Name: large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization
Uploaded: 2021-07-27T15:00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization at JoVE.com

M.B.는 IMPRS-PMPG '일차 대사 및 식물 성장'에 의해 지원됩니다. A.R.F.와 S.A.는 EU Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램, 프로젝트 PlantaSYST (SGA-CSA No. 739582 under FPA No. 664620) 및 Project INCREASE (GA 862862)의 재정적 지원을 인정합니다.

저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.

GC-MS와 LC-MS는 모두 다양한 대사 산물 클래스의 복잡한 혼합물을 프로파일 링하는 데 널리 사용되는 도구입니다. 이러한 도구로 대규모 데이터 세트를 처리하는 것은 본질적으로 비 생물학적 변이, 예를 들어 결과의 해석을 방해하고 편향시키는 분석 변형과 관련이 있습니다. 이 프로토콜은 비생물학적 기원의 변이를 제거하고 대규모 "omics"연구를 수행하기 위해 포괄적 인 대사 프로파일 링을위한 강력하고 높은 처리량의 추출 파이프 라인을 제공합니다. 이 프로토콜에 사용 된 부피 및 농도는 다른 조직의 콩과 식물 종에 대해 조정되었습니다. 그러나, 이들 파라미터는 약간 변형될 수 있고 다른 식물 종으로부터의 대규모 대사 샘플에도 사용될 수 있다.
앞서 기술한 15개의 MTBE-기반 추출은 유도체화된 대사산물, 반극성 대사산물 및 지질을 분석하는데 사용될 수 있다. 이것은 단백질 및 식물 호르몬 추출(39)을 위해 확장될 수 있으며, 이는 이 프로토콜의 범위를 벗어났다. 다른 추출 프로토콜은 디클로로메탄:에탄올 혼합물40,41에 의존한다. 이러한 추출 프로토콜 중 MTBE:메탄올 추출 프로토콜은 기존의 클로로포름 기반 추출 프로토콜(42)에 유리하고 덜 위험한 대안을 제공하며, 극성과 지질 단계 사이의 상으로 단백질 펠릿을 생성하지 않는다. 더욱이, MTBE 방법은 이미 다양한 생물학적 샘플(43,44,45)에 대한 몇몇 연구에서 사용되어 왔다.
이 프로토콜은 많은 수의 샘플들을 처리하면서 잠재적 변동으로 이어질 수 있는 몇 가지 중요한 단계들, 예를 들어, 수확(12,13), 추출(14) 및 랜덤화(46) 동안에 논의한다. 더욱이, 고품질의 대사체 데이터, 예를 들어, 매트릭스 효과 및 이온 억제(14)를 보장하기 위해 고려되어야 하는 이 프로토콜에서 논의되지 않은 추가적인 문제들이 있다.
QC 기반 정규화 방법의 힘은 본질적으로 각 배치의 QC 샘플 수에 따라 달라집니다. 앞서 언급한 바와 같이, 수를 늘리면 검정력이 증가하겠지만, QC의 배치내 변동은 그림 3에 예시된 바와 같이 이들 분석 시스템의 배치 간 변동에 비해 상대적으로 미미하다. 전반적으로, 무작위 포리스트(SERRF)를 사용한 전신 오류 제거와 같은 다른 QC 기반 정규화 방법이 있는데, 이는 배치 단위 비율, 다중 내부 표준(NOMIS)의 최적 선택을 이용한 정규화, 확률적 지수 정규화(PQN)47와 같은 다른 정규화 방법의 대부분을 능가하는 것으로 나타났습니다. . 그러나 SERRF는 각 배치의 여러 QC 샘플, 예를 들어 열 번째 샘플마다 의존하며, 이는 많은 수의 샘플을 처리하는 동안 실현 가능하지 않습니다. 다른 데이터 기반 또는 내부 표준 기반 방법에 비해 QC 기반 정규화의 주요 이점은 원치 않는 기술적 변동(28)을 수용하면서 필수적인 생물학적 변이를 유지한다는 것이다. 독자는 변동28의 처리에 관한 이 검토를 참조할 수 있다.
