Name: large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization
Uploaded: 2021-07-27T15:00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization at JoVE.com

M.B. støttes av IMPRS-PMPG 'Primary Metabolism and Plant Growth'. A.R.F. og S.A. anerkjenner den økonomiske støtten til EU Horizon 2020 Research and Innovation Programme, prosjektet PlantaSYST (SGA-CSA No. 739582 under FPA No. 664620), og prosjektØKNING (GA 862862).

1. Eksperimentell design og plantedyrking
MERK: Sett opp eksperimentet avhengig av eksperimentell hypotese, for eksempel ved hjelp av en storskala GWAS-populasjon reduserer nødvendigheten av flere replikeringer, da statistisk testing vil bli utført basert på haplotypene til alle de enkelte SNPene i stedet for tiltredelsen. I motsetning til dette er flere replikeringer uunnværlige i andre eksperimentelle tilnærminger. Følgende punkter må vurderes mens du forbereder eksperimentet.
<ol><li>Inkluder nok biologiske repliker, avhengig av eksperimentell hypotese.</li>
	<li>Tilfeldiggjøre det biologiske replikerer blokkmessig for å redusere lokale miljøskjevheter under dyrking, for eksempel drivhus, felt.</li>
	<li>Sørg for riktig vedlikehold av anlegget under vekst. Behandle planter homogent for å redusere skjevheter.</li>
</ol>2. Fremstilling av biologisk plantemateriale
<ol><li>Høst forberedelse<ol>
<li>Etiketthøstingsrør (20 ml) som inneholder to metallperler med 5 mm og to metallperler med 8 mm diameter for homogenisering. Fyll opp en dewar med flytende nitrogen. MERK: Planter bør være i vegetativt stadium for fersk blad- og rotvevshøsting.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Høst biologiske prøver ved flash-frysing i flytende nitrogen. Høst så raskt som mulig for å utelukke påvirkning av circadian oscillasjon på metabolisme under langvarig høstingvarigheter 12,13. Oppbevar høstet ferskblad og rotvev for videre behandling ved -80 °C. MERK: Bladskjæring til blitsfrysing bør ikke ta lengre tid enn noen få sekunder, da etter bladspalting vil aktive biologiske prosesser endre metabolske profiler på grunn av sår. For røtter, preclean røttene ved å vaske med vann før flash-frysing i flytende nitrogen. Overflødig vann på rotoverflaten skal være gjennomvåt med papirvev. Tørkede frø kan lagres ved romtemperatur; ingen frysing i flytende nitrogen er nødvendig.</li>
	<li>Grind vevet ved hjelp av en vevsblandermølle.<ol>
<li>Forkjøl rørholderne i flytende nitrogen i et par minutter for å opprettholde en lav temperatur mens du sliper vevet.</li>
		<li>Transporter de biologiske prøvene i en nitrogenholdig dewar etter å ha tatt dem ut fra -80 °C fryseren.</li>
		<li>Grind vevet for å oppnå homogent pulver; bruk 25 Hz i 1 min og gjenta etter frysing i flytende nitrogen hvis vevet ikke er homogent malt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>For sliping av tørkede frø, legg frøene i en slipeburk med en metallperle med en diameter på 15 mm. Bruk samme frekvens og klokkeslett som nevnt i 2.3.3. MERK: Rene og ferdigkjølte mørtel og pestles kan brukes hvis en vevsblandermølle ikke er tilgjengelig.</li>
	<li>Precool merket 2 ml mikrosentrifugerør med sikker lås. Vei 50 mg med en feil på ±5 mg ferskt plantemateriale ved hjelp av en analytisk skala. Forkjøl verktøyene som brukes til overføring av plantemateriale i flytende nitrogen. Sørg for at plantematerialet forblir frosset under veieprosessen. MERK: Ikke utsett ferskt plantemateriale for lenge til romtemperatur, da biologiske prosesser aktiveres ved å øke temperaturen, og endre metabolske profiler14.</li>
	<li>Generer ekstra kvalitetskontrollprøver (QC) ved å samle en andel av hver prøve og veie 50 mg med en feil på ±5 mg samlet ferskt plantemateriale i forhåndskjølte 2 ml mikrosentrasjerør. MERK: Minst tre QC-prøver anbefales for hver 60. QC-prøvene er avgjørende for nedstrømskorreksjon, normalisering og analyser.</li>
</ol>3. Ekstraksjonsreagenser
<ol><li>Friskt vev, f.eks. MERK: Prøveuttrekking er basert på en tidligere beskrevet protokoll15. Denne protokollen er endret basert på nåværende behov, for eksempel flere vev, forskjellige interne standarder og store eksperimenter. I tillegg er alle volumer og instrumentinnstillinger nevnt nedenfor justert til interne analytiske enheter. Protokollbrukere bør justere disse i henhold til deres analytiske enhet og biologiske prøver, basert på testprøver.<ol>
<li>Ekstraksjonsblanding 1 (EM1): metyl tert-butyl eter (MTBE)/metanol (MeOH) (3:1 v/v)<ol>
<li>Forbered en blanding av MTBE/MeOH i et 3:1-forhold. For 100 ml ekstraksjonsløsningsmiddel blander du 75 ml MTBE med 25 ml MeOH i en ren glassflaske. MERK: Løsemidler bør håndteres forsiktig i avtrekkshetten med riktig sikkerhetsutstyr.</li>
