Name: large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization
Uploaded: 2021-07-27T15:00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization at JoVE.com

O M.B. é apoiado pelo IMPRS-PMPG 'Metabolismo Primário e Crescimento Vegetal'. A A.R.F. e a S.A. reconhecem o apoio financeiro do Programa de Pesquisa e Inovação da EU Horizon 2020, do projeto PlantaSYST (SGA-CSA No. 739582 sob o FPA nº 664620) e do projeto INCREASE (GA 862862).

Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

Tanto o GC-MS quanto o LC-MS são ferramentas amplamente utilizadas para traçar misturas complexas de várias classes metabólicas. O manuseio de grandes conjuntos de dados com essas ferramentas está inerentemente associado a uma variação não biológica, por exemplo, variação analítica, que interfere e viese a interpretação dos resultados. Este protocolo apresenta um robusto e de alto rendimento de extração de gasodutos de extração para perfis metabólicos abrangentes para eliminar a variação de origem não biológica e realizar estudos de "omics" em larga escala. Os volumes e concentrações utilizados neste protocolo foram ajustados para espécies de leguminosas em diferentes tecidos. No entanto, esses parâmetros podem ser ligeiramente modificados e usados para amostras metabólicas em larga escala de outras espécies vegetais também.
As15 extrações descritas anteriormente baseadas em MTBE podem ser usadas para analisar metabólitos derivatizados, metabólitos semipolares e lipídios. Isso pode ser expandido para extrações de proteínas e hormônios vegetais39, que estavam fora do escopo deste protocolo. Outros protocolos de extração dependem de diclorometano: misturas de etanol40,41. Desses protocolos de extração, o protocolo de extração de metanol MTBE:fornece uma alternativa favorável e menos perigosa aos protocolos de extração baseados em clorofórmioexistentes 42 e não resulta em uma pelota de proteína como uma interfase entre as fases polar e lipídica. Além disso, os métodos MTBE já foram utilizados em diversos estudos para diversas amostras biológicas 43,44,45.
Este protocolo discute várias etapas cruciais que podem levar a uma potencial variação ao manusear um grande número de amostras, por exemplo, durante a colheitade 12,13, extração14, bem como randomização46. Além disso, há questões adicionais que não foram discutidas neste protocolo que devem ser consideradas para garantir dados metabolômicos de alta qualidade, por exemplo, efeito matricial e supressão deíons 14.
O poder dos métodos de normalização baseados em QC depende inerentemente do número de amostras de QC em cada lote. Como mencionado anteriormente, embora o aumento do número aumente a potência, a variação intra-lote dos QCs é relativamente marginal em comparação com a variação entre lotes nesses sistemas analíticos, como ilustrado na Figura 3. No geral, existem outros métodos de normalização baseados em QC, como a remoção de erros sistêmicos usando a floresta aleatória (SERRF), que têm sido mostrados para superar a maioria dos outros métodos de normalização, como a relação em lote-wise, a normalização usando uma seleção ideal de vários padrões internos (NOMIS) e a normalização probabilística (PQN)47 . No entanto, a SERRF conta com várias amostras de QC em cada lote, por exemplo, cada décima amostra, o que não é viável durante o manuseio de um grande número de amostras. A principal vantagem da normalização baseada em QC em relação a outros métodos baseados em padrões baseados em dados ou internos é que ela retém a variação biológica essencial, ao mesmo tempo em que acomoda a variação técnica indesejada28. Os leitores podem consultar esta revisão sobre o manuseio da variação28.
Uma questão principal no GWAS é a taxa de falsos positivos, que se originam principalmente devido à ligação de sítios causais e não causais 48,49. Em segundo lugar, as abordagens conservadoras de correção estatística, por exemplo, Bonferroni e FDR, corrijam para o número de testes independentes, o que não é igual ao número de SNPs testados no GWAS devido à ligação entre os SNPspróximos 50,51 Portanto, o número real de testes independentes é muitas vezes menor. Outra forma de reduzir o limiar estatístico conservador seria reduzir o número de SNPs testados usados para GWAS com base na decadência de ligação sobre as regiões genômicasdefinidas 52. A plataforma de metabolômica de alto rendimento integrada pela GWAS descrita neste protocolo tem uma ampla gama de aplicações. Em particular, facilitará melhorias na criação de culturas, alterando a composição metabólito/lipída para níveis industrial e nutricionalmente desejados. No geral, a metabolômica forneceu uma visão aprofundada da arquitetura genética de uma infinidade de metabólitos e diversificação metabólica que ocorreu durante a domesticação das culturas nas últimas décadas, indicando o vasto potencial de reprodução associada à metabolômica53. As abordagens biológicas moleculares para validação de QTL a jusante incluem a geração de linhas mutantes CRISPR/Cas954, linhas de inserção T-DNA55, linhas de superexpressão estável e/ou transitória56, VIGS, ex vivo metabolômica se aproxima57 ao lado da abordagem convencional na geração de populações transversais F2, bem como validação cruzada em diferentes populações.
Ao realizar a correção necessária para as variações analíticas descritas acima, várias abordagens integradas podem ser realizadas além do GWAS, como metabólito-metabólito, análise de correlação metabólica-lipídica, análise de correlação com dados fenomicos para esclarecer traços mais complexos e/ou análise de co-expressão para desvendar ainda mais a base dos sistemas biológicos58.

