、GWASを実行して代謝産物定量形質遺伝子座(QTL)を検出するために遺伝子型情報を統合する前に、これらのデータセットを分析的変動に対して適切に補正し、正規化する方法を示します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (17:0 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850360P</td>
			<td>Internal standard for lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>FAME solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovitexin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>38953-85-4</td>
			<td>Internal standard for metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lignoceric Acid Methylester</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2442-49-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13684102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyamin -hydrochlorid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>593-56-6</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl laurate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-82-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl myristate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>124-10-7</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl palmitate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-39-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl stearate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-61-8</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl tert-butyl ether (MTBE)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13890602</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-caprat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>110-42-9</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcaprylat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-11-5</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyldocosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>929-77-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyleicosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1120-28-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-hexacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5802-82-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-octacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>55682-92-3</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-pelargonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1731-84-6</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamid (MSTFA)</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>24589-78-4</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>110-86-1</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribitol</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>22566-17-2</td>
			<td>Internal standard for derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triacontanoic Acid Methyl Ester</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>629-83-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>23214102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius Corporation</td>
			<td>14 557 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-35ms, 30 m, 0,25 mm, 0,25 &#181;m</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>123-3832</td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC-MS system</td>
			<td>Leco Pegasus HT TOF-MS (LECO Corporation)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding Balls, Stainless Steel</td>
			<td>OPS DIAGNOSTICS</td>
			<td>GBSS 196-2500-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Q Exactive Focus (Q Exactive&#8482; Focus Hybrid Quadrupol-Orbitrap&#8482; 
			Massenspektrometer, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf, model 5427R</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.7 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002878</td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RP High Strength Silica (HSS) T3 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.8 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003539</td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf Thermomixer 5436</td>
			<td>2050-100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>USC 300 TH</td>
			<td>142-0084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinding mixer mill</td>
			<td>Retsch, Mixer Mill MM 300</td>
			<td>20.746.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC system</td>
			<td>Waters Acquity UPLC system (Waters)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators</td>
			<td>7.008.500.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Vortex-Genie 2, Model G560</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetAlign</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MzMine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;data.table&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;fujiplot&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pleiotrpoic map</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;genetics&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;Ime4&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BLUPs calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;LDheatmap&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>LD plots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;MASS&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;rMVP&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GWAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 4.0.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS Genedata</td>
			<td>Expressionist</td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>OPTON-30965</td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization

ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)と液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)はどちらも、何十万もの代謝産物の特徴を検出および定量するために広く使用されているメタボロミクスアプローチです。しかし、これらの技術を多数のサンプルに適用すると、特にゲノムワイド関連研究(GWAS)の場合、より複雑な相互作用の影響を受けます。このプロトコルは、効率的で迅速なサンプル調製とマメ科植物種の多数のサンプルの分析を組み合わせた、最適化された代謝ワークフローを記述します。このわずかに変更された抽出方法は、当初、植物および動物組織の分析のために開発され、極性および脂質代謝産物の捕捉を可能にするメチルtert-ブチルエーテル:メタノール溶媒中での抽出に基づいている。さらに、GWASにおける代謝分散のハイスループット評価に不可欠な分析変動を低減するためのステップバイステップガイドを提供します。