			<li>Tilsett 45 μL 1,2-diheptadecanoyl-sn-glysero-3-fosfocholin (1 mg/ml i kloroform) som en intern standard for DEN UHPLC-MS-baserte lipidanalysen, 400 μL ribitol (1 mg/ml i vann) som intern standard for GC-MS-basert analyse, og 125 μL isovittxin (1 mg/ml i MeOH/vann (1:1 v/v)) for UHPLC-MS-basert metabolittanalyse. MERK: Tilsetning av interne standarder er nødvendig for normalisering etter analyse i henhold til analytiske behov. Siden 1 ml EM1 er nødvendig for hver prøve, kan du lage en lagerløsning i henhold til den eksperimentelle prøvestørrelsen, som skal brukes til hele eksperimentet. EM1 må oppbevares ved -20 °C. Kontroller fraværet av den brukte interne standarden og overlappende med andre forbindelser i de undersøkte artene. Flere standarder kan brukes; valget av interne standarder i denne protokollen var basert på tidligere tester ved hjelp av vanlige bønneekstrakter16.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ekstraksjonsblanding 2 (EM2) vann/metanol (MeOH) (3:1 v/v)<ol>
<li>For 100 ml EM2, tilsett 75 ml dobbeltdestillert vann og 25 ml MeOH i en ren glassflaske.</li>
			<li>Tilsett 500 μL EM2 per prøve, og lag en lagerløsning i henhold til den eksperimentelle prøvestørrelsen, som skal brukes til hele eksperimentet. Oppbevar EM2 ved 4 °C.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tørkede frø<ol>
<li>Ekstraksjonsblanding 3 (EM3) metanol (MeOH)/ vann (7:3 v/v)<ol>
<li>For 100 ml EM3, tilsett 70 ml MeOH og 30 ml dobbeltdestillert vann i en ren glassflaske. Forbered 1 ml EM3 for hver prøve.</li>
			<li>Tilsett 400 μL ribitol (1 mg/ml i vann) som interne standarder for GC-MS-basert analyse og 125 μL Isovitexin (1 mg/ml i MeOH/vann (1:1 v/v)) for UHPLC-MS-basert metabolittanalyse. MERK: Forbered en lagerløsning i henhold til den eksperimentelle prøvestørrelsen og bruk den til hele eksperimentet. Oppbevar EM3 ved 4 °C.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Prøveuttrekking
<ol><li>Friskt vev, f.eks.<ol>
<li>Forbered tre 1,5 ml mikrosenterrør med sikker lås for hver prøve. Oppbevar EM1 i et væskekjølesystem på -20 °C. Overfør de ferske prøvene fra -80 °C fryseren til tørris eller flytende nitrogen for transport. Tilsett 1 ml ferdigkjølt EM1 til hver 50 mg aliquot og virvel kort før du holder på is.</li>
		<li>Inkuber prøvene på en orbital shaker ved 800 × g i 10 min ved 4 °C.</li>
		<li>Soniker prøvene i et iskjølt sonikeringsbad i 10 min.</li>
		<li>Tilsett 500 μL EM2 ved hjelp av en flerkanals pipette for å unngå variasjon i ekstra volumer.</li>
		<li>Virvel prøvene kort for å blande ekstraksjonsblandingene før sentrifugering ved 11.200 × g i 5 min ved 4 °C.</li>
		<li>Etter faseseparasjon oppstår, overfør 500 μL av den øvre lipidholdige fasen til et forhåndsmerket 1,5 ml sikkerlås mikrosenterrør. Fjern resten av den øvre fasen. MERK: Vær forsiktig når du overfører, da denne øvre fasen har et høyt damptrykk og har en tendens til å lekke ut fra pipetten.</li>
		<li>Overfør 150 μL og 300 μL av de nedre polare og semi-polare metabolittholdige fasene i to 1,5 ml sikkerlås mikrocentrifugerør som brukes til henholdsvis GC-MS- og UHPLC-MS-analyse.</li>
		<li>Konsentrer alle ekstraherte fraksjoner ved å la løsningsmidlene fordampe uten oppvarming ved hjelp av en vakuumkonsentrator og lagre ved -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tørkede frø<ol>
<li>Forbered to 1,5 ml mikrosenterrør med sikker lås for hver prøve. Hold EM3 på is. Plasser en metallperle med en diameter på 5 mm i prøven aliquots.</li>
		<li>Tilsett 1 ml EM3 i hver 50 mg aliquot og homogeniser prøvene ved 25 Hz i 2-3 minutter før du legger dem på is.</li>
		<li>Soniker prøvene i et iskjølt sonikeringsbad i 10 min.</li>
		<li>Virvel prøvene kort før sentrifugering ved 11.200 × g i 5 min ved 4 °C.</li>
		<li>Overfør 150 μL og 300 μL av supernatanten i to 1,5 ml sikkerlås mikrosentrifugerør som brukes til henholdsvis GC-MS- og UHPLC-MS-analyse.</li>
		<li>Konsentrer alle ekstraherte fraksjoner ved å la løsningsmidlene fordampe uten oppvarming ved hjelp av en vakuumkonsentrator og oppbevar ved -80 °C. MERK: Basert på erfaring anbefales brukere å utføre trinn 4.2 for halvpolede metabolitter og avledede metabolittanalyser i tørkede frø. Utfør ekstraksjon trinn 4.1 for tørket frø lipid analyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Analyse av lipider ved bruk av UHPLC-MS
<ol><li>Re-suspendere de tørkede lipidfraksjonene i 250 μL acetonitril:2-propanol (7:3, vol/vol).</li>
	<li>Soniker lipidfasen i 5 min, sentrifuge ved 11.200 × g i 1 min.</li>
	<li>Overfør 90 μL av supernatanten til et hetteglass med glass for LC-MS.</li>