GIS의 주요 쟁점 중 하나는 오탐의 비율이며, 이는 주로 인과 관계 및 비 인과 관계 사이트48,49의 연관성으로 인해 발생합니다. 둘째, 보수적 통계적 보정 접근법, 예를 들어, Bonferroni 및 FDR은, 독립적인 시험의 수에 대해 정확하며, 이는 근접한 SNPs(50,51) 사이의 연계로 인해 GIS에서 분석된 SNP의 수와 동일하지 않기 때문에, 실제 독립적인 시험의 수는 종종 더 낮다. 보존적 통계적 역치를 감소시키는 또 다른 방법은 정의된 게놈 영역(52)에 대한 결합 붕괴에 기초하여 GIS에 사용되는 시험된 SNP의 수를 감소시키는 것이다. 이 프로토콜에 설명된 GWAS-통합 고처리량 대사체학 플랫폼은 광범위한 응용 분야를 가지고 있습니다. 특히, 대사 산물 / 지질 조성을 산업적으로나 영양적으로 원하는 수준으로 변경함으로써 작물 육종의 개선을 촉진 할 것입니다. 전반적으로, 대사체학은 지난 수십 년 동안 작물 가축화 과정에서 발생한 과다한 대사 산물의 유전 구조와 대사 다양화에 대한 심층적 인 통찰력을 제공하여 대사체학 관련 육종53의 광대 한 잠재력을 나타냅니다. 하류 QTL 검증을 위한 분자생물학적 접근법은 CRISPR/Cas9 돌연변이 라인(54), T-DNA 삽입 라인(55), 안정 및/또는 일시적 과발현 라인(56), VIGS, 생체외 대사체학 접근법(57)의 생성뿐만 아니라 상이한 집단에서의 교차 검증뿐만 아니라 교차 F2 집단을 생성하는 종래의 접근법 옆에 포함된다.
상기와 같은 분석 변이에 대해 필요한 보정을 수행함으로써, 대사산물-대사산물, 대사산물-지질 상관관계 분석, 보다 복잡한 형질을 밝히기 위한 현상 데이터에 대한 상관관계 분석, 및/또는 생물학적 시스템(58)의 기초를 더욱 풀기 위한 공동발현 분석과 같은 GIS 이외에 몇 가지 통합된 접근법이 수행될 수 있다.

대규모 "omics" 접근법 은 복잡한 생물학적 시스템(1,2,3)의 분석과 유전자형과 결과적인 표현형(4) 사이의 연관성에 대한 더 깊은 이해를 가능하게 하였다. 초고성능 액체 크로마토그래피-질량 분광분석법(UHPLC-MS) 및 GC-MS를 사용한 대사체학은 과다한 대사산물 특징의 검출을 가능하게 하였으며, 그 중 일부만이 어느 정도 주석이 첨부되어 알려지지 않은 대사산물의 비율이 높아졌다. 복잡한 상호 작용은 대규모 대사체학을 다양한 집단의 근본적인 유전자형 변이와 결합하여 탐구 할 수 있습니다5. 그러나 대규모 샘플 세트를 처리하는 것은 본질적으로 분석 변형과 관련이 있으며, 추가 하류 공정에 대한 대사 분산 평가를 왜곡합니다. 특히, 분석 변동으로 이어지는 주요 문제는 시간 경과에 따른 기계 성능 및 기기 드리프트를 기반으로합니다6. 배치 간 변동의 통합은 어렵고 대규모 구조화 된 식물 개체군을 분석 할 때 특히 문제가됩니다. 분석 오류를 수정하기 위해 내부, 외부 및 동위원소 표지 된 내부 표준의 사용과 같은 비 생물학적 변이를 수정하기 위해 여러 정규화 절차가 제안되었으며, 그 중 각각은 본질적으로 알려진 문제 및 함정 7,8,9,10과 관련이 있습니다.
분석 변형 외에도 추출 프로토콜의 선택은 일반적으로 분석 방법에 따라 다릅니다. 궁극적으로, 재료 및 인건비를 절감할 뿐만 아니라 상 분리 기반 추출 방법을 수행하여 다양한 분석 공정에 동일한 샘플의 여러 분취량을 사용할 필요성을 줄이는 것이 바람직합니다. 이러한 방법은 극성 및 소수성 화합물11을 분별하기 위해 클로로포름: 메탄올/물 용매를 사용하여 처음 도입되었다.