Abordagens "omics" em larga escala permitiram a análise de sistemas biológicos complexos 1,2,3 e maior compreensão da ligação entre genótipos e os fenótipos4 resultantes. Metabolômica usando espectrometria de massa líquida de alto desempenho (UHPLC-MS) e GC-MS permitiu a detecção de uma infinidade de características metabólicas, das quais apenas algumas estão anotadas em um certo grau, resultando em uma alta proporção de metabólitos desconhecidos. Interações complexas podem ser exploradas combinando metabolômicas em larga escala com a variação genotipica subjacente de uma população diversificada5. No entanto, o manuseio de grandes conjuntos amostrais está inerentemente associado a variações analíticas, distorcendo a avaliação da variância metabólica para outros processos a jusante. Especificamente, as principais questões que levam a variações analíticas são baseadas no desempenho da máquina e na deriva instrumental ao longo do tempo6. A integração da variação em lote a lote é desafiadora e especialmente problemática ao analisar populações estruturadas de plantas em larga escala. Foram sugeridos múltiplos procedimentos de normalização para corrigir para variações não biológicas, por exemplo, o uso de normas internas, externas e isótopos rotuladas para corrigir erros analíticos, dos quais cada um está inerentemente associado a problemas e armadilhas conhecidos 7,8,9,10.
Além da variação analítica, a escolha dos protocolos de extração geralmente varia dependendo do método analítico. Em última análise, deseja-se reduzir os custos materiais e trabalhistas, bem como a necessidade de utilizar várias alíquotas da mesma amostra para vários processos analíticos, realizando métodos de extração baseados em separação de fases. Estes métodos foram introduzidos pela primeira vez usando clorofórmio: solventes de metanol/água para fracionar compostos polares e hidrofóbicos11.
Este protocolo descreve um rápido pipeline de alto rendimento para uma plataforma multi-omics para traçar o perfil tanto metabólitos polares quanto lipídios em espécies de leguminosas. Além disso, mostra como esses conjuntos de dados podem ser adequadamente corrigidos para variação analítica e normalizados antes de integrar informações genotípicas para detectar loci de traço quantitativo metabólico (QTL) realizando GWAS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (17:0 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850360P</td>
			<td>Internal standard for lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>FAME solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovitexin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>38953-85-4</td>
			<td>Internal standard for metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lignoceric Acid Methylester</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2442-49-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13684102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyamin -hydrochlorid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>593-56-6</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl laurate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-82-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl myristate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>124-10-7</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl palmitate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-39-0</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl stearate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112-61-8</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl tert-butyl ether (MTBE)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13890602</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-caprat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>110-42-9</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcaprylat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>111-11-5</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyldocosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>929-77-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyleicosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1120-28-1</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-hexacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5802-82-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-octacosanoat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>55682-92-3</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-pelargonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1731-84-6</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamid (MSTFA)</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>24589-78-4</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>110-86-1</td>
			<td>Metabolite deriviatization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribitol</td>
			<td>Supleco</td>
			<td>22566-17-2</td>
			<td>Internal standard for derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triacontanoic Acid Methyl Ester</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>629-83-4</td>
			<td>FAME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>23214102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius Corporation</td>
			<td>14 557 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-35ms, 30 m, 0,25 mm, 0,25 &#181;m</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>123-3832</td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC-MS system</td>
			<td>Leco Pegasus HT TOF-MS (LECO Corporation)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of derivatized metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding Balls, Stainless Steel</td>
			<td>OPS DIAGNOSTICS</td>
			<td>GBSS 196-2500-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS system</td>
			<td>Q Exactive Focus (Q Exactive&#8482; Focus Hybrid Quadrupol-Orbitrap&#8482; 
			Massenspektrometer, Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf, model 5427R</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.7 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002878</td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RP High Strength Silica (HSS) T3 column 
			(100 mm &#215; 2.1 mm containing 1.8 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003539</td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf Thermomixer 5436</td>
			<td>2050-100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>USC 300 TH</td>
			<td>142-0084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinding mixer mill</td>
			<td>Retsch, Mixer Mill MM 300</td>
			<td>20.746.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC system</td>
			<td>Waters Acquity UPLC system (Waters)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators</td>
			<td>7.008.500.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Vortex-Genie 2, Model G560</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetAlign</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MzMine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;data.table&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;fujiplot&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pleiotrpoic map</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;genetics&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;Ime4&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BLUPs calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;LDheatmap&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>LD plots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;MASS&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R package &#34;rMVP&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GWAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 4.0.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RefinerMS Genedata</td>
			<td>Expressionist</td>
			<td></td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tassel 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>OPTON-30965</td>
			<td>Chromatogram processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale multi-omics genome-wide association studies (mo-gwas): guidelines for sample preparation and normalization