	<li>Injiser 2 μL av ekstraktene i LC-MS.</li>
	<li>Utfør lipidfraksjonering på en omvendt fase C8 søyle holdt ved 60 °C løping med en strøm på 400 μL/min med gradvise endringer av eluent A og B som vist i tabell 1. Skaff massespektraet i positiv iioniseringsmodus med et masseområde på 150-1500 m / z.</li>
	<li>Inkluder flere QC-prøver i alle daglige partier og et tomt felt for å sikre korreksjon for analytisk variasjon. Tilfeldiggjør prøver blokkmessig i sekvensiell rekkefølge.</li>
</ol>6. Analyse av polare og halvpolede metabolitter ved bruk av UHPLC-MS
<ol><li>Re-suspendere den tørkede polarfasen i 180 μL UHPLC-klasse metanol: vann (1:1 v/v).</li>
	<li>Soniker polarfasen i 2 min, sentrifuge ved 11.200 × g i 1 min.</li>
	<li>Overfør 90 μL av supernatanten til et hetteglass med glass for LC-MS.</li>
	<li>Injiser 3 μL av ekstraktene i LC-MS.</li>
	<li>Utfør metabolittfraksjonering på en omvendt fase C18 søyle holdt ved 40 °C som går med en strøm på 400 μL/min med gradvise endringer av eluent A og B som vist i tabell 1. Skaff massespektraet i et masseområde på 100-1500 m/z i en full MS-skanning og all ionfragmentering (AIF) indusert av høyenergikollisjonell dissosiasjon (HCD) på 40 keV. MERK: Bruk begge iioniseringsmodusene. På grunn av begrenset kapasitet mens du kjører et stort antall prøver, kjører du imidlertid testprøver i begge iioniseringsmodusene for å bestemme den foretrukne iioniseringsmodusen.</li>
	<li>Inkluder flere QC-prøver i alle daglige partier og et tomt felt for å sikre korreksjon for analytisk variasjon. Tilfeldiggjør prøver blokkmessig i sekvensiell rekkefølge.</li>
	<li>Kjør en samlet QC i dataavhengig MS2 i både negative og positive iioniseringsmoduser. Bruk det oppnådde massespektraet i et senere trinn (8.5) for merknad.</li>
</ol>7. Analyse av avledede metabolitter ved bruk av GC-MS17,18
MERK: Analysen av avledede metabolitter er basert på en tidligere beskrevet protokoll17. Håndter alle avledningsreagenser i avtrekkshetten. Påse at N-metyl-N-(trimetylsilyl)trifluoracetamid (MSTFA) ikke kommer i kontakt med vann og fuktighet.
<ol><li>Avledningsreagens 1 (DR1)<ol>
<li>Løs opp metoksyaminhydroklorid i pyrid for å oppnå en konsentrasjon på 30 mg/ml DR1. Bruk 40 μL DR1 for hver prøve. Forbered en lagerløsning i henhold til prøvestørrelsen, og lagre ved romtemperatur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Avledningsreagens 2 (DR2)<ol>
<li>Løs opp MSTFA med 20 μL fettsyremetylestere (FAMEs) per 1 ml MSTFA. Bruk 70 μL DR2 for hver prøve. Forbered en lagerløsning i henhold til prøvestørrelsen. Oppbevar MSTFA ved 4 °C og FAMEene ved -20 °C. MERK: FAMEs inkluderer metylcaprylat, metyl pelargonat, metylcaprate, metyllaurat, metylmyristat, metylpalmitat, metylstearate, metyleicosanoat, metyldofosanoat, lignocersyremetylester, metylhexacosanoat, metyloctakosanoat og triakontanoinsyremetylester, som oppløses i CHCl3 i en konsentrasjon på henholdsvis 0,8 μL/ml eller 0,4 mg/ml for flytende eller faste standarder.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tørk pelletsen på nytt fra polarfasen (lagret ved -80 °C) ved hjelp av en vakuumkonsentrator i 30 minutter for å unngå forstyrrelser av H2O som oppstår under lagringen med løsningsmidlene som brukes til nedstrøms avledning.</li>
	<li>Tilsett 40 μL DR1.</li>
	<li>Rist prøvene ved 950 × g i 2 timer ved 37 °C ved hjelp av en orbital shaker, etterfulgt av en kort spin-down av væsken.</li>
	<li>Tilsett 70 μL DR2.</li>
	<li>Rist igjen ved 950 × g i 30 min ved 37 °C ved hjelp av en orbital shaker.</li>
	<li>Sentrifuger kort ved romtemperatur før du overfører 90 μL til glassflasker for GC-MS-analyse.</li>
	<li>Injiser 1 μL i GC-MS splitless-modus, avhengig av metabolittkonsentrasjonene, med en konstant heliumbærergassstrøm på 2 ml / min. Injeksjonstemperaturen er satt til 230 °C ved hjelp av en 30 m MDN-35 kapillærkolonne. MERK: Tilleggsinformasjon, for eksempel temperaturgradient, finnes i tabell 1. Masseområdet er satt til 70-600 m/z med 20 skanninger/min. Inkluder delte moduser for å muliggjøre kvantifisering av putative overbelastningsforbindelser, noe som sparer kostnader og tid for ekstraktavledning i slike tilfeller.</li>
	<li>Inkluder flere QC-prøver i alle daglige partier og et tomt felt for å sikre korreksjon for analytisk variasjon. Tilfeldiggjør prøver riktig blokkmessig i sekvensiell rekkefølge.</li>
</ol>8. Chromatogram behandling og sammensatt merknad
<ol><li>Filtrer kjemisk støy ved å definere intensitetsterskler. Inkluder alle QC-prøver under behandling av kromatogrammer. MERK: For store data er støyfiltrering avgjørende for å redusere databehandlingstiden og prosessorkraften.</li>