이 프로토콜은 콩과 식물 종의 극성 대사 산물과 지질을 프로파일 링하는 다중 오믹스 플랫폼을위한 빠른 고 처리량 파이프 라인을 설명합니다. 또한, GWAS를 수행하여 대사산물 정량적 형질 유전자좌(QTL)를 검출하기 위해 유전자형 정보를 통합하기 전에 분석 변이에 대해 이러한 데이터 세트를 적절하게 보정하고 정규화할 수 있는 방법을 보여줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (17:0 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850360P</td>
			<td>Internal standard for lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>FAME solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovitexin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>38953-85-4</td>
			<td>Internal standard for metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lignoceric Acid Methylester</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2442-49-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13684102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyamin -hydrochlorid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>593-56-6</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl laurate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-82-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl myristate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>124-10-7</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl palmitate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-39-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl stearate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-61-8</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl tert-butyl ether (MTBE)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13890602</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-caprat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>110-42-9</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcaprylat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-11-5</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyldocosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>929-77-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyleicosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1120-28-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-hexacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5802-82-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-octacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>55682-92-3</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-pelargonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1731-84-6</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamid (MSTFA)</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>24589-78-4</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>110-86-1</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribitol</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>22566-17-2</td>
			<td>Internal standard for derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triacontanoic Acid Methyl Ester</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>629-83-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>23214102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius Corporation</td>
			<td>14 557 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-35ms, 30 m, 0,25 mm, 0,25 &#181;m</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>123-3832</td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC-MS system</td>
			<td>Leco Pegasus HT TOF-MS (LECO Corporation)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding Balls, Stainless Steel</td>
			<td>OPS DIAGNOSTICS</td>
			<td>GBSS 196-2500-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Q Exactive Focus (Q Exactive&#8482; Focus Hybrid Quadrupol-Orbitrap&#8482; 
			Massenspektrometer, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf, model 5427R</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.7 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002878</td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RP High Strength Silica (HSS) T3 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.8 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003539</td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf Thermomixer 5436</td>
			<td>2050-100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>USC 300 TH</td>
			<td>142-0084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinding mixer mill</td>
			<td>Retsch, Mixer Mill MM 300</td>
			<td>20.746.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC system</td>
			<td>Waters Acquity UPLC system (Waters)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators</td>
			<td>7.008.500.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Vortex-Genie 2, Model G560</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetAlign</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MzMine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;data.table&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;fujiplot&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pleiotrpoic map</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;genetics&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;Ime4&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BLUPs calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;LDheatmap&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>LD plots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;MASS&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;rMVP&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GWAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 4.0.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS Genedata</td>
			<td>Expressionist</td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>OPTON-30965</td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization

가스 크로마토그래피-질량 분광법(GC-MS) 및 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC-MS)은 수십만 개의 대사산물 특징을 검출하고 정량화하기 위해 널리 사용되는 대사체학 접근법입니다. 그러나, 다수의 샘플에 이러한 기술을 적용하는 것은 특히 게놈 전체 연관 연구 (GWAS)에 대해보다 복잡한 상호 작용의 대상이됩니다. 이 프로토콜은 효율적이고 빠른 샘플 준비와 콩과 식물 작물 종에 대한 많은 수의 샘플 분석을 결합하는 최적화 된 대사 워크 플로우를 설명합니다. 이 약간 변형 된 추출 방법은 처음에는 식물 및 동물 조직의 분석을 위해 개발되었으며 극성 및 지질 대사 산물의 포획을 허용하는 메틸 tert-butyl 에테르 : 메탄올 용매에서의 추출을 기반으로합니다. 또한 GWAS의 대사 분산에 대한 고처리량 평가에 필수적인 분석 변형을 줄이기위한 단계별 가이드를 제공합니다.