Tanto a espectrometria de massa da cromatografia gasosa -masstrometria (GC-MS) quanto a espectrometria de massa cromatografia líquida (LC-MS) são abordagens metabolômicas amplamente utilizadas para detectar e quantificar centenas de milhares de características metabólicas. No entanto, a aplicação dessas técnicas a um grande número de amostras está sujeita a interações mais complexas, particularmente para estudos de associação genoma (GWAS). Este protocolo descreve um fluxo de trabalho metabólico otimizado, que combina uma preparação eficiente e rápida da amostra com a análise de um grande número de amostras para espécies de culturas de leguminosas. Este método de extração ligeiramente modificado foi inicialmente desenvolvido para a análise de tecidos vegetais e animais e é baseado na extração em éter de tert-butil metil: solvente de metanol para permitir a captura de metabólitos polares e lipídicos. Além disso, fornecemos um guia passo-a-passo para a redução das variações analíticas, essenciais para a avaliação de alto rendimento da variância metabólica no GWAS.

Os experimentos de metabolomia bem-sucedidas do GWAS devem começar com um design experimental adequado, seguido pela coleta de amostras, extração, aquisição de dados e processamento, conforme ilustrado na Figura 1. Neste protocolo, o método MTBE15 foi utilizado para extrair e analisar centenas de metabólitos pertencentes a diversas classes compostas. A cromatografia depende muito das propriedades da coluna utilizada, bem como das misturas de tampão de eluição. A Figura 2 mostra cromatógramas de amostras de QC, indicando o padrão de eluição de algumas classes lipídicas importantes neste sistema analítico. Os gradientes aplicados para cada plataforma são dados na Tabela 1. Foi dada forte ênfase no tratamento de erros sistêmicos em experimentos em larga escala. A realização de metabolômicas em larga escala está inerentemente associada a erros sistêmicos. Para demonstração, analisamos dados lipidómicos em várias espécies comuns de feijão. A Tabela Suplementar 1 fornece os dados lipidômicos brutos extraídos obtidos após o processamento do croromatograma utilizando o software indicado na Tabela de Materiais. Seguir este protocolo nos permitiu contornar grandes questões no tratamento de dados omics, especialmente durante o manuseio de grandes conjuntos de amostras. O procedimento de normalização rende na correção precisa dos erros analíticos em lote, conforme demonstrado na Figura 3. Embora o aumento do número de amostras de QC aumente o poder da normalização, isso nem sempre é viável devido às restrições de custo e tempo. Para a metabolômica de alta produtividade GWAS com características metabólicas não direcionadas, é essencial ilustrar um número maior de associação de marcadores de características adequadamente. Um mapa pleiotrópico38 combinando múltiplos resultados de GWAS poderia ser usado para destacar as regiões genômicas às quais vários traços estão ligados (Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig01.jpg"> Figura 1: Fluxograma do GWAS baseado em metabolômica em plantas. Várias etapas que partem do projeto experimental até a detecção de QTL são mostradas no painel esquerdo. No painel direito, várias figuras são mostradas para suportar várias etapas mencionadas no painel esquerdo. A partir do topo direito, (1) uma sequência sugerida de amostras é mostrada para LC-MS, (2) parcelas de pontuação pré e pós-normalizadas de PCA, incluindo uma distribuição de recursos representativos pré e pós-processamento, com intensidades de amostra QC indicando vermelho e (3) um lote de Manhattan com associações significativas às quais foram geradas distribuições de LD e haplotipos. Abreviaturas: GWAS = estudos de associação genoma;; QTL = traço quantitativo loci; PCA = análise de componentes principais; QC = controle de qualidade; LD = desequilíbrio de ligação; MS = espectrometria de massa; LC-MS = espectrometria de massa cromatografia líquida; GC-MS = espectrometria de massa cromatografia gasosa; LOESS = alisamento de dispersão localizado localmente; MLM/MLMM = modelo linear misto/modelo misto multi-lócus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig02.jpg"> Figura 2: Processamento de cromatograma. Dois cromatógramas QC (pico base; dados lipídes) de diferentes lotes demonstram a variação em lote para certas classes lipídicas nas amostras de QC agrupadas. Quatro classes lipídicas principais são indicadas com suas respectivas janelas de elução no sistema interno LC-MS. Os cromatogramas foram exportados de MzMine21. Abreviaturas: QC = controle de qualidade; LC-MS = espectrometria de massa cromatografia líquida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig03.jpg"> Figura 3: Correção de erro sistemático. Análise componente principal dos dados lipidómicos adquiridos, pré-(dados brutos esquerdos) e pós-correção para erros sistêmicos (à direita, loess em lote). Os painéis inferiores ilustram a