	<li>Juster kromatogrammene ved å definere et tidsforskyvningsvindu for oppbevaring. Kontroller kromatogrammene fra hver batch for å vurdere intra- og interpartivariasjonen.</li>
	<li>Utfør toppregistrering avhengig av toppformen, for eksempel høyde og bredde for full bredde ved beregninger av halv maksimum (FWHM).</li>
	<li>Klyngeisotoper for å redusere overflødige signaler og filtrere ut singletons. MERK: Se materialfortegnelse for detaljer om programvare som brukes til kromatogrambehandling. Dyptgående protokoller om hvordan du behandler kromatogrammer ved hjelp av forskjellige fritt tilgjengelige programvareverktøy, for eksempel MS-DIAL, MetAlign, MzMine og Xcalibur 19,20,21, leveres.</li>
	<li>Bruk ddMS2-dataene i et samlet QC-utvalgseksempel for sammensatt merknad. Vurder den molekylære strukturen ved å bestemme den monoisotopiske massen og observere vanlige nøytrale tap, kjente ladede aglykoner og forskjellige typer spaltinger, for eksempel homolytisk eller heterolytisk16,22.</li>
	<li>For rapportering av metabolittdata, følg anbefalingen beskrevet i Fernie et al. 201123. MERK: Ulike beregningsmessige metabolomics tilnærminger kan brukes til å analysere metabolomics data 24,25,26.</li>
</ol>9. Normalisering av storskala metabolomics datasett
<ol><li>Kontroller fordelingen av de interne standardene og normaliser ved å korrigere for respons av enkle eller flere interne standarder.</li>
	<li>Korriger toppintensitetene oppnådd fra kromatogrammet over den nøyaktige prøvevekten ved å dele toppintensitetene med den alisiterte homogeniserte prøvevekten fra trinn 2.5.</li>
	<li>Riktig for intensitetsdrift på tvers av flerpartiserier. Utfør QC-baserte korrigeringsmetoder som lokalt estimert scatterplotutjevning (LOESS)27 ved hjelp av R. MERK: Flere verktøy og pakker er tilgjengelige for å adressere driften av MS-ytelsen under oppkjøpet av hele batchene28,29.</li>
	<li>Sikre normal fordeling av egenskaper ved datatransformasjon, for eksempel Box-Cox transformasjon30 ved hjelp av boxcox () -funksjonen fra R-pakken MASS for å utføre GWAS.</li>
	<li>Utføre dataskalering, for eksempel Pareto-skalering, for multivariat analyse for å sikre riktig veiing av lave rikelige forbindelser31. MERK: Hvis det er mulig, utfør en restitusjonsanalyse for å unngå matriseeffekter, for eksempel ionundertrykking14.</li>
</ol>10. Genom-brede assosiasjonsstudier (GWAS)32
<ol><li>Kall enkelt nukleotidpolymorfisme (SNP) eller strukturelle varianter (SV) fra sekvenseringsdataene33,34.</li>
	<li>Filtergenotypiske data for mindre allelfrekvens (MAF) < 5 % og manglende hastighet på >10 % for å unngå lavfrekvent skjevhet ved bruk av Dusk35.</li>
	<li>Beregn beste lineære objektive prediksjoner (BLUPer) for hver normaliserte funksjon over eksperimentelle repetisjoner for å eliminere skjevheter som stammer fra miljøfaktorer (tilfeldige effekter) ved hjelp av R-pakken Ime436.</li>
	<li>Bruk BLUPer for hver funksjon individuelt for å utføre GWAS ved hjelp av rMVP-pakken i R37. MERK: Hver metabolomikkfunksjon ses her som en individuell frittstående fenotype.</li>
	<li>Når du utfører GWAS, korrigere for populasjonsstruktur ved hjelp av hovedkomponentanalyse (PCA) og identitet etter tilstand (IBS) eller vanRaden for å minimere forvirrende effekter. Videre bør du vurdere å bruke en blandet lineær modell (MLM) eller en multi-locus blandet modell (MLMM), da blandede modeller inneholder faste og tilfeldige effekter.</li>
</ol>11. QTL-deteksjon
<ol><li>Sjekk SNPene som viser betydelig assosiasjon, og ta Manhattan-tomtene i betraktning, for linkage disequilibrium (LD) beregninger for å bestemme den underliggende genetiske regionen. Utfør LD-beregninger ved hjelp av R-pakkens LD-varmekart eller Dusk 5.</li>
	<li>Kontroller de tilknyttede SNPene for effektstørrelsen over egenskapen ved å undersøke trekknivåene for statistiske endringer mellom haplotyper for å finne potensielle årsakssammenhenger, for eksempel SNPer som fører til en aminosyreendring i proteinkodingssekvensen, noe som kan forklare fenotypisk variasjon. MERK: Siden SNP-trekkforeninger ikke nødvendigvis gir årsakssammenheng, er det avgjørende å bestemme den genomiske regionen. Sammensatt identitet ved funksjonsmerknad kan hjelpe enormt med å finne de riktige kandidatgenene i en bestemt genomisk region. Vi foreslår å kombinere alle oppdagede QTL forbundet med visse forbindelser i et pleiotropisk kart for å understreke de genetiske områdene38, som vist i figur 4. For validering av kandidatgener kan flere tilnærminger utføres (se diskusjonen).</li>
</ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter å erklære.