성공적인 대사체학 GWAS 실험은 그림 1에 예시된 바와 같이 적절한 실험 설계로 시작하여 샘플 수집, 추출, 데이터 수집 및 처리로 시작해야 합니다. 이 프로토콜에서, MTBE 방법15는 여러 화합물 클래스에 속하는 수백 개의 대사 산물을 추출하고 분석하는 데 사용되었습니다. 크로마토그래피는 용출 완충액 혼합물뿐만 아니라 활용된 컬럼의 특성에 크게 의존한다. 도 2는 QC 샘플의 크로마토그램을 보여주며, 이는 이 분석 시스템에서 일부 주요 지질 부류의 용출 패턴을 나타낸다. 각 플랫폼에 적용된 그라디언트는 표 1에 제시되어 있다. 대규모 실험에서 체계적인 오류를 처리하는 데 중점을 두었습니다. 대규모 대사체학을 수행하는 것은 본질적으로 전신 오류와 관련이 있습니다. 시연을 위해, 우리는 몇몇 일반적인 콩 종에 걸친 지질학 데이터를 분석했다. 보충 표 1은 물질의 표에 표시된 소프트웨어를 사용하여 크로마토그램 처리 후에 수득된 추출된 미가공 지질 데이터를 제공한다. 이 프로토콜을 따라 우리는 특히 큰 샘플 세트를 처리하는 동안 오믹스 데이터를 처리 할 때 주요 문제를 피할 수있었습니다. 정규화 절차는 그림 3에 나와 있는 것처럼 배치 단위 분석 오류를 정확하게 수정할 수 있습니다. QC 샘플의 수를 늘리면 정규화의 검정력이 증가하지만 비용 및 시간 제약으로 인해 항상 실현 가능한 것은 아닙니다. 비표적 대사 특징을 갖는 고처리량 대사체학 GIS의 경우, 더 많은 수의 형질-마커 연관성을 적절하게 설명하는 것이 필수적이다. 다수의 GWAS 결과를 결합한 플레오트로픽 맵(38)은 몇몇 형질이 연결된 게놈 영역을 강조하는데 사용될 수 있다(도 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig01.jpg"> 도 1: 식물에서 대사체학 기반 GIS의 흐름도. 실험 설계부터 QTL 검출까지 몇 가지 단계가 왼쪽 패널에 표시됩니다. 오른쪽 패널에는 왼쪽 패널에 언급 된 몇 가지 단계를 지원하는 여러 그림이 표시됩니다. 오른쪽 상단부터 시작하여 (1) LC-MS에 대해 제안된 샘플 시퀀스가 표시되고, (2) QC 샘플 강도를 나타내는 빨간색이 있는 대표적인 특징 분포를 포함하는 PCA의 사전 및 사후 정규화된 점수 플롯, (3) LD 및 일배체형 분포가 생성되는 유의한 연관성을 갖는 맨해튼 플롯이 표시됩니다. 약어: GWAS = 게놈 전체 연관 연구; QTL = 정량적 형질 유전자좌; PCA = 주성분 분석; QC = 품질 관리; LD = 연결 불균형; MS = 질량 분광법; LC-MS = 액체 크로마토그래피-질량 분광법; GC-MS = 가스 크로마토그래피-질량 분광법; LOESS = 국부적으로 추정된 산점도 평활화; MLM/MLMM = 혼합 선형 모델/다중 유전자좌 혼합 모델. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig02.jpg"> 그림 2: 크로마토그램 처리. 상이한 배치로부터의 두 개의 QC 크로마토그램 (염기 피크; 지질 데이터)은 풀링된 QC 샘플에서 특정 지질 클래스에 대한 배치-방향 변이를 입증한다. 네 개의 주요 지질 부류는 사내 LC-MS 시스템에서 각각의 용출창으로 표시된다. 크로마토그램은 MzMine21에서 수출되었다. 약어 : QC = 품질 관리; LC-MS = 액체 크로마토그래피-질량 분광법. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig03.jpg"> 그림 3: 체계적인 오류 수정. 획득 된 지질 데이터의 주성분 분석, 전신 오류 (왼쪽, 원시 데이터) 및 전신 오류 (오른쪽, 배치 황토)에 대한 교정 후. 아래쪽 패널은 분석 변동에 대한 샘플(n=650) 및 배치(n=10) 사전(왼쪽) 및 사후(오른쪽) 보정에 대한 피쳐(Cluster_00005) 분포를 보여 줍니다. 약어: PCA = 주성분 분석; QC = 품질 관리; LOESS = 로컬로 추정된 산점도 평활화. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig04.jpg"> 그림 4: 결합된 GWAS 결과를 보여주는 플레오트로픽 맵. pleiotropic지도는 여러 특성과 관련된 전체 게놈의 영역을 강조합니다. 외부 고리의 숫자는 해당 염색체를 나타냅니다. 각 원은 크게 연관된 SNP와 함께 개별 특성을 나타냅니다. 색상은 서로 다른 화합물 클래스(회색 = 화합물 클래스 1, 녹색 = 화합물 클래스 2, 보라색 = 화합물 클래스 3, 노란색 = 화합물 클래스 4)를 나타냅니다. 동일한 게놈 영역과의 화합물간 클래스 연관의 경우, 유전자가 강조된다. 내부 회색 원은 특정 게놈 위치와 관련된 모든 중요한 SNP의 합을 보여줍니다. 이 그림에 표시된 연관성은 설명을 위해서만 인위적으로 생성됩니다. 약어: GWAS = 게놈 전체 연관 연구; SNPs = 단일 뉴클레오티드 다형성. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="5">지질에 대한 UHPLC-MS 설정</td>
		</tr>
<tr>
<td>시간 [분]</td>
			<td>용리액 A ~ B [%]*</td>