distribuição do recurso (Cluster_00005) sobre as amostras (n=650) e os lotes (n=10) pré-(esquerda) e pós (direita)-correção para variação analítica. Abreviaturas: PCA = análise de componentes principais; QC = controle de qualidade; LOESS = esteleia de dispersão estimada localmente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig04.jpg"> Figura 4: Mapa pleiotrópico ilustrando os resultados combinados do GWAS. O mapa pleiotrópico destaca regiões de todo o genoma que estão associadas a vários traços. Os números nos anéis externos indicam os cromossomos correspondentes. Cada círculo representa um traço individual com seus SNPs significativamente associados. As cores representam diferentes classes compostas (cinza = composto classe 1; verde = composto classe 2; roxo = classe composta 3; amarelo = composto classe 4). No caso de associações intera compostas de classe com a mesma região genômica, destacam-se os genes. O círculo cinzento interno mostra a soma de todos os SNPs significativos associados a uma posição genômica específica. As associações mostradas nesta figura são geradas artificialmente apenas para ilustração. Abreviaturas: GWAS = estudos de associação genoma;; SNPs = polimorfismos de nucleotídeos únicos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="5">Configurações UHPLC-MS para lipídios</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo [min]</td>
			<td>Eluente A a B [%]*</td>
			<td colspan="3">Informação</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>45% A</td>
			<td colspan="3">Eluent A: 1% 1M NH 4-Acetato, 0,1% ácido acético na água (grau UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 4.00</td>
			<td>lg 45% - 25% A</td>
			<td colspan="3">Eluente B: 1% 1M NH 4-Acetato, 0,1% ácido acético em acetonitrilo/2-propanol 7:3 (grau UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4.00 - 12.00</td>
			<td>lg 25% - 11% A</td>
			<td colspan="3">
Taxa de fluxo: 400 μL/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>12.00 - 15.00</td>
			<td>lg 11% - 0% A</td>
			<td colspan="3">
Volume de injeção: 2 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 19.50</td>
			<td>cw 0% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.50-19.51</td>
			<td>0% - 45% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.51-24.00</td>
			<td>eq 45%</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">Configurações UHPLC-MS/MS para metabólitos polares e semipolares</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo [min]</td>
			<td>Eluente A e B [%]*</td>
			<td colspan="3">Informação</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>99% A</td>
			<td colspan="3">Eluente A: 0,1% de ácido fórmico na água (grau UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 11.00</td>
			<td>lg 99% -60% A</td>
			<td colspan="3">Eluente B: 0,1% de ácido fórmico em acetonitrilo (grau UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>11.00 - 13.00</td>
			<td>lg 60% - 30% A</td>
			<td colspan="3">
Taxa de fluxo: 400 μL/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>13.00 - 15.00</td>
			<td>lg 30% - 1% A</td>
			<td colspan="3">
Volume de injeção: 3 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 16.00</td>
			<td>cw 1% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>16.00 - 17.00</td>
			<td>lg 1% - 99% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>17.00 - 20.00</td>
			<td>eq 99% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">Configurações GC-MS para metabólitos derivatizados</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo [min]</td>
			<td>Temperatura [°C]</td>
			<td colspan="3">Informação</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 2.00</td>
			<td>85</td>
			<td colspan="3">
Gás transportador: Hélio</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.00 - 18.66</td>
			<td>LG 80 - 330</td>
			<td colspan="3">
Taxa de fluxo: 2 mL/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>18.66 - 24.66</td>
			<td>cw 330</td>
			<td colspan="3">
Gradiente de temperatura: 15 °C/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>24.66</td>
			<td>resfriamento rápido</td>
			<td colspan="3">
Volume de injeção: 1 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Configurações de gradiente para cada uma das plataformas analíticas7. Abreviaturas: lg = gradiente linear; cw = lavagem de coluna; eq = equilíbrio; UHPLC-MS = espectrometria de massa líquida de alto desempenho; UHPLC-MS/MS = espectrometria de massa de cromatografia líquida de alto desempenho; GC-MS = espectrometria de massa cromatografia gasosa. * = valor percentual corresponde ao eluente A; o valor percentual restante corresponde ao eluente B.
Tabela Suplementar 1: Dados lipidómicos crus. Indica as intensidades máximas para cada um dos aglomerados detectados sobre cada amostra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/Supplementary%20Table%201%20.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>