メタボロミクスGWAS実験を成功させるには、適切な実験計画から始めて、図1に示すように、サンプルの収集、抽出、データ収集、および処理が続く必要があります。このプロトコールでは、MTBE法15を使用して、いくつかの化合物クラスに属する何百もの代謝産物を抽出および分析した。クロマトグラフィーは、利用されるカラムおよび溶出バッファー混合物の特性に大きく依存します。図2は、QCサンプルのクロマトグラムを示し、この分析システムにおけるいくつかの主要な脂質クラスの溶出パターンを示す。各プラットフォームに適用されるグラデーションを表 1 に示します。大規模な実験では、全身的なエラーを処理することに重点が置かれました。大規模なメタボロミクスの実行は、本質的に全身エラーと関連している。デモンストレーションのために、我々はいくつかの一般的な豆種にわたるリピドミクスデータを分析した。補足表1は、材料表に示されたソフトウェアを用いてクロマトグラム処理後に得られた抽出された生リピドミクスデータを提供する。このプロトコルに従うことで、オミックスデータを扱う際の大きな問題、特に大きなサンプルセットを扱う際の大きな問題を回避することができました。正規化手順では、図 3 に示すように、バッチごとの分析誤差を正確に補正できます。QCサンプルの数を増やすと正規化の検出力は高まりますが、コストと時間の制約により、これは必ずしも実現可能ではありません。非標的代謝機能を有するハイスループットメタボロミクスGWASの場合、より多くの形質マーカー関連を適切に例示することが不可欠である。複数のGIS結果を組み合わせた多面的マップ38を使用して、いくつかの形質がリンクしているゲノム領域を強調することができます(図4)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig01.jpg"> 図1:植物におけるメタボロミクスベースのGWASのフローチャート。 実験計画からQTLの検出までのいくつかのステップが左側のパネルに示されています。右側のパネルには、左側のパネルで説明したいくつかのステップをサポートするために、複数の図が表示されます。右上から始めて、(1)LC-MSについて推奨されるサンプルのシーケンス、(2)QCサンプル強度を示す赤色の代表的な特徴分布前処理および後処理を含むPCAの前正規化前後のスコアプロット、および(3)LDおよびハプロタイプ分布が生成された有意な関連性を持つマンハッタンプロット。略語: GWAS = ゲノムワイド関連研究;QTL = 定量的形質遺伝子座;PCA = 主成分分析;QC = 品質管理;LD = 連鎖不平衡;MS = 質量分析;LC-MS = 液体クロマトグラフィー質量分析;GC-MS = ガスクロマトグラフィー質量分析;LOESS = 局所的に推定された散布図平滑化;MLM/MLMM = 混合線型モデル/多軌跡混合モデル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig02.jpg"> 図2:クロマトグラム処理 異なるバッチからの2つのQCクロマトグラム(ベースピーク;脂質データ)は、プールされたQCサンプル中の特定の脂質クラスのバッチごとの変動を実証します。4つの主要な脂質クラスは、社内のLC-MSシステム内のそれぞれの溶出窓で示されています。クロマトグラムはMzMine21からエクスポートした。略語: QC = 品質管理;LC-MS = 液体クロマトグラフィー - 質量分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig03.jpg"> 図3:システマティックエラーの修正 取得したリピドミクスデータの主成分分析、全身エラーの事前補正(左、生データ)および補正後(右、バッチ黄土)。下のパネルは、分析変動のサンプル(n=650)とバッチ(n=10)の事前(左)と後(右)の補正に対する特徴(Cluster_00005)分布を示しています。略語: PCA = 主成分分析;QC = 品質管理;LOESS = 局所的に推定された散布図の平滑化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig04.jpg"> 図4:組み合わせたGWAS結果を示す多面的視マップ。 多面的マップは、いくつかの形質に関連する全ゲノム中の領域を強調する。外環上の数字は、対応する染色体を示す。各サークルは、有意に関連するSNPを持つ個々の特性を表します。色は異なる複合クラスを表します(グレー = 化合物クラス 1、緑 = 複合クラス 2、紫 = 複合クラス 3、黄色 = 化合物クラス 4)。同じゲノム領域との化合物クラス間会合の場合、遺伝子が強調表示される。内側の灰色の円は、特定のゲノム位置に関連するすべての有意なSNPの合計を示す。この図に示す関連付けは、説明のためにのみ人工的に生成されています。略語: GWAS = ゲノムワイド関連研究;SNPs=一塩基多型。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="5">脂質の UHPLC-MS 設定</td>
		</tr>
<tr>
<td>時間 [分]</td>
			<td>溶離液 A から B [%]*</td>
			<td colspan="3">情報</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>45% A</td>
			<td colspan="3">溶離液A:1%1M NH4-アセテート、水中0.1%酢酸(UHPLCグレード)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 4.00</td>