			<td colspan="3">정보</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>45% A</td>
			<td colspan="3">용리액 A : 1 % 1M NH4- 아세테이트, 물 중 0.1 % 아세트산 (UHPLC 등급)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 4.00</td>
			<td>lg 45 % - 25 % A</td>
			<td colspan="3">용리액 B : 1 % 1M NH4- 아세테이트, 아세토 니트릴 / 2- 프로판올 7 : 3 (UHPLC 등급) 0.1 % 아세트산</td>
		</tr>
<tr>
<td>4.00 - 12.00</td>
			<td>lg 25 % - 11 % A</td>
			<td colspan="3">
유속: 400 μL/분</td>
		</tr>
<tr>
<td>12.00 - 15.00</td>
			<td>lg 11 % - 0 % A</td>
			<td colspan="3">
주입량: 2 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 19.50</td>
			<td>CW 0% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.50-19.51</td>
			<td>0% - 45% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.51-24.00</td>
			<td>eq 45%</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">극성 및 반극성 대사 산물에 대한 UHPLC-MS/MS 설정</td>
		</tr>
<tr>
<td>시간 [분]</td>
			<td>용리액 A 및 B [%]*</td>
			<td colspan="3">정보</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>99% A</td>
			<td colspan="3">용리액 A : 물에 0.1 % 포름산 (UHPLC 등급)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 11.00</td>
			<td>lg 99 % -60 % A</td>
			<td colspan="3">용리액 B : 아세토 니트릴 중 0.1 % 포름산 (UHPLC 등급)</td>
		</tr>
<tr>
<td>11.00 - 13.00</td>
			<td>lg 60 % - 30 % A</td>
			<td colspan="3">
유속: 400 μL/분</td>
		</tr>
<tr>
<td>13.00 - 15.00</td>
			<td>lg 30 % - 1 % A</td>
			<td colspan="3">
주입량: 3 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 16.00</td>
			<td>CW 1% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>16.00 - 17.00</td>
			<td>lg 1 % - 99 % A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>17.00 - 20.00</td>
			<td>eq 99 % A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">유도체화된 대사산물에 대한 GC-MS 설정</td>
		</tr>
<tr>
<td>시간 [분]</td>
			<td>온도 [°C]</td>
			<td colspan="3">정보</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 2.00</td>
			<td>85</td>
			<td colspan="3">
캐리어 가스: 헬륨</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.00 - 18.66</td>
			<td>lg 80 - 330</td>
			<td colspan="3">
유속: 2 mL/분</td>
		</tr>
<tr>
<td>18.66 - 24.66</td>
			<td>cw 330</td>
			<td colspan="3">
온도 구배: 15 °C/분</td>
		</tr>
<tr>
<td>24.66</td>
			<td>급속 냉각</td>
			<td colspan="3">
주입량: 1 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 각 분석 플랫폼에 대한 그라디언트 설정7. 약어: lg = 선형 그라디언트; cw = 컬럼 세척; eq = 평형화; UHPLC-MS = 초고성능 액체 크로마토그래피-질량 분광법; UHPLC-MS/MS = 초고성능 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광법; GC-MS = 가스 크로마토그래피 - 질량 분광법. * = 백분율 값은 용리액 A에 해당하고; 나머지 백분율 값은 용리액 B에 해당합니다.