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Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Neste protocolo, apresentamos um fluxo de trabalho otimizado, que combina uma preparação eficiente e rápida de amostras de muitas amostras. Além disso, fornecemos um guia passo-a-passo para reduzir as variações analíticas para avaliação de alto rendimento de estudos metabólicos de GWAS.

Estudos de associação multi-omics em larga escala (Mo-GWAS): Diretrizes para preparação e normalização de amostras

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

Investigar população maior vem com uma variação orientada por máquinas, que por isso a variação real originária da diversidade natural. Aqui demonstramos um método para reduzir a variação técnica para análise de integração a jusante. As vantagens dessa técnica incluem uma extração baseada em separação facial, fornecendo a análise de vários metabólitos na respectiva plataforma analítica, removendo o erro sistêmico e mantendo a variância biológica.Uma vez que as informações genotípicas e fenotípicas são obtidas, este método pode ser aplicado a qualquer população natural diversificada em qualquer reino da vida. Para começar, pegue tubos de colheita de 20 mililitros, adicione dois cinco milímetros e duas contas metálicas de oito milímetros de diâmetro para homogeneizar e rotular os tubos. Em seguida, encha uma de guerra com nitrogênio líquido, imediatamente após cortar amostras de folhas frescas e tecido raiz em nitrogênio líquido por congelamento relâmpago.Armazene as amostras biológicas colhidas a 80 graus celsius para posterior processamento. Pré-esfrie os suportes do tubo em nitrogênio líquido. Em seguida, triture os tecidos a 25 hertz por um minuto para obter um pó homogêneo.Repita o congelamento e a moagem se o tecido não estiver homogêneo. Pese 50 miligramas de material vegetal fresco em um pré-refrigerado rotulado dois milímetros de tubos de microcentrifus de bloqueio seguro, garantindo que o material vegetal permaneça congelado durante o processo de pesagem. Adicione um mililitro de mistura de extração pré-resfriada de 1 a 50 miligramas aliquot da amostra, e vórtice do tubo brevemente antes de manter no gelo.Incubar as amostras em um agitador orbital a 800 vezes G por 10 minutos a quatro graus celsius, seguido de sônica em um banho de sônica resfriado por gelo por 10 minutos. Use uma pipeta multicanal para adicionar 500 microliters de mistura de extração também às amostras e misturar os extratos por um breve vórtice, depois centrifugar a mistura a 11.200 vezes G por 5 minutos a quatro graus celsius. Após a centrifugação, transfira 500 microlitres da fase superior separada contendo lipídios para um tubo de microcentrifuge de bloqueio seguro de 1,5 mililitro pré-rotulado, removendo o resto da fase superior.Em tubos de microcentrifus de bloqueio seguro separados de 1,5 mililitros transferem 150 microliters da fase semi-polar inferior quatro GCMS e 300 microliters da fase semi-polar quatro análises U-H-P-L-C MS. Use um concentrador de vácuo para evaporação de solventes para concentrar todas as frações extraídas sem aquecimento e armazenar as frações secas a 20 graus celsius. Para preparar a amostra para cromatografia líquida de desempenho ultra-alto, espectrometria de massa, ou H-P-L-C MS suspender as frações semipolarizadas secas em 180 microliters de uma mistura de metanol e água.Em seguida, sonicar a fase semi-polar por 2 minutos, seguido de centrifugação a 11.200 vezes G por um minuto. Após a centrifugação, transfira 90 microlitres do supernatante para um frasco de vidro e injete dois microliters dos extratos na amostra LCMS derramada. Realize o fracionamento metabólico em uma coluna de Fase C18 invertida mantida a 40 graus celsius, e um fluxo de 400 microliters por minuto com mudanças graduais de efluente A e B, adquira o espectro de massa das amostras de teste em branco e controle de qualidade em modo de ionização negativa com uma faixa de massa de 102 1500 massas para a razão de carga.Para as amostras de metabólitos semipolares, execute