Både GC-MS og LC-MS er mye brukt verktøy for profilering av komplekse blandinger av ulike metabolittklasser. Håndtering av store datasett med disse verktøyene er iboende forbundet med en ikke-biologisk variasjon, for eksempel analytisk variasjon, som forstyrrer og fordommer tolkningen av resultatene. Denne protokollen presenterer en robust og høy-gjennomstrømning ekstraksjon rørledning for omfattende metabolsk profilering for å eliminere variasjon av ikke-biologisk opprinnelse og gjennomføre store "omics" studier. Volumene og konsentrasjonene som ble brukt i denne protokollen ble justert for belgfruktarter i forskjellige vev. Imidlertid kan disse parametrene også endres litt og brukes til store metabolske prøver fra andre plantearter.
De tidligere15 beskrevne MTBE-baserte ekstraksjonene kan brukes til å analysere avledede metabolitter, halvpolerte metabolitter og lipider. Dette kan utvides for protein- og plantehormonekstraksjoner39, som var utenfor omfanget av denne protokollen. Andre ekstraksjonsprotokoller er avhengige av dichloromethane:etanolblandinger40,41. Av disse ekstraksjonsprotokollene gir MTBE:metanolutvinningsprotokollen et gunstig og mindre farlig alternativ til de eksisterende kloroformbaserte ekstraksjonsprotokollene42 og resulterer ikke i en proteinpellet som en interfase mellom polar- og lipidfasene. Videre er MTBE-metoder allerede brukt i flere studier for ulike biologiske prøver 43,44,45.
Denne protokollen drøfter flere viktige trinn som kan føre til potensiell variasjon mens du håndterer et stort antall prøver, for eksempel under høsting av 12,13, ekstraksjon14, samt randomisering46. Videre er det flere problemer som ikke er diskutert i denne protokollen som må vurderes for å sikre metabolomiske data av høy kvalitet, for eksempel matriseeffekt og ionundertrykkelse14.
Kraften til QC-baserte normaliseringsmetoder avhenger iboende av antall QC-prøver i hver batch. Som nevnt tidligere, selv om økningen av antallet ville øke kraften, er den intrapartivariasjonen av QC-ene relativt marginal sammenlignet med variasjon mellom partiene i disse analysesystemene, som illustrert i figur 3. Totalt sett er det andre QC-baserte normaliseringsmetoder, for eksempel systemisk feilfjerning ved hjelp av tilfeldig skog (SERRF), som har vist seg å overgå de fleste av de andre normaliseringsmetodene som batch-wise-ratio, normalisering ved hjelp av et optimalt utvalg av flere interne standarder (NOMIS), og probabilistisk kvotient normalisering (PQN)47 . SERRF er imidlertid avhengig av flere QC-prøver i hver batch, for eksempel hver tiende prøve, noe som ikke er mulig under håndtering av et stort antall prøver. Den største fordelen med QC-basert normalisering i forhold til andre datadrevne eller interne standardbaserte metoder er at den beholder den essensielle biologiske variasjonen samtidig som den imøtekommer uønsket teknisk variasjon28. Leserne kan henvise til denne gjennomgangen om håndteringen av variant28.
Et hovedproblem i GWAS er frekvensen av falske positiver, som hovedsakelig stammer fra årsakssammenheng og ikke-årsakssammenhenger48,49. For det andre er de konservative statistiske korreksjonsmetodene, for eksempel Bonferroni og FDR, korrekte for antall uavhengige tester, som ikke er lik antall analyserte SNPer i GWAS på grunn av koblingen mellom proksimale SNPer50,51 Derfor er det faktiske antallet uavhengige tester ofte lavere. En annen måte å redusere den konservative statistiske terskelen på ville være å redusere antall testede SNPer som brukes for GWAS basert på koblingsforfall over definerte genomiske regioner52. DEN GWAS-integrerte metabolomics-plattformen med høy gjennomstrømning som er beskrevet i denne protokollen, har et bredt spekter av applikasjoner. Spesielt vil det lette forbedringer i avlingsavl ved å endre metabolitt / lipidsammensetningen for industrielt og ernæringsmessig ønskede nivåer. Totalt sett har metabolomics gitt en grundig innsikt i den genetiske arkitekturen til en mengde metabolitter og metabolsk diversifisering som skjedde under avlings domesticering de siste tiårene, noe som indikerer det enorme potensialet for metabolomics-assosiert avl53. De molekylære biologiske tilnærmingene for nedstrøms QTL-validering inkluderer genereringen av CRISPR / Cas9 mutantlinjer54, T-DNA-innsettingslinjer55, stabile og / eller forbigående overekspressionslinjer56, VIGS, ex vivo metabolomics nærmer seg57 ved siden av den konvensjonelle tilnærmingen i å generere kryss F2-populasjoner samt kryssvalidering i forskjellige populasjoner.
Ved å utføre den nødvendige korreksjonen for de analytiske variasjonene som beskrevet ovenfor, kan flere integrerte tilnærminger utføres i tillegg til GWAS, for eksempel metabolitt-metabolitt, metabolitt-lipid korrelasjonsanalyse, korrelasjonsanalyse til fenomiske data for å belyse mer komplekse egenskaper, og / eller samuttrykksanalyse for å ytterligere avdekke grunnlaget for biologiske systemer58.