			<td>LG 45% - 25% A</td>
			<td colspan="3">溶離液B:1%1M NH4-アセテート、アセトニトリル/2-プロパノール7:3(UHPLCグレード)中の0.1%酢酸</td>
		</tr>
<tr>
<td>4.00 - 12.00</td>
			<td>LG 25% - 11% A</td>
			<td colspan="3">
流量: 400μL/分</td>
		</tr>
<tr>
<td>12.00 - 15.00</td>
			<td>LG 11% - 0% A</td>
			<td colspan="3">
注入量: 2μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 19.50</td>
			<td>CW 0% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.50-19.51</td>
			<td>0% - 45% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.51-24.00</td>
			<td>当量 45%</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">極性および半極性代謝産物の UHPLC-MS/MS 設定</td>
		</tr>
<tr>
<td>時間 [分]</td>
			<td>溶離液 A および B [%]*</td>
			<td colspan="3">情報</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>99%A</td>
			<td colspan="3">溶離液A:水中のギ酸0.1%(UHPLCグレード)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 11.00</td>
			<td>LG 99% -60% A</td>
			<td colspan="3">溶離液B:アセトニトリル中の0.1%ギ酸(UHPLCグレード)</td>
		</tr>
<tr>
<td>11.00 - 13.00</td>
			<td>LG 60% - 30% A</td>
			<td colspan="3">
流量: 400μL/分</td>
		</tr>
<tr>
<td>13.00 - 15.00</td>
			<td>LG 30% - 1% A</td>
			<td colspan="3">
注入量: 3μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 16.00</td>
			<td>cw 1% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>16.00 - 17.00</td>
			<td>LG 1% - 99% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>17.00 - 20.00</td>
			<td>等価 99% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">誘導体化代謝産物のGC-MS設定</td>
		</tr>
<tr>
<td>時間 [分]</td>
			<td>温度[°C]</td>
			<td colspan="3">情報</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 2.00</td>
			<td>85</td>
			<td colspan="3">
キャリアガス: ヘリウム</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.00 - 18.66</td>
			<td>LG 80 - 330</td>
			<td colspan="3">
流量: 2mL /分</td>
		</tr>
<tr>
<td>18.66 - 24.66</td>
			<td>CW 330</td>
			<td colspan="3">
温度勾配: 15°C/分</td>
		</tr>
<tr>
<td>24.66</td>
			<td>急速冷却</td>
			<td colspan="3">
注入量: 1μL</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 各分析プラットフォームの勾配設定7. 略語: lg = 線形勾配;cw = カラム洗浄;eq = 平衡;UHPLC-MS = 超高速液体クロマトグラフィー質量分析;UHPLC-MS/MS = 超高速液体クロマトグラフィータンデム質量分析;GC-MS = ガスクロマトグラフィー - 質量分析。* = パーセント値は溶離液Aに対応します。残りの百分率値は溶離液Bに相当する。
補足表1:生のリピドミクスデータ。 各サンプルで検出された各クラスターのピーク強度を示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/Supplementary%20Table%201%20.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