보충 표 1: 원시 지질학 데이터. 각 샘플에 걸쳐 검출된 각 클러스터에 대한 피크 강도를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/Supplementary%20Table%201%20.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

이 프로토콜에서는 많은 샘플의 효율적이고 빠른 샘플 준비를 결합한 최적화된 워크플로를 제시합니다. 또한, 대사 GWAS 연구의 고처리량 평가를 위한 분석 변형을 줄이기 위한 단계별 가이드를 제공합니다.

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Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

더 많은 인구를 조사하는 것은 기계 중심의 변형과 함께 이루어지며, 이로 인해 실제 변동은 자연 다양성에서 비롯됩니다. 여기서는 다운스트림 통합 분석을 위한 기술적 변동을 줄이는 방법을 시연합니다. 이 기술의 장점은 얼굴 분리 기반 추출을 포함하며, 각 분석 플랫폼에서 다양한 대사 산물의 분석을 제공하면서 전신 오류를 제거하고 생물학적 분산을 유지합니다.일단 유전자형 및 표현형 정보가 얻어지면, 이 방법은 모든 생명의 왕국에 있는 임의의 다양한 자연 집단에 적용될 수 있다. 20 밀리리터 수확 튜브를 시작하려면 튜브를 균질화하고 라벨을 붙이기 위해 두 개의 다섯 밀리미터와 두 개의 여덟 밀리미터 직경의 금속 비드를 추가하십시오. 이어서, 액체 질소로 탈전을 채우고, 수확 직후 신선한 잎 및 뿌리 조직 샘플을 액체 질소로 절단하여 플래시 동결시킨다.추가 처리를 위해 수확된 생물학적 샘플을 섭씨 80도에 보관합니다. 튜브 홀더를 액체 질소로 미리 냉각하십시오. 다음으로, 조직을 25 헤르츠에서 1분 동안 분쇄하여 균질한 분말을 얻었다.동결을 반복하고, 조직이 균질하게 분쇄되지 않은 경우 분쇄하십시오. 50밀리그램의 신선한 식물 재료를 미리 냉각된 라벨이 붙은 두 밀리미터 안전 잠금 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 계량 공정 중에 식물 재료가 동결된 상태로 유지되도록 합니다. 1 밀리리터의 미리 냉각 된 추출 혼합물 1 ~ 50 밀리그램의 분취량을 샘플에 첨가하고, 얼음 위에 보관하기 전에 튜브를 잠깐 와류하십시오.샘플을 섭씨 네 도에서 10분 동안 800배 G의 궤도 진탕기 상에서 인큐베이션하고, 이어서 10분 동안 빙냉식 초음파 처리 욕조에서 초음파 처리하였다. 다채널 피펫을 사용하여 500 마이크로리터의 추출 혼합물도 샘플에 첨가하고, 간단한 볼텍싱으로 추출물을 혼합한 다음, 혼합물을 섭씨 4도에서 5분 동안 11, 200회 G에서 원심분리한다. 원심분리 후, 분리된 상부 지질 함유 상 500 마이크로리터를 미리 표지된 1.5 밀리리터 세이프 락 마이크로원심분리 튜브로 옮기고, 나머지 상부 상을 제거하였다.분리된, 1.5 밀리리터 세이프 락 마이크로원심분리 튜브는 150 마이크로리터의 하부 반극상 네 GCMS 및 300 마이크로리터의 반극상 네 U-H-P-L-C MS 분석을 전달한다. 