Store "omics" tilnærminger har gjort det mulig å analysere komplekse biologiske systemer 1,2,3 og videre forståelse av sammenhengen mellom genotyper og de resulterende fenotypene4. Metabolomics ved hjelp av ultra-høy ytelse flytende kromatografi-masse spektrometri (UHPLC-MS) og GC-MS aktivert påvisning av en mengde metabolittiske funksjoner, hvorav bare noen er kommentert til en viss grad, noe som resulterer i en høy andel av ukjente metabolitter. Komplekse interaksjoner kan utforskes ved å kombinere storskala metabolomikk med den underliggende genotypiske variasjonen av en mangfoldig populasjon5. Håndtering av store prøvesett er imidlertid iboende forbundet med analytiske variasjoner, noe som forvrenger evalueringen av metabolsk varians for lenger nedstrømsprosesser. Spesielt er store problemstillinger som fører til analytiske variasjoner basert på maskinytelse og instrumentell drift over tid6. Integreringen av parti-til-parti-variasjon er utfordrende og spesielt problematisk ved analyse av store strukturerte plantepopulasjoner. Flere normaliseringsprosedyrer ble foreslått å korrigere for ikke-biologiske variasjoner, for eksempel bruk av interne, eksterne og isotopmerkede interne standarder for å korrigere for analytiske feil, hvorav hver er iboende forbundet med kjente problemer og fallgruver 7,8,9,10.
I tillegg til analytisk variasjon varierer valget av utvinningsprotokoller generelt avhengig av analysemetoden. Til syvende og sist er det ønskelig å redusere material- og arbeidskostnader, samt nødvendigheten av å bruke flere aliquots av samme prøve for ulike analytiske prosesser ved å utføre faseseparasjonsbaserte ekstraksjonsmetoder. Disse metodene ble først introdusert ved hjelp av kloroform: metanol / vannløsemidler for å fraksjonere polare og hydrofobe forbindelser11.
Denne protokollen beskriver en rask rørledning med høy gjennomstrømning for en multi-omics plattform for å profilere både polare metabolitter og lipider i belgfruktarter. Videre viser den hvordan disse datasettene kan korrigeres riktig for analytisk variasjon og normaliseres før de integrerer genotypisk informasjon for å oppdage metabolitt kvantitativ egenskap loci (QTL) ved å utføre GWAS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (17:0 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850360P</td>
			<td>Internal standard for lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>FAME solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovitexin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>38953-85-4</td>
			<td>Internal standard for metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lignoceric Acid Methylester</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2442-49-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13684102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyamin -hydrochlorid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>593-56-6</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl laurate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-82-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl myristate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>124-10-7</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl palmitate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-39-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl stearate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-61-8</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl tert-butyl ether (MTBE)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13890602</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-caprat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>110-42-9</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcaprylat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-11-5</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyldocosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>929-77-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyleicosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1120-28-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-hexacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5802-82-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-octacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>55682-92-3</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-pelargonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1731-84-6</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamid (MSTFA)</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>24589-78-4</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>110-86-1</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribitol</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>22566-17-2</td>
			<td>Internal standard for derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triacontanoic Acid Methyl Ester</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>629-83-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>23214102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius Corporation</td>
			<td>14 557 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-35ms, 30 m, 0,25 mm, 0,25 &#181;m</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>123-3832</td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC-MS system</td>
			<td>Leco Pegasus HT TOF-MS (LECO Corporation)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding Balls, Stainless Steel</td>
			<td>OPS DIAGNOSTICS</td>
			<td>GBSS 196-2500-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Q Exactive Focus (Q Exactive&#8482; Focus Hybrid Quadrupol-Orbitrap&#8482; 
			Massenspektrometer, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf, model 5427R</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.7 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002878</td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RP High Strength Silica (HSS) T3 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.8 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003539</td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf Thermomixer 5436</td>
			<td>2050-100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>USC 300 TH</td>
			<td>142-0084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinding mixer mill</td>
			<td>Retsch, Mixer Mill MM 300</td>
			<td>20.746.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC system</td>
			<td>Waters Acquity UPLC system (Waters)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators</td>
			<td>7.008.500.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Vortex-Genie 2, Model G560</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetAlign</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MzMine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;data.table&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;fujiplot&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pleiotrpoic map</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;genetics&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;Ime4&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BLUPs calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;LDheatmap&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>LD plots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;MASS&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;rMVP&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GWAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 4.0.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS Genedata</td>
			<td>Expressionist</td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>OPTON-30965</td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization

Både gasskromatografi-massespektrometri (GC-MS) og flytende kromatografi-massespektrometri (LC-MS) er mye brukt metabolomics tilnærminger for å oppdage og kvantifisere hundretusener av metabolittfunksjoner. Anvendelsen av disse teknikkene på et stort antall prøver er imidlertid gjenstand for mer komplekse interaksjoner, spesielt for genom-brede assosiasjonsstudier (GWAS). Denne protokollen beskriver en optimalisert metabolsk arbeidsflyt, som kombinerer en effektiv og rask prøvepreparering med analyse av et stort antall prøver for belgfrukter. Denne litt modifiserte ekstraksjonsmetoden ble opprinnelig utviklet for analyse av plante- og dyrevev og er basert på utvinning i metyl tert-butyl eter: metanolløsningsmiddel for å tillate fangst av polare og lipidmetabolitter. I tillegg gir vi en trinnvis veiledning for å redusere analytiske variasjoner, som er avgjørende for den høye gjennomstrømningsevalueringen av metabolsk varians i GWAS.

Vellykkede GWAS-eksperimenter med metabolomics bør begynne med en riktig eksperimentell design, etterfulgt av utvalgsinnsamling, ekstraksjon, datainnsamling og prosessering, som illustrert i figur 1. I denne protokollen ble MTBE-metoden15 brukt til å trekke ut og analysere hundrevis av metabolitter som tilhører flere sammensatte klasser. Kromatografi avhenger sterkt av egenskapene til den brukte kolonnen samt elutionbufferblandinger. Figur 2 viser kromatogrammer av QC-prøver, noe som indikerer elutionmønsteret til noen store lipidklasser i dette analytiske systemet. De påførte forløpningene for hver plattform er angitt i tabell 1. Det ble lagt stor vekt på håndtering av systemiske feil i store eksperimenter. Utføre storskala metabolomics er iboende forbundet med systemiske feil. For demonstrasjon analyserte vi lipidomiske data på tvers av flere vanlige bønnearter. Supplerende tabell 1 gir de ekstraherte rå lipidomiske dataene som er innhentet etter kromatogrambehandling ved hjelp av programvaren som er angitt i materialtabellen. Etter denne protokollen kunne vi omgå store problemer med å håndtere omics-data, spesielt når vi håndterer store eksempelsett. Normaliseringsprosedyren gir nøyaktig korreksjon av batchvise analytiske feil, som vist i figur 3. Selv om økning av antall QC-prøver vil øke normaliseringens kraft, er dette ikke alltid mulig på grunn av kostnads- og tidsbegrensninger. For høy-gjennomstrømning metabolomics GWAS med ikke-målrettede metabolske funksjoner, er det viktig å illustrere høyere antall trekk-markør assosiasjon hensiktsmessig. Et pleiotropisk kart38 som kombinerer flere GWAS-resultater, kan brukes til å fremheve de genomiske områdene som flere trekk er knyttet til (figur 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig01.jpg"> Figur 1: Flytskjema for metabolomikkbaserte GWAS i planter. Flere trinn som starter fra eksperimentell design opp til påvisning av QTL vises i venstre panel. I høyre panel vises flere figurer for å støtte flere trinn som er nevnt i venstre panel. Fra høyre topp vises (1) en foreslått sekvens av prøver for LC-MS, (2) pre- og post-normaliserte scoreplott av PCA, inkludert en representativ funksjonsdistribusjon før- og etterbehandling, med rød som indikerer QC-prøveintensiteter, og (3) et Manhattan-plott med betydelige assosiasjoner som LD- og haplotypedistribusjoner ble generert til. Forkortelser: GWAS = genom-brede assosiasjonsstudier; QTL = kvantitativ egenskap loci; PCA = hovedkomponentanalyse; QC = kvalitetskontroll; LD = linkage disequilibrium; MS = massespektrometri; LC-MS = flytende kromatografi-massespektrometri; GC-MS = gasskromatografi-massespektrometri; LOESS = lokalt estimert scatterplot utjevning; MLM/MLMM = blandet lineær modell/multi-locus blandet modell. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig02.jpg"> Figur 2: Behandling av kromatogram. To QC-kromatogrammer (basistopp, lipiddata) fra forskjellige grupper demonstrerer den batchvise variasjonen for visse lipidklasser i de samlede QC-prøvene. Fire store lipidklasser er indikert med sine respektive elutionvinduer i det interne LC-MS-systemet. Kromatogrammene ble eksportert fra MzMine21. Forkortelser: QC = kvalitetskontroll; LC-MS = flytende kromatografi-massespektrometri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig03.jpg"> Figur 3: Retting av systematisk feil. Hovedkomponentanalyse av innhentede lipidomiske data, pre- (venstre, rådata) og postkorrigering for systemiske feil (høyre, batch loess). De nedre panelene illustrerer funksjonsfordelingen (Cluster_00005) over prøvene (n=650) og partiene (n=10) pre- (venstre) og postkorrigering (høyre) for analytisk variasjon. Forkortelser: PCA = hovedkomponentanalyse; QC = kvalitetskontroll; LOESS = lokalt estimert spredningsutjevning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig04.jpg"> Figur 4: Pleiotropisk kart som illustrerer de kombinerte GWAS-resultatene. Det pleiotrope kartet fremhever regioner i hele genomet som er forbundet med flere egenskaper. Tallene på de ytre ringene indikerer de tilsvarende kromosomene. Hver circlet representerer et individuelt trekk med sine betydelig tilknyttede SNPer. Fargene representerer forskjellige sammensatte klasser (grå = sammensatt klasse 1; grønn = sammensatt klasse 2; lilla = sammensatt klasse 3; gul = sammensatt klasse 4). Når det gjelder inter-sammensatte klasseforeninger med samme genomiske region, fremheves gener. Den indre grå sirkelen viser summen av alle signifikante SNPer knyttet til en bestemt genomisk posisjon. Tilknytningene som vises i denne figuren, genereres kunstig bare for illustrasjon. Forkortelser: GWAS = genom-brede assosiasjonsstudier; SNPer = polymorfismer med ett nukleotid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="5">UHPLC-MS-innstillinger for lipider</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tid [min]</td>
			<td>Eluent A til B [%]*</td>
			<td colspan="3">Informasjon</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>45 % A</td>
			<td colspan="3">Eluent A: 1% 1M NH 4-Acetat, 0,1% eddiksyre i vann (UHPLC-klasse)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 4.00</td>
			<td>lg 45% - 25% A</td>
			<td colspan="3">Eluent B: 1% 1M NH 4-acetat, 0,1% eddiksyre i acetonitril/2-propanol 7:3 (UHPLC-klasse)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4.00 - 12.00</td>
			<td>lg 25% - 11% A</td>
			<td colspan="3">
Strømningshastighet: 400 μL/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>12.00 - 15.00</td>
			<td>lg 11% - 0% A</td>
			<td colspan="3">
Injeksjonsvolum: 2 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 19.50</td>
			<td>cw 0 % A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.50-19.51</td>
			<td>0 % - 45 % A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.51-24.00</td>
			<td>eq 45 %</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">UHPLC-MS/MS-innstillinger for polare og halvpolede metabolitter</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tid [min]</td>
			<td>Eluent A og B [%]*</td>
			<td colspan="3">Informasjon</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>99 % A</td>
			<td colspan="3">Eluent A: 0,1% maursyre i vann (UHPLC-klasse)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 11.00</td>
			<td>lg 99% -60% A</td>
			<td colspan="3">Eluent B: 0,1 % maursyre i acetonitril (UHPLC-grad)</td>
		</tr>
<tr>
<td>11.00 - 13.00</td>
			<td>lg 60% - 30% A</td>
			<td colspan="3">
Strømningshastighet: 400 μL/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>13.00 - 15.00</td>
			<td>lg 30% - 1% A</td>
			<td colspan="3">
Injeksjonsvolum: 3 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 16.00</td>
			<td>cw 1 % A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>16.00 - 17.00</td>
			<td>lg 1% - 99% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>17.00 - 20.00</td>
			<td>eq 99 % A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">GC-MS-innstillinger for avledede metabolitter</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tid [min]</td>
			<td>Temperatur [°C]</td>
			<td colspan="3">Informasjon</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 2.00</td>
			<td>85</td>
			<td colspan="3">
Gass til bærebølgen: Helium</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.00 - 18.66</td>
			<td>lg 80 - 330</td>
			<td colspan="3">
Strømningshastighet: 2 ml/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>18.66 - 24.66</td>
			<td>cw 330</td>
			<td colspan="3">
Temperaturgradient: 15 °C/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>24.66</td>
			<td>rask kjøling</td>
			<td colspan="3">
Injeksjonsvolum: 1 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Graderingsinnstillinger for hver av de analytiske plattformene7. Forkortelser: lg = lineær gradient; cw = kolonnevask; eq = likevekt; UHPLC-MS = ultra-høy ytelse flytende kromatografi-masse spektrometri; UHPLC-MS/MS = ultra-høy ytelse flytende kromatografi-tandem masse spektrometri; GC-MS = gasskromatografi-massespektrometri. * = prosentverdien tilsvarer eluent A; gjenværende prosentverdi tilsvarer eluent B.
Supplerende tabell 1: Rå lipidomiske data. Angir toppintensitetene for hver av de oppdagede sektorgruppene over hvert utvalg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/Supplementary%20Table%201%20.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization at JoVE.com