このプロトコルでは、多くのサンプルの効率的で迅速なサンプル調製を組み合わせた最適化されたワークフローを紹介します。さらに、代謝GWAS研究のハイスループット評価のための分析変動を減らすためのステップバイステップガイドを提供します。

大規模マルチオミクスゲノムワイド関連研究(Mo-GWAS):サンプル調製と正規化のためのガイドライン

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

より大きな人口を調査するには、機械駆動の変動が伴い、これにより、実際の変動は自然の多様性に由来する。ここでは、ダウンストリーム統合分析の技術的変動を低減する方法を示します。この技術の利点には、顔分離ベースの抽出が含まれ、全身誤差を除去し、生物学的分散を維持しながら、それぞれの分析プラットフォーム上で様々な代謝産物の分析を提供する。遺伝子型および表現型情報が取得されると、この方法は、あらゆる生命王国のあらゆる多様な自然集団に適用することができる。20ミリリットルの収穫チューブを取り始めるには、均質化のために2つの5ミリメートルの5ミリメートルと2つの8ミリメートルの直径の金属ビーズを追加し、チューブにラベルを付けます。次いで、デュワーを液体窒素で満たし、切り出した直後に新鮮な葉および根組織サンプルを液体窒素で切り取り除き、フラッシュ凍結する。回収した生物学的サンプルを摂氏80度で保管し、さらに処理します。チューブホルダーを液体窒素で予冷します。次に、組織を25ヘルツで1分間粉砕し、均一な粉末を得る。凍結を繰り返し、組織が均質に粉砕されていない場合は粉砕する。予め冷却されたラベルの付いた2ミリメートルの安全ロック微量遠心チューブで50ミリグラムの新鮮な植物材料を計量し、計量プロセス中に植物材料が凍結したままになるようにします。予め冷却された抽出混合物1〜50ミリグラムの試料アリコートを1ミリリットル加え、氷上に保つ前にチューブを短時間ボルテックスする。4°Cで10分間、800倍Gのオービタルシェーカー上でサンプルをインキュベートし、続いて氷冷超音波処理浴中で10分間超音波処理する。マルチチャンネルピペットを使用して、500マイクロリットルの抽出混合物もサンプルに加え、短時間のボルテックスによって抽出物を混合し、混合物を摂氏4度で5分間11,200倍Gで遠心分離する。遠心分離後、分離した上部脂質含有相の500マイクロリットルを予め標識された1.5ミリリットルの安全なロック微量遠心チューブに移し、残りの上部相を除去した。別の1.5ミリリットルの安全ロックマイクロ遠心管では、150マイクロリットルの下部半極性相4つのGCMSおよび300マイクロリットルの半極性相4つのU-H-P-L-C MS 分析を移送します。溶媒蒸発に真空濃縮器を使用して、抽出されたすべての画分を加熱せずに濃縮し、乾燥した画分を摂氏20度で保存します。超高速用にサンプルを調製するために、液体クロマトグラフィー、質量分析、またはH-P-L-C MS 乾燥半極性画分をメタノールと水の混合物の180マイクロリットルに再懸濁します。次いで、半極性相を2分間超音波処理し、続いて1分間11,200回Gで遠心分離する。遠心分離後、90マイクロリットルの上清をガラスバイアルに移し、2マイクロリットルの抽出物を注いだLCMSサンプルに注入する。40°Cに保持された逆相C18カラムで代謝産物分画を行い、流出液AおよびBの漸進的な変化を伴う毎分400マイクロリットルの流れを行い、102質量対電荷比の質量範囲を有する負イオン化モードで試験ブランクおよび品質管理サンプルの質量スペクトルを取得する。半極性代謝産物サンプルについては、プールされたQCサンプルを負イオン化モードおよび正イオン化モードでデータ依存タンデム質量分析で実行します。得られた質量スペクトルをアノテーションに使用します。内部標準の分布を確認することにより、データセットの正規化を実行します。単一または複数の内部標準の信号を補正して、データを正規化します。次に、クロマトグラムから得られたピーク強度を正確なサンプル重量に対して補正します。マルチバッチ系列全体の強度ドリフトを補正するには、R.ゲノムワイド関連研究またはGWASを実行する前に、タッセルを使用して5%未満のマイナー対立遺伝子頻度および欠損率が10%を超える遺伝子型データをフィルタリングする前に、R.を使用して局所推定散布図平滑化などのQCベースの補正方法を実行します。これにより、低周波バイアスが回避されます。環境要因に起因するバイアスを排除するには、R パッケージ LME 4 を使用し、実験の繰り返しで正規化された各フィーチャについて、最適な線形で偏りのない予測またはブロップを計算します。R.R.のrMVPパッケージでGWASを実行するには、各機能のブロップを個別に使用して、いくつかの一般的な豆種にわたるリピドミクスデータは、異なるバッチからの2つのQCサンプルの生のベースピーククロマトグラムに基づいて示されています。シグナル強度の変動が、特定の脂質クラスについて観察された。全身誤差は、主成分分析が生データに対して実行されたときにより明白であった。局所的に推定された散布図平滑化を含む正規化手順は、QCサンプルのクラスタリングにつながった。個々のクラスターに分析すると、バッチ 7 と 8 のマシン駆動エラーが正規化の前に明らかになり、修正されました。正規化および形質転換後の個々のメタボロミクスクラスターをGWASに使用し、いくつかの形質マーカー関連をもたらした。代表的な解析では、異なる化合物クラスが異なる色で強調表示され、複数の化合物クラスに関連付けられたマーカーが最も近い遺伝子で示されます。データの正規化と変換は、最も重要な手順の 1 つです。全身誤差を補正するために適切な補正が実行されていることを確認し、分布の正規性を確保します。分析的変動の補正を行うことによって、代謝相関分析および複雑な形質に光を当てるための現象データへの統合など、いくつかの統合アプローチを行うことができる。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

線虫の大規模栽培のプレート ・ ベース: 糖尿病の代謝変化に関する研究のための試料作製

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

プローブエレクトロスプレーイオン化質量分析のためのサンプル調製

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

大規模核インターロームプロファイリングのためのラベルフリー免疫沈降質量分析ワークフロー

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

プロテオミクス施設提出のためのTMTサンプル調製とその後のデータ分析

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

VMXmビームラインにおける微結晶のサンプル調製パイプライン

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

クライオ電子顕微鏡用高温サンプルグリッドの作製

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

ペプチド学研究におけるアミンの還元メチル化を用いたサンプル調製と相対定量

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

電子結晶学研究のための脂質単層法を用いたサンプル調製

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...