용매 증발을 위해 진공 농축기를 사용하여 가열하지 않고 추출된 모든 분획을 농축하고 건조된 분획을 섭씨 20도에 저장한다. 초고성능, 액체 크로마토그래피, 질량 분광법, 또는 H-P-L-C MS용 샘플을 제조하기 위해 건조된 반극성 분획을 메탄올과 물의 혼합물 180 마이크로리터에 재현탁시킨다.이어서, 반극성 상을 2분 동안 초음파 처리하고, 1분 동안 11, 200배 G에서 원심분리하였다. 원심분리 후, 90 마이크로리터의 상청액을 유리 바이알로 옮기고 두 마이크로리터의 추출물을 부은 LCMS 샘플에 주입한다. 섭씨 40도에서 유지되는 역전 상 C18 컬럼에서 대사산물 분획화를 수행하고, 유출물 A 및 B의 점진적인 변화로 분당 400 마이크로리터의 유동을 수행하고, 102,1500 질량 대 전하 비율의 질량 범위를 갖는 음성 이온화 모드에서 시험 블랭크 및 품질 관리 샘플의 질량 스펙트럼을 획득한다.반극성 대사산물 샘플의 경우, 음성 및 양성 이온화 모드에서 데이터 의존적 탠덤 질량 분광법에서 풀링된 QC 샘플을 실행합니다. 얻은 질량 스펙트럼을 주석에 사용하십시오. 내부 표준의 분포를 확인하여 데이터 집합의 정규화를 수행합니다.단일 또는 다중 내부 표준의 신호를 수정하여 데이터를 정규화합니다. 다음으로, 크로마토그램으로부터 수득된 피크 강도를 정확한 샘플 중량에 걸쳐 보정한다. 다중 배치 시리즈에서 강도 드리프트를 보정하려면 R.게놈 전체 연관 연구 또는 GWAS를 수행하기 전에 R.을 사용하여 국부적으로 추정된 산점도 평활화와 같은 QC 기반 보정 방법을 수행하고, 5% 미만의 작은 대립유전자 빈도 및 10% 이상의 누락률에 대한 유전자형 데이터를 필터링합니다.이렇게 하면 저주파 바이어스를 피할 수 있습니다. 환경 요인으로부터 기인하는 편향을 제거하려면 R 패키지 LME four를 사용하고 실험 반복을 통해 정규화된 각 특징에 대해 최상의 선형, 편향되지 않은 예측 또는 블롭을 계산합니다. R.The 여러 일반적인 콩 종에 걸친 지질 데이터는 서로 다른 배치에서 두 QC 샘플의 원시 염기 피크 크로마토그램을 기반으로 표시됩니다.신호 강도의 변동이 특정 지질 부류에 대해 관찰되었다. 체계적 오류는 원시 데이터에 대해 주성분 분석이 수행되었을 때 더욱 분명해졌습니다. 국부적으로 추정된 산점도 평활화를 포함하는 정규화 절차는 QC 샘플의 클러스터링으로 이어졌다.개별 클러스터로 해부할 때, 일곱과 여덟 개의 배치에서 기계 구동 오류가 정상화되기 전에 명확해졌고, 이는 수정되었다. 정상화 후 형질전환된 개별 대사체 클러스터를 GWAS에 사용하였고, 여러 형질 마커 연관성을 산출하였다. 대표적인 분석에서, 상이한 화합물 클래스는 상이한 색상으로 강조 표시되고, 다수의 화합물 클래스와 연관된 마커는 그의 가장 가까운 유전자로 표시된다.데이터 정규화 및 변환은 가장 중요한 단계 중 하나입니다. 시스템 오류를 수정하고 분포의 정상성을 보장하기 위해 적절한 수정이 수행되었는지 확인하십시오. 분석 변이에 대한 보정을 수행함으로써, 대사 상관 분석 및 표현 데이터로의 통합과 같은 몇 가지 통합 접근법을 수행하여 복잡한 특성을 밝힐 수 있습니다.

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