uma amostra de QC agrupada em espectrometria de massa tandem dependente de dados em modos de ionização negativa e positiva. Use o espectro de massa obtido para a anotação. Realize a normalização dos dados definidos verificando a distribuição do padrão interno.Normalize os dados corrigindo o sinal de padrões internos únicos ou múltiplos. Em seguida, corrija as intensidades máximas obtidas do cromatograma sobre o peso exato da amostra. Para corrigir a deriva de intensidade em séries multimacículas, execute métodos de correção baseados em QC, como a suavização de dispersão localmente estimada usando R.Antes de realizar estudos de associação genoma-em todo o genoma ou GWAS, filtrar os dados genotípicos para pequenas frequências de alelo inferior a 5% e uma taxa de falta de mais de 10% usando tassel.Isso evitará viés de baixa frequência. Para eliminar o viés originário dos fatores ambientais, utilize o pacote R LME quatro e calcule as melhores previsões lineares e imparcial ou blops para cada característica normalizada sobre as repetições experimentais. Use blops de cada recurso individualmente para executar GWAS com o pacote rMVP em R.Os dados lipidómicos em várias espécies comuns de feijão são mostrados com base nos cromogramas de pico de base bruta de duas amostras de QC de diferentes lotes.Observou-se variação nas intensidades do sinal para determinadas classes lipídicas. O erro sistêmico ficou mais evidente quando a análise dos componentes principais foi realizada nos dados brutos. O procedimento de normalização, incluindo a suavização de dispersão localmente estimada, levou ao agrupamento das amostras de QC.Ao dissecar nos clusters individuais, os erros orientados por máquina no lote sete e oito ficaram claros antes da normalização, que foi corrigida. Os clusters metabolômicos individuais pós-normalizados e transformados foram utilizados para GWAS, rendendo em várias associações de marcadores de características. Na análise representativa, diferentes classes compostas são destacadas em cores diferentes, enquanto os marcadores associados a múltiplas classes compostas são indicados com seu gene mais próximo.A normalização e transformação dos dados são um dos passos mais importantes. Certifique-se de que a correção adequada tenha sido realizada para corrigir erros sistêmicos e garantir a normalidade na distribuição. Ao realizar a correção para a variação analítica, podem ser realizadas diversas abordagens de integração, como análise de correlação metabólica e integração em dados fenômicos para esclarecer traços complexos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Bioquímica

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Quantificação de todo o genoma de tradução no fermento Budding pelo Ribossoma perfilamento

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Baseados na placa de cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans: preparação da amostra para o estudo de alterações metabólicas em Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Preparação de amostras para espectrometria de ionização de eletrospray de sonda

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Fluxo de trabalho de espectrometria de massa de imunoprecipitação sem rótulos para perfis de interactom nuclear em larga escala

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Preparação da amostra TMT para envio de instalações proteômicas e análise de dados subsequentes

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Um pipeline de preparação de amostras para microcristais na linha de feixe VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Preparação de grades de amostras de alta temperatura para crio-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Preparação da Amostra e Quantitação Relativa usando Metilação Redutiva de Aminas para Estudos de Peptidômica

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Preparação da amostra usando um método de monocamadas lipídica para estudos cristalográficos eletrônicos

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...