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

I denne protokollen presenterer vi en optimalisert arbeidsflyt, som kombinerer en effektiv og rask prøvepreparering av mange prøver. I tillegg gir vi en trinnvis veiledning for å redusere analytiske variasjoner for evaluering av høy gjennomstrømning av metabolske GWAS-studier.

Store multiomikk Genom-brede foreningsstudier (Mo-GWAS): Retningslinjer for prøveforberedelse og normalisering

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

Å undersøke større befolkning kommer med en maskindrevet variasjon, som med dette den faktiske variasjonen stammer fra naturmangfold. Her demonstrerer vi en metode for å redusere den tekniske variasjonen for nedstrøms integrasjonsanalyse. Fordelene ved denne teknikken inkluderer en ansiktsseparasjonsbasert ekstraksjon, som gir analyse av ulike metabolitter på den respektive analytiske plattformen, samtidig som den systemiske feilen fjernes og den biologiske variansen opprettholdes.Når den genotypiske og fenotypiske informasjonen er oppnådd, kan denne metoden brukes på enhver mangfoldig naturlig befolkning i ethvert rike i livet. For å begynne å ta 20 milliliter høsting rør, legg til to fem millimeter, og to åtte millimeter diameter metallperler for homogenisering og merke rørene. Fyll deretter opp en dewar med flytende nitrogen, umiddelbart etter kutting av høsting av ferskt blad og rotvevsprøver i flytende nitrogen ved flashfrysing.Oppbevar de høstede biologiske prøvene ved 80 grader celsius for videre bearbeiding. Forkjøl rørholderne i flytende nitrogen. Deretter slip vevet ved 25 hertz i ett minutt for å få et homogent pulver.Gjenta frysing, og slip hvis vevet ikke er homogent malt. Vei 50 milligram ferskt plantemateriale i en forhåndskjølt merket to millimeter sikker låsmikrosenterrør som sikrer at plantematerialet forblir frosset under veieprosessen. Tilsett en milliliter ferdigkjølt ekstraksjonsblanding 1 til 50 milligram aliquot av prøven, og virvel røret kort før du holder på is.Inkuber prøvene på en orbital shaker ved 800 ganger G i 10 minutter ved fire grader celsius, etterfulgt av sonikering i et iskjølt sonikeringsbad i 10 minutter. Bruk en flerkanals pipette for å legge til 500 mikroliter ekstraksjonsblanding også til prøvene og bland ekstraktene ved kort virveling, og sentrifuger blandingen ved 11 200 ganger G i 5 minutter ved fire grader celsius. Etter sentrifugering, overfør 500 mikroliter av den separerte øvre lipidholdige fasen til en forhåndsmerket 1,5 milliliter sikker lås mikrocentrifuge rør, fjernet resten av den øvre fasen.Separat overfører 1,5 milliliter sikre låsemikrosenterrør 150 mikroliter av nedre halvpolfase fire GCMS og 300 mikroliter av halvpolet fase fire U-H-P-L-C MS-analyse. Bruk en vakuumkonsentrator for fordampning av løsningsmiddel for å konsentrere alle ekstraherte fraksjoner uten oppvarming og lagre de tørkede fraksjonene ved 20 grader celsius. For å forberede prøven for ultrahøy ytelse, væskekromatografi, massespektrometri eller H-P-L-C MS, re-suspendere de tørkede halvpolede fraksjonene i 180 mikroliter av en blanding av metanol og vann.Deretter sonikerer du den halvpolede fasen i 2 minutter, etterfulgt av sentrifugering ved 11 200 ganger G i ett minutt. Etter sentrifugering overfører du 90 mikroliter av supernatanten til et hetteglass i glass og injiserer to mikroliter av ekstraktene i LCMS-prøven som helles. Utfør metabolittfraksjoneringen på en omvendt fase C18-kolonne holdt ved 40 grader celsius, og en strøm på 400 mikroliter per minutt med gradvise endringer av avløpsmiddel A og B, skaffe massespektraet til testen blanke og kvalitetskontrollprøver i negativ iioniseringsmodus med et masseområde på 102 1500 masse til ladeforhold.For de halvpolede metabolittprøvene, kjør en samlet QC-prøve i dataavhengig tandemmassespektrometri i negative og positive iioniseringsmoduser. Bruk det oppnådde massespektraet for merknaden. Utfør normaliseringen av datasettet ved å kontrollere fordelingen av den interne standarden.Normaliser dataene ved å korrigere for signalet fra enkle eller flere interne standarder. Deretter korrigerer du toppintensitetene oppnådd fra kromatogrammet over den nøyaktige prøvevekten. For å korrigere intensitetsdriften på tvers av flerpartiserier, utfør QC-baserte korreksjonsmetoder som lokalt estimert scatterplotutjevning ved hjelp av R.Before utføre genom-brede assosiasjonsstudier eller GWAS, filtrer genotypiske data for mindre allelefrekvenser mindre enn 5%og en manglende hastighet på mer enn 10% ved hjelp av dusk.Dette vil unngå lavfrekvente skjevheter. For å eliminere skjevheten som stammer fra miljøfaktorene, bruk R-pakken LME fire og beregn de beste lineære, objektive spådommene eller blops for hver normaliserte funksjon over eksperimentelle repetisjoner. Bruk blops av hver funksjon individuelt for å utføre GWAS med rMVP-pakken i R.Lipidomiske data på tvers av flere vanlige bønnearter er vist basert på rå base topp kromatogrammer av to QC prøver fra forskjellige partier.En variasjon i signalintensitetene ble observert for visse lipidklasser. Den systemiske feilen var tydeligere da hovedkomponentanalysen ble utført på rådataene. Normaliseringsprosedyren, inkludert den lokalt estimerte scatterplot-utjevningen, førte til klynge av QC-prøvene.Ved dissekering i de enkelte klyngene ble maskindrevne feil i batch syv og åtte tydelige før normalisering, som ble korrigert. Innlegget normaliserte og transformerte individuelle metabolomiske klynger ble brukt til GWAS, noe som ga flere trekkmarkørforeninger. I den representative analysen fremheves forskjellige sammensatte klasser i forskjellige farger, mens markørene forbundet med flere sammensatte klasser er indikert med nærmeste gen.Datanormalisering og transformasjon er et av de viktigste trinnene. Kontroller at riktig korrigering er utført for å korrigere for systemfeil, og sikre normalitet i fordelingen. Ved å utføre korreksjonen for den analytiske variasjonen kan flere integrasjonsmetoder utføres, for eksempel metabolsk korrelasjonsanalyse og integrasjon i fenomiske data for å belyse komplekse egenskaper.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Eksempel forberedelse til masse massespektrometri-baserte identifikasjon av RNA-bindende områder

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genomet hele kvantifisering av oversettelse i spirende gjær av ribosom profilering

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-baserte stor skala dyrking av Caenorhabditis elegans: Sample forberedelse for studiet av metabolske forandringer i Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Prøve forberedelse til sonde elektrospray ionisering massespektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Label-fri Immunutfelling masse massespektrometri arbeidsflyt for stor skala kjernefysisk Interactome profilering

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Prøve forberedelse for proteomics facility innsending og påfølgende dataanalyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En prøveforberedelsesrørledning for mikrokrystaller ved VMXm-strålelinjen

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Klargjøring av høytemperatur prøvegitter for Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Prøvepreparering og relativ kvantrasjon ved bruk av reduktiv metylering av aminer for peptidomikkstudier

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Prøvepreparering ved hjelp av en Lipid Monolayer-metode for elektronkrystallografiske studier

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...